Summary

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

Published: June 06, 2016
doi:

Summary

Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.

Abstract

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

Introduction

Pre-implantasyon embriyonik gelişim morula ve blastosist tek hücreli aşamasından, birçok farklı aşamaları ayrılabilir. Çok kanıt polarite ve pozisyon ipuçları ilkel trofoblast (TE) ve iç hücre kütlesinden (ICM) içine erken hücre kaderi belirlenmesinde rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, selüler sinyallere dönüştürülebilen nasıl ipuçları, doğası ve fizyolojik içerikleri burada bu sinyaller bilinmemektedir hücre soyu farklılaşmasını başlatma yeteneğine sahiptirler. Bu farklılaşmış hücreler daha sonra plasenta 1-3 embriyo oluşumu ve büyümesi için gerekli olan karakteristik yapıları ve fonksiyonları üzerine almaya başlayan, uzmanlaşma uğrarlar.

Pre-implantasyon embriyoları siRNA veya hedef cDNA gibi modifike edilmiş genetik malzemenin doğrudan doğruya enjekte edilerek manipülasyon için özellikle uygundurlar ve bu nedenle belirli bir hedef molekülleri okumak için kullanılabilir. Genetik dair artan bir anlayış vardıromurgalı embriyolarının analizi embriyonik gelişim 4 anlayışımızı ilerleyen için kritik öneme sahiptir. zamanında bağlamında bir embriyo, bir vahşi tip gen veya mutant formunda hassas bir giriş gain- veya zarar fonksiyon-geninin büyük gelişimsel olarak düzenlenen genlerin çalışma kolaylaştırmıştır gerçekleştirmek için. Kaybı: ve kazanç fonksiyon-bağımsız erken memeli olmayan ve memeli embriyolara genetik materyallerin mikro-enjeksiyon için büyük boyutları ve büyük reseptivite 5 oldukça basittir. Mikroenjeksiyon tipik olarak viral vektörler kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikli bir avantaj olarak, viral vektörler ve transgenlerin fazla viral olmayan vektörler kullanılarak kolaylığı alınmıştır. Fare embriyoları bir hızlı kaybı: ya kazanç fonksiyon-sentezleme sistemi bize incelemek ve omurgalı embriyoloji 6,7 gen fonksiyonlarını anlamak için izin veren geliştirilmiştir.

embriyoların floresan etiketleme büyük ölçüde MICR seçimini kolaylaştıracakoinjected veya genetik embriyolar manipüle ve aynı zamanda dolaylı olarak floresan yoğunluğu 8 göre mikro-enjekte siRNA veya cDNA ekspresyon seviyesini belirlemek için bir yöntem verin. Bu etiketleme, floresan protein cDNA, GFP veya RFP gerçekleştirmek için, birlikte enjekte füzyon konstruktları ya da ayrı ayrı ya da gibidir. GFP veya RFP floresans yoğunluğu bu kaybı: temin ya kazanç fonksiyon-başarılmıştır için siRNA veya yabancı DNA'nın sentezlenmesi kapsamını ortaya koymaktadır.

Burada, bize preimplantasyon fare embriyoları erken hücre farklılaşmasında önemli hücre dışı ipuçlarını ileten bir reseptör olarak neogenin tanımlamak için izin kaybı: ve kazanç-of fonksiyon tekniği için bir mikromanipülasyon protokol mevcut.

Protocol

NOT: Hayvan ıslahı ve bakımları için tüm prosedürler Sahmyook Üniversitesi, Seul, G. Kore IACUC düzenlemelerine göre yapılmıştır. 1. Süperovulasyon, Islahı ve Ovidukt İzolasyon aşağıdaki koşullar altında inbred C57BL / 6 fareleri bakımı: 22 ± 3 ° C, ~% 60 nem, 12 st ışık / karanlık çevrimi ve su ve gıda ad libitum verilmiştir. 0.1 mL, 5 İÜ gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) intraperitoneal enjeksiyonu ile 3-5 haftalık dişi farelerin superovulasyon Uy…

Representative Results

Biz o neogenin geçici olarak erken 2-hücreli aşamada olduğu gibi ve kalıcı erken morula kadar görünen ama geç morula ve blastosist aşamaları (Şekil 2A) de eksik olma, preimplantasyon fare embriyoları erken gelişim aşamalarında ifade edilir keşfetti. Buna ek olarak, neogenin uzamsal dağılımı esas olarak dış hücrelerine sınırlandırılmıştır. RT-PCR analizi sonuçlarını 4-hücre aşamasında zirve ama tamamen sonra (Şekil 2b)</strong…

Discussion

Mevcut protokol, fare embriyogenez sırasında erken hücre farklılaşmasında neogenin rolünü araştırmak için 2-PN fare embriyoları içine genetik materyallerin mikroenjeksiyon yeni yöntemler, cDNA veya shRNA ya göstermektedir. preimplantasyon embriyoların genetik modifikasyon, örneğin altında yatan moleküler mekanizmaları, ilk hücre soyu belirlenmesi hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarmada güçlü bir tekniktir. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en sık kullanılan yönte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ayrıca imalat ve cDNA ve shRNA vektörler neogenin için yapıları paylaşımı için Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi'nden Dr. Xiong'un grubu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Kore Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A4A01012572) hibe yoluyla ve Sahmyook Üniversitesi'nden bir araştırma hibe ile desteklenmiştir.

Materials

M16 medium, Gibco BRL (Grand Island, NY) M7292 LOT# 11A832
Goat serum,  Dako (Glostrup, Denmark) X0907
PMSG Folligon, Intervet, Holland G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral olie Sigma Aldrich CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin  (Intervet, Holland) (invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase lifetechnologies 18080-044
PCR pre mixture  (Bioneer, Daejon, S. Korea) GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade) BioRad 161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix USA 19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody Santa Cruz Biotechnology, US SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody Molecular Probes (Invitrogen, USA) A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin Molecular Probes (Invitrogen, USA) A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen, USA D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin R&D systems 3720-RG
all plasmid constructs  Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). the present studies were kindly provided by 
Neon®  Transfection System lifetech MPK10096
Stereo Microscrope Nikon SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon Nikon Narishige ONM-1
MicroInjector Nikon Narishige GASTIGHT #1750
Holder Nikon Narishige Narishige IM 16
Microfoge Nikon Narishige Narishige MF-900
grinder Narishige EG400
Puller Sutter Instrumnet company P-97
CO2 incubator Thermo Scientific Forma EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler  lifetechnologies 4388444

References

  1. Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
  2. Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
  3. Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
  4. Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
  5. Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
  6. Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
  7. Khang, I., Sonn, S., Park, J. -. H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
  8. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
  9. Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
  10. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  11. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).

Play Video

Cite This Article
Lee, J. H., Cho, Y. I., Choi, S. S., Kim, H., Min, C. K., Lee, S. J. Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (112), e53696, doi:10.3791/53696 (2016).

View Video