Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

وظيفية تحليل التكملة (FCA): ممارسة مختبر تصميم وتنفيذ المكمل لتدريس الكيمياء الحيوية مسارات

Published: June 24, 2016 doi: 10.3791/53850
Automatic Translation
1, 1, 1
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

Summary

التحقق من صحة الأنشطة الإنزيمية تشارك في المسارات البيوكيميائية ويمكن توضيح ذلك باستخدام التحليل تكامل وظيفي (FCA). وصفها في هذه المخطوطة هي فحص FCA مما يدل على النشاط الأنزيمي من الأنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، استجابة صارمة البكتيرية والحيوي ببتيدوغليكان البكتيرية.

Abstract

وظيفية تكامل فحص (FCA) هو فحص في الجسم الحي الذي يستخدم على نطاق واسع لإلقاء الضوء على وظيفة / دور الجينات / الانزيمات. هذا الأسلوب هو أمر شائع جدا في الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة والعديد من التخصصات الأخرى. لمحة شاملة عن تقنية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية المتعلقة الأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان ويقال الاستجابة الصارمة البكتيرية في هذه المخطوطة. ويسلط الضوء على اثنين من cDNAs من المصنع نموذج thaliana كائن نبات الأرابيدوبسيس التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي لليسين (L، L-diaminopimelate الألانين (dapL) والألانين التيروزين (tyrB) تشارك في عملية التمثيل الغذائي للالتيروزين والفينيل ألانين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ببتيدوغليكان البكتيرية يتم تمييز مسار المنشطة من خلال تحليل -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) الجين UDP- N من البكتيريا Verrucomicrobium الشائكة التي ينطوي عليها الصليب-linking من ببتيدوغليكان. وذكر أن استجابة صارمة البكتيرية أيضا من خلال تحليل آر إس إتش (ص العلا / ق وعاء ح omolog) الجين bifunctional مسؤولة عن النمط الظاهري شديدة مخاطي في س بكتيريا Novosphingobium. يتم عرض أربعة أمثلة من الهيئة الاتحادية للجمارك. وسوف يركز الفيديو على ثلاثة منها، وهي ليسين، ببتيدوغليكان واستجابة صرامة.

Introduction

ويعرف تكامل وظيفي في سياق توضيح وظيفة (ق) / دور (ق) من الجين كما قدرة مثلي معين أو الجينات orthologous لاستعادة متحولة خاص مع النمط الظاهري ملاحظتها للدولة من النوع البري عندما مثلي أو هو عرض الجينات orthologous في رابطة الدول المستقلة أو العابرة في الخلفية متحولة. وقد استخدم على نطاق واسع هذه التقنية لعزل والتعرف على وظيفة (ق) / دور (ق) من العديد من الجينات. أحد الأمثلة على ذلك هو العزلة وتحديد كربوكسيل orotidine-5-الفوسفات من المبيضات البيض باستخدام متحولة ura3 س الخباز ومتحولة pyrF من E. القولونية. 1 وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لتوضيح وظيفة الجينات التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان واستجابة الصارمة في برامجها البحثية وأدرجت هذه التقنية ضمن برامجها التعليمية في بiotechnology والبرامج في معهد روتشستر للتكنولوجيا (RIT) العلوم البيولوجية الجزيئية (بي إم بي).

الكتاب تعلم أساسيات الكيمياء الحيوية النباتية / علم الأمراض (FPBP) (هدسون) وBioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) (هدسون / Savka)، وهما العلوي قسم المختبر انتخابي يستند دورات في برنامج BMB في جامعة روتشستر للتكنولوجيا. منذ تنتسب بعض الموضوعات التي تمت مناقشتها في هذه الدورات مع اهتماماتهم البحثية، وأدرجت في الكتاب العديد من التقنيات والأدوات التجريبية التي يتم استخدامها في برامجها البحثية المعنية في هذه الدورات المختبري اثنين. أحد الأمثلة على ذلك هو تكامل وظيفي كعملية مختبر لتعزيز مواد المحاضرات المتعلقة الأمينية التمثيل الغذائي للأحماض من النباتات، ببتيدوغليكان والتمثيل الغذائي ردا صارما من البكتيريا.

ثلاثة مسارات الأحماض الأمينية من النباتات التي تمت مناقشتها في FPBB بالطبع هي أن من ليسين (الزنبق)، التيروزين(صور) والفينيل ألانين (PHE). ومن أبرز مسار اليس في سياق بسبب أهمية من الأحماض الأمينية مثل حمض أميني أساسي لجميع الحيوانات وخاصة البشر منذ الحيوانات تفتقر إلى آلية وراثية لتجميع ليز دي نوفو. بالإضافة إلى ذلك، تم اكتشاف مؤخرا أن النباتات تستخدم مسارا لتركيب الزنبق التي تختلف بشكل كبير عن تلك البكتيريا. وقد سهل هذا الاكتشاف جزئيا تكامل وظيفي للE. القولونية diaminopimelate (DAP) المسوخ باستخدام الجينة التي تكود إنزيم L، L-diaminopimelate الألانين (DapL) من thaliana مصنع نموذج نبات الأرابيدوبسيس. 2 يتم عرض مسارات البديل لتركيب اليس من خلال diaminopimelate سيطة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك ، تركيب ليز يسهل من خلال الأسرة اسبارتاتي مشتقة من الأحماض الأمينية التي تنظم للغاية. 3 بالإضافة إلى أهميتها في synt البروتينhesis، ويسلط الضوء على إعطاء مسارات للصور وPHE أهميتها في خدمة كمركبات تمهيدا لتحريض استقلاب المركبات فينيل تشارك تجميع المركبات الدفاع النباتية مثل: قلويدات، يغنينس، الفلافونويد، isoflavonoids، حمض hydroxycinnamic وغيرها (4) صور وأبرز مسارات PHE أيضا لإظهار الفرق بين المصنع ومسارات المنشطة البكتيرية. في البكتيريا، وتشارك الألانين انزيم التيروزين (TyrB) في تحريض استقلاب كل من الأحماض الأمينية، في حين أنه في النباتات، الانزيم هو في المقام الأول تشارك في هدم من صور وPHE وغير متورطة في تحريض استقلاب من هذه الأحماض الأمينية. (الشكل 2). 4

