चूहा cortical न्यूरॉन्स में filamentous actin (एफ actin) puncta की मात्रा
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamentous actin प्रोटीन (एफ actin) spinogenesis, synaptic plasticity, और synaptic स्थिरता में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। वृक्ष के समान एफ actin अमीर संरचनाओं में परिवर्तन अन्तर्ग्रथनी अखंडता और कनेक्टिविटी में परिवर्तन का सुझाव है। यहाँ हम एफ actin puncta, और बाद में मात्रा का ठहराव तकनीक के लिए प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स, Phalloidin धुंधला संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सबसे पहले, E18 चूहा भ्रूण के ललाट प्रांतस्था, कम घनत्व सेल संस्कृति में अलग कर रहे हैं तो कम से कम 12-14 दिनों के लिए इन विट्रो में उगाया न्यूरॉन्स। और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (वृक्ष के समान एफ actin puncta लेबल करने के लिए) प्रयोगात्मक उपचार के बाद, cortical न्यूरॉन्स AlexaFluor 488 Phalloidin साथ दाग रहे हैं (MAP2; neuronal कोशिकाओं और वृक्ष के समान अखंडता को मान्य करने के लिए)। अंत में, विशेष सॉफ्टवेयर का विश्लेषण और बेतरतीब ढंग से चुनी न्यूरोनल डेन्ड्राइट यों इस्तेमाल किया जाता है। एफ actin अमीर संरचनाओं दूसरा आदेश वृक्ष के समान शाखाओं (लंबाई सीमा 25-75 & पर पहचाने जाते हैं# 181; निरंतर MAP2 immunofluorescence के साथ मीटर)। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक उपचार के बाद के वृक्ष के समान अन्तर्ग्रथन संरचनाओं में परिवर्तन की जांच के लिए एक उपयोगी तरीका होगा।
Introduction
इस अध्ययन का प्राथमिक लक्ष्य न्यूरोनल वृक्ष के समान नेटवर्क के synaptic अखंडता की माप (अनुमान) का एक विश्वसनीय विधि विकसित करने का है। यहाँ हम प्राथमिक चूहे सुसंस्कृत Phalloidin धुंधला और immunocytochemical (आईसीसी) के विशेष (एनआईएस-तत्वों) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बाद के विश्लेषण के साथ डेन्ड्राइट का पता लगाने के संयोजन का उपयोग न्यूरॉन्स में एफ actin puncta की मात्रा का ठहराव का वर्णन है।
लेबल phallotoxins दोनों बड़े और छोटे तंतु (एफ actin) के लिए इसी तरह की समानता है, लेकिन कुछ actin एंटीबॉडी 1 विपरीत monomeric गोलाकार actin (जी actin) करने के लिए बाध्य नहीं है। अविशिष्ट Phalloidin के बंधन इस प्रकार सेलुलर इमेजिंग के दौरान कम से कम पृष्ठभूमि प्रदान करने, नगण्य है। Phalloidin एंटीबॉडी कि आम तौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, जो Phalloidin द्वारा एफ actin की बहुत अधिक तीव्र लेबलिंग के लिए अनुमति देता है के लिए सेलुलर प्रोटीन लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की तुलना में काफी छोटा होता है। इस प्रकार, न्यूरॉन्स में एफ actin स्थानीयकरण के विस्तृत चित्र हो सकता हैलेबल Phalloidin के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की।
Phalloidin (एफ actin) न्यूरोनल dendrites के धुंधला असतत 'हॉट स्पॉट' या तेज "puncta", जो परिपक्व कांटा, गैर काँटेदार synapses 2 और अपरिपक्व कांटा सहित वृक्ष के समान संरचनाओं की एक किस्म का प्रतिनिधित्व उत्पन्न करता है। अपरिपक्व कांटा पतली filopodia और पैच आकृति विज्ञान के कुछ रूपों में शामिल हैं, और spinogenesis 3 की दीक्षा का प्रतिनिधित्व कर सकते। अपरिपक्व कांटा और गैर-काँटेदार पैच PSD95 4 की कमी है। , एफ actin न केवल कांटा में बाद में परिवर्तन लेकिन यह भी अतिरिक्त वृक्ष के समान संरचनाओं के लिए नेतृत्व के उत्पादन में परिवर्तन इस प्रकार Phalloidin synaptodendritic अखंडता 5-7 की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है। सामान्य तौर पर, Phalloidin पॉजिटिव (एफ actin) puncta की संख्या सक्रिय synapses के बीच एक संतुलन (उत्तेजक और निरोधात्मक), actin गतिशीलता और अन्तर्ग्रथन स्थिरता 8 दर्शाते हैं।
हालांकि यह विशेष टी अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैsynapses (यानी, उत्तेजक कांटा) के ypes, जब एक उपचार का लक्ष्य अज्ञात है यह पहली वृक्ष के समान संरचनाओं की एक किस्म के सामान्य अखंडता अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है। चूंकि एफ actin वृक्ष के समान कांटा और निरोधात्मक synapses, एफ actin puncta का बदला हुआ संख्या एक synaptopathy का संकेत हो सकता सहित अन्य संरचनाओं की एक प्रमुख घटक है। इस synaptopathy तो और अधिक विशिष्ट परिवर्तन के लिए आगे की जांच की जा सकती है। कई synaptic प्रकार / संरचनाओं का पता लगाने के लिए हमारी मात्रा का ठहराव विधि वृक्ष के समान synaptic परिवर्तन (बढ़ जाती है और कम हो जाती है) विभिन्न प्रयोगात्मक उपचार के बाद की एक समग्र अनुमान अर्जित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन में कम घनत्व जो हमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की dendrites की पहचान करने की अनुमति देता है पर चूहा cortical न्यूरॉन्स संवर्धन का वर्णन है। अगला, हम वृक्ष के समान परिवर्तन का ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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