Förlust- och Gain-of-funktionsansatsen att undersöka tidiga Cell Fate bestämmelse i preimplantatorisk musembryon
Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en förlust- och förstärkningsfunktionsmetod som är tillämplig för att identifiera neogenin som en scen-specifik receptor som leder till trophectoderm och inre cellmassan differentiering i embryon preimplantatorisk mus.
Abstract
Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.
Introduction
Preimplantatorisk embryonal utveckling kan delas in i flera olika etapper, från en-cellstadiet till morula och blastocyst. Mycket bevis tyder på att polariteten och positionella signaler spela en roll i tidig determinering in trophectoderm (TE) och den inre cellmassan (ICM). Dock arten av de signaler, hur de är omvandlade till cellulära signaler, och de fysiologiska sammanhang där sådana signaler är i stånd att initiera cellhärstamning differentiering är inte kända. Dessa differentierade celler genomgå sedan specialisering, börjar ta på karakteristiska strukturer och funktioner som behövs för embryo korrekt bildning och tillväxt av moderkakan 1-3.
Preimplantatorisk embryon är särskilt mottagliga för manipulation genom direkt injektion av modifierade genetiskt material som siRNA eller mål-cDNA och därför kan användas för att studera specifika målmolekyler. Det finns en växande insikt om att genetiskanalys av ryggradsdjur embryon är avgörande för att öka kunskaperna om embryonal utveckling 4. Exakt införande av en vildtyp-gen eller en muterad form i ett embryo i tid sammanhang att åstadkomma GAIN- eller förlust-av-funktion av genen har i hög grad underlättat studier av utvecklingsmässigt reglerade gener. Förlust- och få-av-funktion via mikroinjektion av genetiskt material till individuella tidiga icke-däggdjur och däggdjurs embryon är relativt enkelt på grund av sin storlek och stor mottaglighet 5. Mikroinjektion utförs typiskt med användning av icke-virala vektorer. Särskild fördel har tagits av den enkla att använda icke-virala vektorer över virala vektorer och transgener. En snabb förlust eller vinst-of-funktionsuttryck systemet musembryon har utvecklats som gör det möjligt för oss att dissekera och förstå genfunktioner i ryggradsdjur embryologi 6,7.
Fluorescensmärkning av embryon skulle i hög grad underlätta valet av microinjected eller genetiskt manipulerade embryon och samtidigt ge ett medel för att indirekt kvantifiera uttrycksnivån för mikroinjiceras siRNA eller cDNA baserat på fluorescensintensitet 8. För att åstadkomma detta märkning, fluorescerande protein cDNA, GFP eller RFP, samar injiceras som antingen fusionskonstruktioner eller separat. Fluorescensintensiteten hos GFP eller RFP avslöjar graden av uttryck av siRNA eller främmande DNA för att säkerställa att förlust- eller vinna-of-funktion har uppnåtts.
Här presenterar vi en mikromanipulation protokoll för förlust och vinst-of-funktion teknik som tillät oss att identifiera neogenin som en receptor som förmedlar extracellulära signaler viktiga i början av celldifferentiering i embryon preimplantatorisk mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nuvarande protokollet visar vi nya metoder för mikroinjektion av genetiskt material, antingen cDNA eller shRNA, i embryona 2-PN musen för att utforska den roll neogenin i början av celldifferentiering under mus embryogenes. Genetisk modifiering av preimplantatorisk embryon är en kraftfull teknik i att avslöja viktig information om bakomliggande molekylära mekanismer för, till exempel, den första cellen härstamning bestämningen. Genmodifiering är en av de vanligaste metoderna för att fastställa genfunk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill också tacka för Dr Xiong grupp vid Georgia Health Sciences University för att tillverka och dela konstruktioner för neogenin cDNA och shRNA vektorer. Denna studie har finansierats med bidrag från grund Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) finansieras av den koreanska Research Foundation och ett forskningsanslag från Sahmyook University.
Materials
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral olie | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| MicroInjector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfoge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