ويسلط الضوء على الاختلافات بين موجبة الجرام والجرام البكتيريا سلبية فيما يتعلق بهيكل ببتيدوغليكان (PG) في سياق FPBP. وPG من البكتيريا سالبة الجرام هو من مصلحة بخصوص أمراض النبات استنادا إلى حقيقة أن معظممسببات الأمراض النباتية هي سلبية الغرام. وكشف الاستعراض الأخير بشأن أفضل 10 البكتيرية النباتية مسببات الأمراض التي كلها سلبية الغرام. وكانت البكتيريا من أجناس: الزائفة، رالستونيا، الأجرعية، زانثوموناس، الإيروينية، Xylella، Dickeya وPectobacterium 5 واحد من الاختلافات الكيميائية عند مقارنة الجذعية PG من بكتيريا إيجابية الغرام السلبية وغرام هو الفرق بين عبر ربط الأمينية الأحماض من كلا النوعين. الخطوة الأولى لذلك مختلفة عبر ربط PG يحدث في خطوة هيولي من PG ابتناء وتتيسر بفضل انزيم UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) (الشكل 3A). MURE يحفز إضافة مركب ديامين معين في المركز الثالث من جذع الببتيد. 6 في معظم البكتيريا سالبة الجرام، والزنبق قبل الأخيرة السلائف والمتوسط ​​-diaminopimelate ( (الشكل 3B). 7 ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كلا من م -DAP واليس تمتلك اثنين أمين الجماعات وقادرة على تشكيل اثنين من السندات الببتيد لالببتيد الجذعية عبر ربط.

في Bioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) البرنامج الدراسي، وتناقش الاختلافات بين النظم المفتوحة والمغلقة لزراعة البكتيريا وكيف أن مستويات المواد الغذائية سوف تتغير بشكل كبير في كلا النظامين نظرا للتغيرات البيئية. وترتبط هذه الأحداث إلى التغييرات التنظيمية يسمى "تحول أسفل" أو "حتى تحول" الناجمة عن المجاعة أو إمدادات كافية من الأحماض الأمينية أو الطاقة. يمكن أن يحدث "تحول أسفل" استجابة عندما يتم نقل ثقافة البكتيرية من وسيلة غنية ومعقدة إلى متوسطة محددة كيميائيا مع مصدر الكربون واحد. هذا التغيير في البيئة يؤدي إلى cessa السريعنشوئها من الحمض الريبي النووي النقال والريباسي التوليف. هذا وقف النتائج في عدم وجود الريبوسومات والبروتين والحمض النووي على الرغم من وupregulated الحيوي من الأحماض الأمينية.

بعد استجابة "تحول أسفل"، يتم استخدام الريبوسومات القائمة على إنتاج إنزيمات جديدة لتجميع الأحماض الأمينية لم تعد متوفرة في المتوسط ​​أو البيئة. بعد فترة من الوقت، يتم تجميع التوليف الريباسي والريبوسومات جديدة والسكان من الخلايا البكتيرية يبدأ في النمو على الرغم بسعر مخفض. ويطلق على مجرى الأحداث في "استجابة الصارمة" أو "رقابة صارمة"، ومثال على التنظيم الخلوية العالمي ويمكن النظر إليها على أنها آلية لضبط الآلات السكروز الخلية للتعويض عن توافر ركائز المطلوبة واحتياجات الطاقة 8 الرد صرامة مما يتيح البكتيريا على الاستجابة السريعة لتدفقات من المواد الغذائية في البيئة ويساهم وENHances قدرة البكتيريا على المنافسة في البيئات التي يمكن أن تتغير بسرعة فيما يتعلق المغذيات وأو توافر الركيزة 8-9

استجابة صارمة لديه دورا أساسيا في التعبير الجيني عندما تقتصر على توافر الأحماض الأمينية، والكربون والنيتروجين والفوسفات، والأحماض الدهنية. 8،10-14 يتم تنسيق هذه الاستجابة الصارمة من قبل اثنين من النيوكليوتيدات، غوانوزين tetraphosphate (ppGpp) وغوانوزين pentaphosphate (pppGpp) يشار معا في alarmone (ع) ppGpp. على سبيل المثال، عندما يتم الأحماض الأمينية محدودة والتي يمكن أن تؤدي إلى اختناق في تخليق البروتين، وalarmone، غوانوزين 3،5- (مكرر) بيروفوسفات (ppGpp)، والمستمدة من ابتناء من غوانوزين 3-ثنائي فسفات 5 ثلاثي الفوسفات (pppGpp) يتراكم في الخلية. التغير في مستوى (ع) ppGpp وتشارك في التعبير عن الجينات التي تنظم الاستجابة للتغلب على عدم وجود ركائز في البيئة التي تشارك مباشرة في نمو الخلايا والتنت. ودعا اثنين من الجينات التي تشارك في هذه العملية RELA والبقعة. RELA هو (ع) ppGpp مخلقة المرتبطة الريبوسوم التي تشارك في الاستجابة إلى تراكم tRNAs بدون تهمة الذي هو نتيجة للقيود الأحماض الأمينية. وظائف بقعة باعتباره bifunctional (ع) ppGpp مخلقة وهيدرولاز. وتشارك النشاط مخلقة من بقعة في الاستجابة لعدم وجود الكربون والأحماض الدهنية المجاعة. 8 homologs RELA / بقعة على نطاق واسع في النباتات والبكتيريا ويشار إلى آر إس إتش للomologs ح R العلا / S وعاء. 8،10 -12،16 أظهرت مخطوطة الأخيرة أن هناك بروتين آر إس إتش المحددة المعنية في تركيب هذه alarmones من البكتيريا Novosphingobium س ص ص 2-17. 17

هنا نقدم أربعة المسارات البيوكيميائية مصطفة على المقايسات تكامل وظيفي. المقايسات تكامل المبينة في هذه المخطوطة توفر وسيلة لEXPLخام يعمل هذا الاختبار في الجسم الحي كوسيلة لتحديد وتوصيف أو الانزيمات التي من المتوقع أن يكون غير معروف / وظيفة المفترضة (ق) أو كأدوات تعليمية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: المؤلفون على استعداد لتوفير السلالات البكتيرية والبلازميدات المؤتلف لتسهيل إدماج تحليل تكامل وظيفي لأغراض التدريس للأفراد المهتمين. يتم سرد البلازميدات التي كانت تستخدم لتسهيل تجارب تكامل وظيفي في الجدول 1.

