الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
الخيطية بروتين الأكتين (F-الأكتين) يلعب دورا رئيسيا في spinogenesis، اللدونة متشابك، والاستقرار متشابك. تغييرات في الهياكل الغنية شجيري-F الأكتين تشير التعديلات في سلامة متشابك والاتصال. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لزراعة الفئران الأساسي العصبونات القشرية، تلطيخ Phalloidin للنقاط وF-أكتين، وتقنيات القياس الكمي لاحقة. أولا، وفصل القشرة الأمامية من أجنة الفئران E18 في زراعة الخلايا منخفض الكثافة، ثم الخلايا العصبية المزروعة في المختبر ل12-14 يوما على الأقل. بعد العلاج التجريبية، هي ملطخة الخلايا العصبية القشرية مع AlexaFluor 488 Phalloidin (لتسمية نقاط وF-أكتين شجيري) والمرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2، للتحقق من صحة الخلايا العصبية وسلامة شجيري). وأخيرا، يتم استخدام برنامج خاص لتحليل وتحديد التشعبات العصبية تم اختيارها عشوائيا. F-الأكتين هياكل الغنية التي تم تحديدها في الدرجة الثانية الفروع الشجيرية (مدى طول 25-75 و# 181؛ م) مع المناعي MAP2 المستمر. فإن بروتوكول المعروضة هنا تكون وسيلة مفيدة لتحقيق تغييرات في هياكل المشبك الجذعية لاحقة لعلاجات تجريبية.
Introduction
الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس (تقدير) من سلامة متشابك من شبكة الجذعية العصبية. نحن هنا وصف الكمي من نقاط وF-أكتين في الخلايا العصبية مثقف الفئران الأساسي باستخدام مزيج من تلطيخ Phalloidin وكشف immunocytochemical (ICC) من التشعبات مع تحليل لاحقة باستخدام (NIS-عناصر) البرمجيات المتخصصة.
phallotoxins المسمى يكون تقارب مماثلة لخيوط الكبيرة والصغيرة (F-الأكتين) ولكن لا ربط أحادى الأكتين كروية (G-الأكتين)، خلافا لبعض الأجسام المضادة الأكتين 1. غير محددة ملزمة من Phalloidin لا يكاد يذكر، وبالتالي توفير الحد الأدنى من الخلفية أثناء التصوير الخلوي. Phalloidin هو أصغر بكثير من الأجسام المضادة التي من شأنها عادة أن تستخدم لتسمية البروتينات الخلوية للفحص المجهري الفلورسنت، والذي يسمح لوضع العلامات أكثر كثافة بكثير من F-الأكتين من قبل Phalloidin. وهكذا، صورا تفصيلية للتوطين F-الأكتين في الخلايا العصبية يمكن أن يكونالحصول عليها من خلال استخدام Phalloidin المسمى.
Phalloidin (F-الأكتين) تلطيخ من التشعبات العصبية يولد "النقاط الساخنة" منفصلة أو مشرق "نقاط و"، التي تمثل مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية، بما في ذلك العمود الفقري ناضجة، نقاط الاشتباك العصبي غير شائك 2 والعمود الفقري غير ناضجة. وتشمل العمود الفقري غير ناضجة أرجل كاذبة خيطية رفيعة وبعض أشكال التصحيح التشكل، وربما تمثل بدء spinogenesis 3. العمود الفقري غير ناضجة وبقع غير شائك تفتقر PSD95 4. التغيرات في إنتاج الرصاص F-الأكتين لتغييرات لاحقة في العمود الفقري فحسب، بل أيضا الهياكل شجيري إضافية، مما يجعل Phalloidin أداة هامة لتحقيق سلامة synaptodendritic 5-7. بشكل عام، عدد Phalloidin إيجابية (F-الأكتين) نقاط وتعكس التوازن بين نقاط الاشتباك العصبي نشطة (مثير والمثبطة)، وديناميات الأكتين والاستقرار المشبك 8.
على الرغم من أنه من المهم دراسة ر محددةypes من نقاط الاشتباك العصبي (أي العمود الفقري مثير)، عندما يكون الهدف من العلاج هو معروف فإنه من الضروري تقدير أولا سلامة العامة من مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية. منذ F-الأكتين عنصرا رئيسيا في العمود الفقري شجيري وغيرها من الهياكل، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي المثبطة، عدد غيرت من نقاط وF-أكتين قد تشير إلى وجود synaptopathy. ويمكن بعد ذلك مزيد من التحقيق في هذا synaptopathy لإجراء تعديلات أكثر تحديدا. لدينا طريقة القياس الكمي للكشف عن عدة متشابك أنواع / الهياكل غلة تقدير عام للتغييرات متشابك شجيري (الزيادة والنقصان) في أعقاب العديد من العلاجات التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وصفنا زراعة الفئران الخلايا العصبية القشرية في منخفض الكثافة في أطباق الزجاج السفلي 35 مم والتي تسمح لنا لتحديد التشعبات من الخلايا العصبية الفردية. التالي، ونحن نستخدم Phalloidin وتلطيخ MAP2 للكشف عن تغيرات الجذعية. ثم، استخدمنا برنامج خاص لقياس التغير?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
- Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
- Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
- Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
- Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
- Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
- Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
- Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
- Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