1. البناء من البلازميدات لالتكملة الوظيفي

  1. استنساخ Diaminopimelate الألانين (dapL) لالتكملة الوظيفي.
    1. تضخيم dapL إطار القراءة المفتوح (ORF) من V. الشائكة وcDNAs من أ. thaliana و C. reinhardtii بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide 4، و 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من PFXالبلمرة DNA.
      ملاحظة: وصف كامل المتعلقة الاستنساخ المؤتلف من ثلاثة orthologs dapL من مصنع A. thaliana (في -dapL)، والبكتيريا Verrucomicrobium الشائكة (مقابل -dapL) والطحالب كلاميدوموناس reinhardtii (الكروم -dapL) قد نشرت في وقت سابق. 2،18-20
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في الاستنساخ من orthologs dapL هي كما يلي:
      مقابل dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 "
      مقابل dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 "
      في dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 "
      في dapL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 "
      كر dapL F-5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 "
      كر dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 "
    2. استنساخ شظايا PCR في تيانه البلازميد pET30A لإنتاج البلازميدات المؤتلف، pET30A :: مقابل dapL، pET30A :: في dapL وpET30A :: الكروم dapL باستخدام بادئات، والانزيمات التقييد ويغاز T4 DNA.
      1. لفترة وجيزة، واحتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 18-20
    3. لخلق البلازميد للتكامل وظيفي، وهضم pET30A :: مقابل dapL وpET30A :: في البلازميدات dapL مع تقييد الانزيمات XbaI وسالي وXbaI وHindIII لpET30A :: الكروم dapL. Ligate يدرج في pBAD33 البلازميد باستخدام يغاز T4 الحمض النووي لإنتاج البلازميدات pBAD33 :: مقابل dapL. pBAD33 :: في dapL وpBAD33 :: الكروم dapL.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و20 نانوغرامناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 20
  2. استنساخ ناقلة أمين التيروزين (tyrB) من أ. thaliana لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: التفاصيل الكاملة بشأن استنساخ [كدنا] من أ. thaliana المشروح بالعلامات مكان وقد وصفت At5g36160 سابقا. 4
    1. تضخيم [كدنا بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، و 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز PFX DNA 0.5 ملم.
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في البنودoning من At5g36160 هي كما يلي:
      في tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
    2. استنساخ جزء في pET30A البلازميد إنتاج البلازميدات المؤتلف pET30A :: At5g36160 من قبل هضم جزء PCR مع EcoR1 وSal1. ligate في جزء إلى pET30A باستخدام يغاز T4 DNA كما هو موضح أدناه. 4
    3. لخلق البلازميد تكامل وظيفي، وهضم pET30A :: At5g36160 مع تقييد الانزيمات XbaI وHindIII، وligate إدراج في pBAD33 باستخدام نفس المواقع انزيم التقييد لإنتاج البلازميد المؤتلف pBAD33 :: At5g3160 باستخدام يغاز T4 DNA.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل chlo -1ramphenicol التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 4
  3. استنساخ UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) من V. الشائكة لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: استنساخ MURE ORF من V. وقد وصفت الشائكة سابقا. 18
    1. تضخيم إطار القراءة المفتوح بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز PFX الحمض النووي. ثم استنساخ في البلازميد pET100D لإنتاج البلازميد pET100D :: مقابل MURE.
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في استنساخ مقابل MURE هي كما يلي:
      مقابل MURE F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 "
      ضدMURE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 "
    2. لإنتاج البلازميد للتكامل وظيفي، وهضم pET100D :: مقابل MURE
      مع تقييد الانزيمات XbaI وSal1 وligate إدراج في pBAD33 لإنتاج البلازميد pBAD33 المؤتلف :: مقابل MURE باستخدام يغاز T4 DNA.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X، جنبا إلى جنب مع 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي، وبين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 8
  4. استنساخ RELA / ق وعاء (آر إس إتش) من Novosphingobium ليرة سورية لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: إن الاستنساخ من آر إس إتش من Novosphingobium ليرة سورية وقد وصفت سابقا 17.
    1. تضخيم ORF آر إس إتش بالإضافة إلى 599 النيوكليوتيدات upstماعون من الموقع الشروع بداية و 46 النيوكليوتيدات المصب في موقع الانهاء من جانب PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز طق الحمض النووي. ثم استنساخ في pCR2.1 البلازميد إنتاج pCR2.1 :: برنامج الفضاء الوطني آر إس إتش.
      1. احتضان 1 ميكرولتر من تضخيم جزء PCR، 1 ميكرولتر من ناقلات pCR2.1، 1 ميكرولتر من محلول الملح و 1 ميكرولتر من المياه. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 2 ميكرولتر من ربط إلى E. خلايا القولونية، وشاشة لمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها 37 ° مئوية لمدة 24 ساعة.
        ملاحظة: الاشعال المستخدمة في الاستنساخ من آر إس إتش هي كما يلي:
        آر إس إتش F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 "
        آر إس إتش R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 "
      2. لتكامل وظيفي، وهضم pCR2.1 البلازميد :: برنامج الفضاء الوطني RSH مع EcoR1 وligate إدراج في pRK290 نطاق واسع المضيف لإنتاج البلازميد المؤتلف pRK290 :: برنامج الفضاء الوطني آر إس إتش باستخدام يغاز T4 DNA.
        1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين -1 التي يحتضنها 37 ° مئوية لمدة 24 ساعة. 17

2. إعداد الخلايا البكتيرية الكهربائية المختصة لتسهيل التحول

ملاحظة: إعداد الخلايا الكهربائية المختصة تقوم على بروتوكول 26 ل 1.0 لتر من الثقافة التي يمكن زيادتها لتصل إلى حجم أصغر (أي 250 مل). يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول يمكن بالبريد تستخدم لجعل كل السلالات المختصة التي تم وصفها في هذه المخطوطة لتسهيل FCA 22

  1. تطعيم 50 مل من المتوسط ​​السائل مع مستعمرة واحدة في قارورة وتنمو أكثر من ليلة، مع التأكد من تحقق التركيب الوراثي للمتحولة قبل البدء في هذه الخطوة (الجدول 2).
  2. في اليوم الثاني، تطعيم 1.0 لتر من الوسط المناسب (LB لE. coli و المسوخ PD لNovosphingobium س) مع 50 مل من الثقافة بين عشية وضحاها، وتنمو إلى OD 600 0،4-0،6 (تسجيل مرحلة) عند 30 درجة C.
  3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف، و resuspend بيليه في 500 مل من معقم الجليد الباردة H النقي 2 O.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف و resuspend بيليه في 250 مل من معقم الجليد الباردة 10٪ الجلسرين.
  5. الطرد المركزي الخلايا في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 ° C، صب السوبرعائم، و resuspend بيليه في 2.0 مل من 10٪ الجلسرين.
  6. قسامة الخلايا عن طريق نقل 50 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وعلى الفور تجميد عن طريق وضع الأنابيب في حمام الجليد الجاف الايثانول. تخزين الخلايا المختصة في -80 درجة مئوية ل electroporation.

3. Electroporation للمن الخلايا البكتيرية مع التكملة البلازميدات

  1. ل electroporation، إضافة 1.0 ميكرولتر (10-50 نانوغرام) البلازميد المؤتلف إلى قسامة (50 ميكرولتر) من الخلايا المختصة ووضع على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. نقل الخليط عبر pipetting للكفيت Electroporation للوتعيين جهاز Electroporation لللإعداد التالي: 25 السعة μF، 2.5 كيلو فولت، و 200 أوم المقاومة وتسليم النبض.
  3. إضافة 1.0 مل من وسائط استرداد (LB) إلى كفيت Electroporation للونقل باستخدام ماصة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. استعادة مع دوران طيف لمدة 60 دقيقة في حاضنة تهتز.
  4. لوحة 100 ميكرولتر من ثقافة من ريكوخطوة جدا على لوحات أجار عليه الاختيار لtransformants من قبل pipetting ونشر استخدام رش العقيمة.
    ملاحظة: تأكد من تحقق الجدول 1 والجدول 2 قبل البدء في هذه الخطوة للتحقق من المضادات الحيوية والأنماط الجينية لجعل لوحات أجار المناسبة.

4. التحول من AOH1 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق L، L-diaminopimelate الألانين (dapL)

  1. لتحليل تكامل، وتحويل AOH1 مع ناقلات فارغة (pBAD33)، ومع ناقلات التعبير DapL في أحداث التحول منفصلة باستخدام بروتوكول Electroporation للالمبينة في القسم 3.0.
  2. تحديد transformants بواسطة الطلاء على LB المتوسطة أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 DAP و 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 و 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين.
  3. اختبار للتكامل وظيفي من قبل المستعمرات متماثلة الطلاء من تسليط الضوء على LB ليdium مع 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز مع وبدون 50 ميكروغرام / مل -1 DAP و 34 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين.
  4. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ومراقبة النتائج.
    ملاحظة: نتيجة ينبغي أن تظهر أن متحولة غير قادرة على النمو في وسائل الإعلام الحرة حزب العمل الديمقراطى فقط عندما يتم التعبير عن الجينات dapL في الخلفية متحولة فقط بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

5. التحول من TKL-11 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق الوسيط UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-غلوتاميل-2،6- -diaminopimelate يغاز (مور)

  1. تحويل متحولة مع ناقلات فارغة (pBAD33) ومع التعبير عن ناقلات MURE (pBAD33 :: VsmurE) باستخدام بروتوكول المبينة في القسم 3.0.
  2. لوحة وتحديد transformants في المتوسط ​​LB أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الثايمين -1 و 34 ميكروغرام / مل -1 الكلورامفينيكول واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. اختبار للتكامل من خلال تسليط الضوء أو الطلاء المستعمرات من كل من السيطرة والتحولات التجريبية على اثنين من LB المتوسطة بالإضافة إلى 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز و 50 ميكروغرام / مل الثايمين -1.
  4. احتضان لوحة واحدة على 30 درجة مئوية، والآخر في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتقييم بصريا النمط الظاهري النمو.
    ملاحظة: يجب أن تظهر النتائج أن متحولة غير قادرة على النمو في 42 درجة مئوية فقط عندما يتم التعبير عن الجينات MURE في الخلفية متحولة مقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

6. تحول DL39 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق ناقلة أمين التيروزين (tyrB)

  1. تحويل DL39 مع أي pBAD33 أو pBAD33 :: At5g36160، وتحديد transformants على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 50 ميكروغرام / مل الفنيل الأنين -1، و 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 باستخدام بروتوكول المبينة في القسم 3.0.
  2. طبق الاصلالمستعمرات -plate على الحد الأدنى (M9) وسائل الاعلام مع 50 ميكروغرام / مل الفنيل الأنين -1 و 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 50 ميكروغرام / مل -1 اسبارتاتي، 50 ميكروغرام / مل ليسين -1، 50 ميكروغرام / مل -1 حمض أميني أساسي، 50 ميكروغرام / مل يسوليوكيني -1، 10 ميكروغرام / مل -1 اليوراسيل 0.5٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.2٪ (ث / ت) أرابينوز. أيضا المستعمرات متماثلة لوحة على لوحات تفتقر الفينيل ألانين والتيروزين من تسليط الضوء على نفس مستعمرة لكل من لوحات.
  3. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لمراقبة النمط الظاهري النمو.
    ملاحظة: نتيجة ينبغي أن تظهر أن متحولة غير قادرة على النمو على الفينيل ألانين والتيروزين وسائل الإعلام الحرة، فقط عندما يتم التعبير عن الجينات tyrB في الخلفية متحولة فقط بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

7. التحول من Hx699 لتيسير التكملة الوظيفي للHypomucoid النمط الظاهري من Novosphingobium ليرة سورية. سلالة Hx699

  • تحويل من نوع السلالة البرية Novosphingobium ليرة سورية. (Rr2-17) وHx699 متحولة مع pRK290 وpRK290 :: آر إس إتش اس بي في 2 أحداث التحول منفصلة باستخدام بروتوكول التحول المبينة في القسم 3.0.
  • لوحة التحولات على سكر العنب البطاطس (PD) أجار تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل -1 التتراسيكلين، واحتضان لمدة لا تقل عن 24 ساعة أو حتى تظهر transformants.
  • خط كل من تحولات في نمط "X" على لوحات PD أجار الطازجة واحتضان عند 30 ° مئوية لمدة 4 أيام على الأقل. مراقبة الظواهر متجه فقط، والتجربة من خلال دراسة بصريا النمط الظاهري نمو كل من لوحات.
    ملاحظة: يجب أن تظهر النتيجة أن النمط الظاهري للفراش لا تسبب مخاطي ويكمل عندما يتم التعبير عن آر إس إتش في الخلفية متحولة بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يتم سرد السلالات البكتيرية التي يعملون في مختلف التحليلات تكامل وظيفي في الجدول 2.

    وظيفية تحليل تكامل: L، L-diaminopimelate الألانين (dapL)

    وE. القولونية متحولة مزدوج AOH1 (Δ DAPD :: Kan2، dapE6) تؤوي طفرة في الجين DAPE والحذف التام من الجين DAPD (الشكل 1). على هذا النحو، متحولة غير قادر على النمو ما لم يتم توفير DAP. ونتيجة لهذه الطفرات، يعتبر AOH1 العوز الغذائي. AOH1 هو مناسبة لتحليل تكامل وظيفي لL، L-diaminopimelate الألانين (DapL) orthologs كما DapL يحفز تخليق L، L-diaminopimelate مباشرة من THDP لتسهيل PG واليس التوليف (الشكل 1).

    -together.within الصفحات = "1"> النتائج من هذه التجربة يجب أن تبين أن فقط AOH1 متحولة معربا عن DapLs هي قادرة على النمو في L، وسائل الإعلام L-DAP-حرة تدل على أن الإنزيمات المؤتلف قادرة على تحويل THDP إلى L، التحايل على DAPD وDAPE خطوات الأنزيمية في مسار DAP / ليز L-DAP (الشكل 5).

    تحليل تكامل وظيفي: UDP - N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور)

    -diaminopimelate المتوسط ​​(م -DAP) هو عبر ربط الأحماض الأمينية في PG من البكتيريا سالبة الجرام. الانزيم UDP- N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2،6- المتوسط ​​يغاز -diaminopimelate (مور) يسهل إضافة م -DAP في هذه العملية (الشكل 3A - B). وE. القولونية متحولة TKL-11 تؤوي موالكساء في جين مور الذي ينتج قدرة متحولة أن ينمو بمعدل 42 ° C يرجع ذلك إلى حقيقة أن إنزيم تحور ليست قادرة على اضعاف بشكل صحيح في درجة الحرارة هذه.

    سوف تظهر النتائج أن هناك نمو في درجة الحرارة المسموح بها من 30 درجة مئوية عن طريق كلا من التحكم والتجربة. ومع ذلك، لن يؤدي إلا إلى الخلايا معربا عن MURE (التجربة) تكون قادرة على النمو في درجة حرارة غير متساهلة من 42 ° C (الشكل 6).

    وظيفية تحليل تكامل: الألانين التيروزين (tyrB)

    نبات الأرابيدوبسيس thaliana يشفر ناقلة أمين التيروزين قادرة على interconvert التيروزين و 4 hydroxyphenylpyruvate، والفينيل ألانين وفينيل بيروفات المشروح من قبل At5g36160 (الشكل 2). 4 E. العقيدط متحولة (DL39) تؤوي طفرة في الجين tyrB مما يجعل العوز الغذائي للفينيل ألانين والتيروزين. 24-26 وتجدر الإشارة إلى أن المسخ هو العوز الغذائي للأحماض الأمينية التيروسين، الفنيل الأنين، اسبارتاتي، ليسين، آيسولوسين وحمض أميني أساسي، وكذلك بسبب الطفرات الأخرى. سلالة مناسبة لتقييم وظيفة orthologs tyrB منذ الانزيم ortholog TyrB من E. القولونية متورطة مباشرة في تركيب التيروزين والفينيل ألانين لتسهيل عملية تخليق البروتين.

    يجب أن تظهر نتيجة أنه في حين أن متحولة DL39 غير قادرة على النمو في M9 فقط عندما يتم توفير التيروزين والفنيل الأنين. ومع ذلك، فإن سلالة معربا عن A. thaliana (At5g36160) هو قادرة على النمو في وسائل الإعلام M9 تفتقر التيروزين والفنيل الأنين يدل على أن الانزيم هو قادرة على تجميع التيروزين من 4 hydroxyphenylpyruvate، والفينيل ألانين من فينيل بيروفات ر (Figure 7). 4

    تحليل تكامل وظيفي: RSH (homolog RELA وS عاء)

    البروتين RSH من Novosphingobium ليرة سورية. (Rr2-17) يحتوي على كل من phosphohydrolase-N محطة و(ع) ppGpp المجالات سينسيز، وبالتالي له دور bifunctional المقترحة مثل بقعة من E. القولونية. وقد تم تأكيد ذلك باستخدام تحليل تكامل لE. متحولة مزدوج القولونية، CF1693 التي تؤوي طفرة في RELA والبقعة باستخدام الجينات RSH من Novosphingobium ليرة سورية. النمط الظاهري من متحولة آر إس إتش Rr2-17، واسمه Hx699 (آر إس إتش :: EZ-Tn5، كان R)، يؤدي إلى قصور مخاطي وهذا يرجع إلى آر إس إتش غير وظيفية. وجرى تقييم النمط الظاهري للفراش لا تسبب مخاطي من Hx699 بواسطة تكامل سهل بواسطة الجينات اس بي آر إس إتش الأصلية التي تم استنساخفي مضيف واسع pRK290 مجموعة ناقلات. وتمشيا مع النمط الظاهري للفراش لا تسبب مخاطي، وHx699 إيواء pRK290 ناقلات فارغة تظهر السكاريد أقل ذوبان تلك التي تنتجها Hx699 عبر يكمل (pRK290 :: آر إس إتش اس بي) وRr2-17 تحتوي على pRK290 أو pRK290 :: آر إس إتش اس بي (الشكل 8) .

    شكل 1

    الشكل 1: المتغيرات من مسارات يسين الابتنائية من اسبارتاتي أن المضي قدما من خلال diaminopimelate سيطة (DAP) والمشروح مسارات التي كتبها (A) مسارات أسيل، (ب) نازعة diaminopimelate (ده) مسار و(ج) L ،-L diaminopimelate الألانين (DapL) المسار. التعاريف اختصار لالانزيمات هي على النحو التالي: اسبارتاتي كيناز (LysC)، اسبارتاتيألدهيد نصفي نازعة (ASD)، سينسيز tetrahydrodipicolinate (ضبا)، اختزال tetrahydrodipicolinate (DapB)، أسيلاز tetrahydrodipicolinate (DAPD)، N -acyl-2-أمينو-6-ketopimelate الألانين (DapC)، N -acyl-L، L-2، نازعة الأسيل 6 diaminopimelate (DAPE)، إيبيميراز diaminopimelate (DapF) والمتوسط ​​-diaminopimelate نازعة (ده) والمتوسط ​​كربوكسيل -diaminopimelate (LysA)، L، L-diaminopimelate الألانين (DapL)، UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl- د-الغلوتامات: يغاز المتوسط ​​-2،6-diaminopimelate (مور) والليزيل-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة (LysU) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2

    الشكل 2: مسارات كات بوي للمبتدأ الأحماض الأمينيةالجيب والفينيل ألانين. (A) وبكتيريا (إي كولاي) الطريق من خلال chorismate المتوسطة و (ب) مسار المحطة من خلال arogenate المتوسط. اختصارات لالانزيمات هي على النحو التالي: chorismate موتاز / بريفينات نازعة الماء (PheA)، موتاز chorismate، نازعة بريفينات (تايرا)، وناقلة أمين التيروزين (TyrB). اعتمد المخطط وتعديل شكل برابو وهدسون، 2010. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)

    الرقم 3: الخطوة هيولي التوليف ببتيدوغليكان (أ) تمثيل تخطيطي للخطوة هيولي التوليف ببتيدوغليكان. الاختصارات من الإنزيمات هي كما يلي: UDP- N -acetylglucosamine enolpyruvyl ترانسفيراز (مورا)، UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB)، UDP- N -acetylmuramate-L-ألانين يغاز (MurC)، UDP- N--acetyl muramoylalanine-D يغاز -glutamate (MurD)، UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-الغلوتامات 2،6- المتوسط ​​يغاز -diaminopimelate (مور)، UDP- N--acetylmuramoyl ثلاثي الببتيد-D-ألانيل-D-ألانين يغاز (MurF )، يغاز D-ألانين-D-ألانين (DDL). (ب) تمثيل تخطيطي وحدة أحادى من ببتيدوغليكان تبين ديساكهارايد N -acetylglucosamine (GlcNAc) و N -acetylmuramic (MurNAc) مرتبطة عن طريق رابطة غليكوسيدية β-1،4. الأحماض الأمينية في موقف 3 من الببتيد الجذعية وتشارك في عبر ربط دلالة كتبها meso -diaminopimelate (م -DAP) في معظم البكتيريا سالبة الجرام والزنبق في معظم البكتيريا إيجابية الجرام._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)

    الشكل (4):. تخطيطي تمثيل نموذج للاستجابة الصارمة في البكتيريا التعرض لبيئة فقيرة المغذيات يدفع آر إس إتش (RELA أو البقعة) إلى anabolize وalarmone (ع) ppGpp (غوانوزين pentaphosphate) عن طريق إضافة مجموعة فوسفات إلى GTP (غوانوزين ثلاثي الفوسفات). التعرض لبيئة غنية المغذيات الحث على التعبير في آر إس إتش ليتحلل (ع) ppGpp وهو مثبط النمو. اعتمد المخطط وتعديلها من راسكين وآخرون، 2007. 27 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 5 الصليب الأحمر = "/ ملفات / ftp_upload / 53850 / 53850fig5.jpg" />

    الرقم 5: تكامل الوظيفي باستخدام DapL تكامل الوظيفي للAOH1 E. متحولة القولونية مع L، L-diaminopimelate الألانين الجين (dapL) من البكتيريا V. الشائكة (مقابل dapL)، ومصنع A. thaliana (في dapL) والطحالب، C. reinhardtii (الكروم dapL). متحولة إيواء البلازميدات، pBAD33، pBAD33 :: مقابل DapL، pBAD33 :: في dapL وpBAD33 :: الكروم dapL كانت مطلية طبق الأصل على لوحات أجار LB تستكمل مع 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز مع أو بدون 50 ميكروغرام / مل L، L - diaminopimelate وكانت تزرع في 30 ° مئوية لمدة 24 ساعة. اعتمد المخطط وتعديلها من Nachar وآخرون، 2012. 18 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1" FO: النص محاذاة = "مركز"> الشكل (6)

    الرقم 6: تكامل الوظيفي باستخدام MURE تكامل الوظيفي للTKL-11 E. متحولة القولونية مع -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- يغاز المتوسط ​​-2،6-diaminopimelate (مور) الجين UDP- N من V. الشائكة. وقد نمت متحولة إيواء البلازميدات BAD33 أو pBAD33 :: VsmurE في LB المتوسطة إلى OD 600 من 0.1 وكانت مخففة متسلسل إلى 10 -1 و 10 -2، و 10 -3 باستخدام 0.85٪ (ث / ت) المالحة . 5 ميكرولتر من مختلف التخفيفات كانت مطلية متماثلة في المتوسط ​​LB تستكمل مع 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز وكانت تزرع تقييمها عند 30 درجة مئوية و 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 7

    الرقم 7: تكامل وظيفي من DL39 E. القولونية مع جين التيروزين الألانين المشروح عن طريق العلامة موضع At5g36160 من أ. thaliana. وقد تم اختيار متحولة إيواء البلازميدات pBAD33 أو pBAD33 :: At5g36160 على لوحات LB أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 50 ميكروغرام / مل الفنيل الأنين -1، و 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1. كانت تزرع سلالة في مرق LB إلى OD OD 600 من 1.0 وكانت مخففة متسلسل إلى 10 -1 و 10 -2، و 10 -3 باستخدام 0.85٪ (ث / ت) المالحة. وكانت 5 ميكرولتر من مختلف التخفيفات ثم طبق مطلي، على لوحات أجار M9 تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل فينيل -1ألانين و 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 0.5٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.2٪ (ث / ت) أرابينوز، 50 ميكروغرام / مل -1 اسبارتاتي، 50 ميكروغرام / مل ليسين -1، 50 ميكروغرام / مل -1 حمض أميني أساسي، 50 ميكروغرام / مل يسوليوكيني -1، 10 ميكروغرام / مل اليوراسيل -1، وأيضا على لوحات تفتقر الفينيل ألانين والتيروزين وحضنت في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. اعتمد المخطط وتعديل شكل برابو وهدسون، 2010. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    شكل 8

    الرقم 8: تكامل وظيفي من النمط الظاهري hypomucoid ليرة سورية Novosphingobium. سلالة متحولة Hx699. تانه نوع السلالة البرية Novosphingobium ليرة سورية. (Rr2-17) وسلالة متحولة Hx699 تحولت مع pRK290 أو pRK290 :: آر إس إتش اس بي، وقد يشوبه السلالات في "X" وكانت تزرع كذلك على أجار PD عند 30 درجة مئوية لمدة 4 أيام على الأقل لمراقبة الظواهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    البلازميدات تكامل علامات مقاومة للمضادات الحيوية تنويه
    pBAD33 سم ص 21
    pBAD33 :: في dapL سم ص 2
    pBAD33 :: الكروم dapL سم ص 20
    pBAD33 :: مقابل dapL سمص 18
    pBAD33 :: At5g36160 سم ص 4
    pBAD33 :: مقابل MURE سم ص 18
    pRK290 تيت ص 28
    pRK290 :: آر إس إتش اس بي تيت ص 17

    الجدول 1: الوظيفي البلازميد تكامل المستخدمة في هذه الدراسة قائمة من البلازميدات المستخدمة لتحليل تكامل وظيفي. سم R وتيت R دلالة الكلورامفينيكول ومقاومة التتراسيكلين على التوالي.

    اسم سلالة كائن حي الطراز العرقى النمط الظاهري مصدر
    AOH1 بكتريا قولونية Δ DAPD :: Kan2، dapE6 العوز الغذائي لdiaminopimelate مختبر هدسون
    TKL-11 * بكتريا قولونية عبتي-1، leuB6 (ص)، murE1، fhuA21، codA1، lacY1، TSX-95، glnV44 (AS)، λ -، pyrF101، له-108، thyA6، argG66، ilvA634، ثي-1، deoC1 وكان النمو النمط الظاهري حساسة متحولة ينمو بمعدل 30 درجة مئوية ولكن ليس 42 ° C CGSC (# 5989)
    DL39 * بكتريا قولونية LAM-، aspC13، FNR-25، RPH-1 ilvE12، tyrB507 العوز الغذائي للأحماض الأمينية. التيروزين، الفنيل الأنين، ليسين، آيسولوسين وحمض أميني أساسي CGSC (# 6913)
    Rr2-17 Novosphingobium ليرة سورية. (النوع البري) - فرط مخاطي مختبر Savka
    Hx699 س Novosphingobium. آر إس إتش :: EZ-Tn5، كان R قصور مخاطي مختبر Savka

    الجدول 2: السلالات البكتيرية المستخدمة في هذه الدراسة قائمة من السلالات البكتيرية جنبا إلى جنب مع الأنماط الوراثية منها، والظواهر التي استخدمت في هذه الدراسة. يرجى ملاحظة أن سلالات (TKL-11 و DL39) الرمز بواسطة النجمة ويمكن الحصول عليها مباشرة من مركز الوراثية كولاي المالية (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    العديد من الدورات التي هي جزء لا يتجزأ من الحيوية ومنهج العلوم البيولوجية الجزيئية في معهد روتشستر للتكنولوجيا وجود مكون المختبر بالإضافة إلى جزء محاضرة للدورة. المناهج الدراسية للعام الدراسي 2014-2015 ويتضمن ما مجموعه 48 دورة، 29 منها تحتوي على عنصر المختبر والتي تمثل حوالي 60٪. واحدة من هذه الدورة هو أساسيات الكيمياء الحيوية النباتية وعلم الأمراض (FPBP)، محاضرة / دورة المختبر المخلوطة وBioseparations: المبادئ والممارسات (BPP)، دورة المختبري.

    تم تصميم المكون المختبر من كل دورة لتعزيز المواد محاضرة. على سبيل المثال، وشدد المسارات البيوكيميائية والتمثيل الغذائي بشكل كبير في FPBP وBPP. بعض الموضوعات تشمل أيض الأحماض الأمينية، الحيوي ببتيدوغليكان، مصنع الأيض الثانوية، استجابة البكتيرية إلى منافذ البيئية وغيرها. الكتاب قد أدمجت complem وظيفيةentation كما التجارب المختبرية في كل من الدورات لتعزيز فهم المسارات الأيضية التي تمت مناقشتها في المحاضرات والعروض أو قبل المختبر. وتناقش أربعة أمثلة على استخدام تجربة تكامل وظيفي لتحليل وظيفة الجينات المسؤولة عن المسارات البيوكيميائية من الزنبق، PG، صور، PHE واستجابة صارمة من البكتيريا.

    هناك العديد من الأسباب التي تجعل الكتاب قد أدمجت هذه الوحدة التجريبية في دراستهم. أولا، والتعرض للتكامل وظيفي ويحلل هو أداة ممتازة لتعزيز أو تقديم موضوعات التي ترتبط علم الوراثة، والتطور، وعلم الجينوم، المعلوماتية الحيوية والكيمياء الحيوية. ثانيا، إن التجربة هي سطحية ويمكن إنجازه في بيئة بالطبع المختبر. كل من الكواشف التي تستخدم آمنة وتدل على البكتيريا التي تستخدم مستوى السلامة الحيوية 1 وليست المسببة للأمراض. على هذا النحو، والكتاب على استعداد لجعل الكواشف مثل البلازميدات وتفلسلالات cterial متاحة لمن هو في يرغبون في دمج تكامل وظيفي كجزء من الخبرة في مجال التدريس الخاصة بهم. وتجدر الإشارة إلى أن اثنين من السلالات البكتيرية (TKL-11 و DL39) تم الحصول عليها مباشرة من مركز الوراثية كولاي المالية (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).

    من المهم أن نلاحظ أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة لبروتوكول تكامل وظيفي. الخطوة الأولى هي التأكد من أن متحولة (ق) هي قادرة على أن تكون مثقف قبل البدء في أي التجارب. والسبب هو أنه في الجدول 2، وهناك العديد من المورثات المرتبطة بكل متحولة. من أجل أن تنمو متحولة إلى إعداد الخلايا المختصة قبل التجربة، حاول نموا في متحولة مع أو من دون المواد الكيميائية المطلوبة وأو متطلبات درجة الحرارة فيما يتعلق متحولة PG MURE. وهذا هو أيضا لحظة التدريس لأنه سيثبت أن المسخ هو أصيل قبل أي تجارب.

    هذاكما تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من هذا هو أداة ممتازة لاختبار وظيفة (ق) من الجينات، فإنه لا يعمل دائما بسبب العديد من العوامل مثل استخدام كودون حيث الجين (ق) من الفائدة لا يمكن ترجمتها بشكل صحيح بسبب عدم وجود وtRNAs المناسبة في الحي متحولة. ومع ذلك، يمكن التحايل عليها من قبل الأمثل كودون من إطار القراءة المفتوح أو كدنا] خلال خطوة الاستنساخ التي تتم عادة عن طريق تجميع الجينات في المصالح عن طريق تغيير النيوكليوتيدات لتتناسب مع الاستخدام كودون من متحولة (ق). وثمة مسألة أخرى هي أن بعض البروتينات حقيقية النواة تتطلب التعديلات بعد متعدية من أجل وظيفة. آخر تعديل متعدية ليست سمة من البكتيريا وعلى هذا النحو يمكن للمرء أن لا تكون قادرا على استخدام هذه التقنية لاختبار وظيفة (ق) من الجينات باستخدام المسوخ البكتيرية.

    وتكمن أهمية هذه التقنية أن نؤكد في هذه الدورات هي أن FCA هو وسيلة ممتازة لاختبار لوظيفة الجينات في الجسم الحي. توصيف وتقوم الإنزيمات في الغالب على الدراسات في المختبر حيث الانزيم يتم تنفيذ المقايسات الأنزيمية النقاء والتقليدية. 29 المقايسات الأنزيمية التقليدية أيضا كبيرة لقياس أو كشف النشاط الأنزيمي، يمكن للمرء في كثير من الأحيان "تغذية القوة" الانزيم مع ركائز المتاحة تجاريا التي ليست نقية أو الطبيعية للإنزيم. 30 نظام في الجسم الحي مثل توفر الهيئة الاتحادية للجمارك دليلا أكثر واقعية بشأن وظيفة الجينات نظرا لحقيقة أنه يعمل في ظل الظروف الفسيولوجية كما يعترض لفي المختبر والتي ليست في العادة في ظل الظروف الفسيولوجية. 2 ونظرا عدم وجود معلومات بشأن وظائف العديد من الجينات، وحقيقة أن معظم الشروح تقوم على التنبؤ، 31 اتقان هذه التقنية من شأنها تسهيل تجارب لتوضيح مهام العديد من الجينات التي لا تزال غامضة أو تلك التي تعتبر حاليا لديهم وظائف المفترضة في مختلف قواعد البيانات العامة.

    jove_content "> واحدة من القضايا المتعلقة تقنية التي غالبا ما يعانيها المرء في إعداد الخلايا المختصة. وينبغي للمرء التأكد من أن يتم إعداد الخلايا بشكل صحيح لضمان وجود ما يكفي من خلايا أن تتحول بالإضافة إلى التأكد من الخلايا يتم غسلها بشكل صحيح مع الماء والجلسرين لمنع تقوس أثناء عملية Electroporation لل. وينبغي للمرء أيضا أن ندرك من النمط الظاهري من متحولة عن طريق التأكد من أن الخلايا نمت مع المادة الكيميائية المناسبة أو في درجة حرارة مناسبة لتسهيل كل من النمو الأولي لل متحولة وكذلك لتحليل تكامل وظيفي.

    بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن للباحثين استخدام وظيفي فحص تكامل لتقييم وظيفة الجينات طالما هناك طفرة المناسبة في كائن حي متاحة لتسهيل هذا التحليل. يرجى ملاحظة أن البروتوكول في هذا المخطوط يصف استخدام البكتيريا. الكائنات الحية ومع ذلك، وغيرها من مثلمحطات وخلايا الثدييات، من بين أمور أخرى، ويمكن استخدامها لتقييم وظيفة الجينات. 32-33 احد سيكون فقط للتأكد من أن يتم استخدام ناقلات المناسبة بالإضافة إلى تحسين المحولة وأو ترنسفكأيشن من الخلايا لتسهيل التجربة .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    AOH وMAS يعترف كلية العلوم وH. مدرسة توماس Gosnell لعلوم الحياة في معهد روتشستر للتكنولوجيا حصول على الدعم. وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية بالولايات المتحدة (NSF) جائزة لAOH MCB-1120541.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    E. coli mutants Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
    Electroporator Biorad-USA 1652100
    Electroporation Cuvettes Biorad-USA 1652082
    Temperature controlled incubator Generic
    Microcentrifuge Generic
    Luria Agar Thermofisher Scientific 22700025
    Luria Broth Thermofisher Scientific 12795084
    M9 Medium Sigma-Aldrich 63011
    Potato Dextrose Medium Fisher Scientfic  DF0013-15-8
    Kanamycin Sigma-Aldrich K1377
    Diaminopimelate Sigma-Aldrich 92591
    Thymine Sigma-Aldrich T0376
    Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
    Tyrosine Sigma-Aldrich T3754
    Phenlylalanine Sigma-Aldrich P2126
    Aspartate Sigma-Aldrich A9256
    Valine Sigma-Aldrich V0500
    Leucine Sigma-Aldrich L8000
    Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
    Uracil Sigma-Aldrich U0750
    Gylcerol Sigma-Aldrich G5516
    Arabinose Sigma-Aldrich A3256
    Tetracyline Sigma-Aldrich 87128
    Taq DNA polymerase Thermofisher Scientific 10342-020
    Platinum pfx DNA polymerase Thermofisher Scientific 11708-013
    T4 DNA ligase Thermofisher Scientific 15224-041
    E. coli Dh5-alpha Thermofisher Scientific 18258012
    E. coli Top10 Thermofisher Scientific C4040-03
    pET100D/topo vector Thermofisher Scientific K100-01
    pCR2.1 Vector Thermofisher Scientific K2030-01

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
    2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
    3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
    4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
    5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
    6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
    7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
    8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
    9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
    10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
    11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
    12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
    13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
    14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
    15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
    16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
    17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
    18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
    19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
    20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
    21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
    22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
    23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
    24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
    25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
    26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
    27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
    28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
    29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
    30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
    31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
    32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
    33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

    Tags

    علم الأحياء الجزيئي، العدد 112، تحليل تكامل وظيفي، ليسين، التيروزين، ألانين وحمض أميني الأيض، استجابة صرامة، ببتيدوغليكان، والاستشعار عن النصاب
    وظيفية تحليل التكملة (FCA): ممارسة مختبر تصميم وتنفيذ المكمل لتدريس الكيمياء الحيوية مسارات
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hudson, A. O., Harkness, T. C. M.,… More

    Hudson, A. O., Harkness, T. C. M., Savka, M. A. Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways. J. Vis. Exp. (112), e53850, doi:10.3791/53850 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter