Summary
De validatie van de enzymatische activiteiten die betrokken zijn bij biochemische pathways kunnen worden toegelicht met behulp van functionele complementatie analyse (FCA). In dit manuscript het FCA assay waaruit de enzymatische activiteit van enzymen betrokken bij het metabolisme van aminozuren, bacteriële stringente respons en bacteriële peptidoglycaan biosynthese.
Abstract
Functionele complementatie bepaling (FCA) een in vivo analyse die op grote schaal wordt gebruikt om de functie / rol van genen / enzymen helderen. Deze techniek is heel gebruikelijk in de biochemie, genetica en vele andere disciplines. Een uitgebreid overzicht van de techniek om de leer van biochemische routes met betrekking tot zuren, peptidoglycaan en de bacteriële strenge reactie wordt beschreven in dit manuscript aminozuren aan te vullen. Twee cDNA's van de modelplant Arabidopsis thaliana die betrokken zijn bij het metabolisme van lysine (L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL) en tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het metabolisme van tyrosine en fenylalanine zijn gemarkeerd. Daarnaast is de bacteriële peptidoglycaan anabolische route gemarkeerd door de analyse van de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (Muré) gen uit het bacterie Verrucomicrobium spinosum betrokken bij het kruis-linking van peptidoglycan. De bacteriële stringente respons wordt eveneens opgenomen in de analyse van de rsh (r ElA / s pot h omolog) bifunctionele gen betrokken bij een hyper-mucoïde fenotype van de bacterie Novosphingobium sp. Vier voorbeelden van FCA worden gepresenteerd. De video zal zich richten op drie van hen, namelijk lysine, peptidoglycaan en de strenge reactie.
Introduction
Functionele complementatie in de context van het ophelderen van de functie (s) / functie (s) van een gen wordt gedefinieerd als het vermogen van een bepaalde homoloog of ortholoog gen een bepaalde mutant renovatie met een waarneembaar fenotype met het wild-type toestand wanneer de homologe of orthologe gen wordt ingebracht in cis- of trans in het mutante achtergrond. Deze techniek wordt algemeen gebruikt voor het isoleren en de functie (s) / functie (s) van vele genen. Een specifiek voorbeeld is de isolatie en identificatie van orotidine-5-fosfaat decarboxylase van Candida albicans met de ura3 mutant van S. cerevisiae en pyrF mutant van E. coli. 1 De auteurs hebben deze techniek gebruikt om de functie van genen die betrokken zijn bij het metabolisme van aminozuren, peptidoglycaan en de stringente respons in hun onderzoeksprogramma's en deze techniek hebben omgezet leerplannen B heldereniotechnology en Moleculair Biologische (BMB) programma aan het Rochester Institute of Technology (RIT).
De auteurs leren Fundamentals of Plant Biochemistry / Pathology (FPBP) (Hudson) en Bioseparations: Principles and Practices (BPP) (Hudson / Savka), twee bovenste divisie keuzevakken laboratorium op basis van cursussen in de BMB Program aan de RIT. Aangezien enkele van de onderwerpen die aan bod komen in de cursussen worden aangesloten bij hun onderzoek belangen zijn de auteurs veel van de technieken en experimentele instrumenten die gebruikt worden in hun onderzoeksprogramma's in deze twee-laboratorium op basis van cursussen opgenomen. Een voorbeeld is functionele complementatie als laboratorium oefening om de lezing materialen met betrekking tot zuurmetabolismeblokkers uit planten, peptidoglycaan en de stringente respons metabolisme van bacteriën amino versterken.
Drie van de aminozuur paden uit planten die worden beschreven in de FPBB Natuurlijk zijn die lysine (Lys), tyrosine(Tyr) en fenylalanine (phe). De lys route wordt gemarkeerd in de loop vanwege het belang van het aminozuur als een essentieel aminozuur voor alle dieren bijzonder mensen omdat de dieren missen de genetische machinerie te synthetiseren Lys de novo. Bovendien werd recent ontdekt dat planten gebruiken een route voor de synthese van lys die aanzienlijk verschilt van die van bacteriën. Deze ontdekking werd gedeeltelijk vergemakkelijkt door functionele complementatie van E. coli diaminopimelinezuur (dap) mutanten met een gen dat het enzym L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (DapL) codeert de modelplant Arabidopsis thaliana. 2 De variant wegen voor de synthese van lys door de tussenliggende diaminopimelinezuur zijn weergegeven in figuur 1. Naast de synthese van lys vergemakkelijkt door het aspartaat afgeleide familie van aminozuren die sterk gereguleerd. 3 Naast hun belang eiwitten Synthesis de routes voor Tyr en Phe zijn gemarkeerd gezien hun belang dienen als voorloperverbindingen voor het anabolisme van phenylpropanoid verbindingen omvatte de synthese van plantaardige afweerstoffen voorzien:. alkaloïden, ligninen, flavonoïden, isoflavonen, hydroxykaneelzuur oa 4 De tyr en phe trajecten worden ook gewezen op het verschil tussen de plant en bacteriële anabole pathways te tonen. In bacteriën wordt het enzym tyrosine aminotransferase (tyrB) betrokken bij het anabolisme van beide aminozuren, terwijl in planten, het enzym primair betrokken bij de afbraak van tyr phe en en niet betrokken bij het anabolisme van deze aminozuren. (Figuur 2). 4
De verschillen tussen Gram positieve en Gram negatieve bacteriën over de inrichting van peptidoglycaan (PG) zijn aangegeven in de FPBP loop. De PG van Gram negatieve bacteriën is van belang op plantenpathologie gebaseerd op het feit dat de meesteplantpathogenen zijn Gram-negatieve. Een recente beoordeling met betrekking tot de top 10 bacteriële fyto-pathogenen bleek dat alle zijn Gram-negatieve. De bacteriën werden uit de genera:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya en Pectobacterium 5 Een van de chemische verschillen bij vergelijking van de PG stam van Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën is het verschil tussen de verknopende amino zuren van beide types. De eerste stap voor die verschillende verknoping van PG optreedt in de stap van het cytoplasmatische PG anabolisme en wordt vergemakkelijkt door het enzym UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat -2,6 meso-diaminopimelinezuur ligase (MURE) (Figuur 3A). Mure katalyseert de toevoeging van een bepaalde diamineverbinding ten derde positie van het peptide steel. 6 in de meeste Gram-negatieve bacteriën, de voorlaatste lys voorloper, meso -diaminopimelate (
In de Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Uiteraard zijn de verschillen tussen open en gesloten systemen voor de teelt van bacteriën en hoe nutriëntenniveaus aanzienlijk zal veranderen in beide systemen als gevolg van veranderingen in het milieu besproken. Deze gebeurtenissen zijn gekoppeld aan wijzigingen in de regelgeving een zogenaamde "terugschakelen" of "opschakelen" veroorzaakt door honger of een voldoende aanbod van aminozuren of energie. De "terugschakelen" reactie kan optreden als een bacteriële kweek wordt overgebracht van een rijk en complex medium om een chemisch gedefinieerde medium met een enkele koolstofbron. Deze verandering in de omgeving leidt tot de snelle Cessatie van tRNA en rRNA synthese. Deze beëindiging leidt het gebrek aan ribosomen, eiwit- en DNA-synthese, hoewel de biosynthese van aminozuren opgereguleerd.
Naar aanleiding van de "terugschakelen" reactie, worden de bestaande ribosomen gebruikt om nieuwe enzymen produceren om de aminozuren niet meer beschikbaar in het medium of milieu te synthetiseren. Na een periode van tijd, rRNA synthese en nieuwe ribosomen worden geassembleerd en de populatie van bacteriële cellen begint te groeien, hoewel tegen een gereduceerd tarief. De gang van zaken wordt genoemd de "stringente respons" of "stringente controle" en is een voorbeeld van de wereldwijde cellulaire regulatie en kan worden gezien als een mechanisme voor het aanpassen van de cel biosynthetische machinerie ter compensatie van de beschikbaarheid van de vereiste substraten en energiebehoeften . 8 de strenge reactie stelt dus bacteriën om snel te reageren op fluxen van nutriënten in het milieu en draagt en enhraten het vermogen van bacteriën om te concurreren in een omgeving die snel kunnen veranderen met betrekking tot voedings- en of substraat beschikbaarheid. 8-9
De stringente respons een integrale rol in genexpressie wanneer de beschikbaarheid van aminozuren, koolstof, stikstof, fosfaat en vetzuren beperkt. 8,10-14 Deze stringente respons wordt gecoördineerd door twee nucleotiden, guanosine tetrafosfaat (ppGpp) en guanosine pentaphosphate (pppGpp) meestal aangeduid samen als de alarmoon (p) ppGpp. Wanneer bijvoorbeeld aminozuren beperkte die kan leiden tot een knelpunt in de eiwitsynthese-alarmoon, guanosine 3,5- (bis) pyrofosfaat (ppGpp), afgeleid van anabolisme van guanosine 3-difosfaat 5-trifosfaat (pppGpp) accumuleert in de cel. De verandering in (p) ppGpp level is betrokken bij expressie van genen die de respons te om het gebrek aan substraten in de omgeving die direct betrokken zijn bij celgroei en -ontwikkeling overwinnent. Twee van de genen die betrokken zijn bij dit proces heten Rela en spot. RelA een ribosoom-geassocieerde (p) ppGpp synthetase dat betrokken is bij de reactie op de accumulatie van ongeladen tRNA's die het resultaat is van beperking aminozuur. SPOT functioneert als een bifunctioneel (p) ppGpp synthetase en hydrolase. De synthetase activiteit van SPOT is betrokken bij de reactie op het gebrek aan koolstof en vetzuur verhongering. 8 de RelA / Spot homologen zijn wijdverspreid in planten en bacteriën en worden aangeduid als Rsh O ElA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 een recent manuscript aangetoond dat er een specifiek Rsh eiwit betrokken bij de synthese van deze alarmones uit de bacterie Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Hier presenteren we vier biochemische pathways vastgebonden aan de functionele complementatie bepalingen. De complementering assays beschreven in dit manuscript biedt een laan naar EXPLerts toepassing van deze in vivo analyse als middel voor het identificeren en karakteriseren of enzymen die worden voorspeld onbekende / mogelijke functie (s) of leermiddelen de leer van biochemische pathways aanvulling hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: De auteurs zijn bereid om bacteriestammen en recombinante plasmiden leveren aan de integratie van functionele complementatie analyse voor onderwijsdoeleinden voor mensen die geïnteresseerd zijn te vergemakkelijken. De plasmiden die werden gebruikt om functionele complementatie-experimenten vergemakkelijken staan in tabel 1.
1. Constructie van plasmiden voor Functionele Complementatie
- Klonen van diaminopimelaatdehydrogenase Aminotransferase (dapL) voor Functionele Complementatie.
- Versterken de dapL open leeskader (ORF) van de V. spinosum en cDNAs van A. thaliana en C. reinhardtii door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de 4 deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van PfxDNA polymerase.
LET OP: De volledige omschrijving met betrekking tot de recombinante klonen van drie dapL orthologen uit de plant A. thaliana (At -dapL), de bacterie Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) en de alg Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) is eerder gepubliceerd. 2,18-20
OPMERKING: De primers die voor klonering van de dapL orthologen zijn:
Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs dapL R 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
Bij dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
Bij dapL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Kloon de PCR-fragmenten in tHij plasmide pET30A op de recombinante plasmiden te produceren, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Op dapL en pET30A :: Cr dapL met behulp van de primers, restrictie-enzymen en T4 DNA ligase.
- Kort samengevat, incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 50 ug / ml kanamycine -1 door incubatie bij 37 ° C gedurende 24 uur. 18-20
- Om het plasmide voor functionele complementatie te creëren, te verteren pET30A :: Vs dapL en pET30A :: Bij dapL plasmiden met de restrictie-enzymen Xbal en Sali en Xbal en HindIII voor de pET30A :: Cr dapL. Ligeren van de inserts in de plasmide pBAD33 met T4 DNA ligase aan het plasmide pBAD33 :: Vs dapL produceren; pBAD33 :: Bij dapL en pBAD33 :: Cr dapL.
- Incubeer 50 ng insert en 20 ngvector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 34 ug / ml kanamycine -1 door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 20
- Versterken de dapL open leeskader (ORF) van de V. spinosum en cDNAs van A. thaliana en C. reinhardtii door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de 4 deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van PfxDNA polymerase.
- Klonering van tyrosine aminotransferase (tyrB) van A. thaliana voor Functionele Complementatie.
OPMERKING: De volledige details van het kloneren van het cDNA uit A. thaliana geannoteerd door de locus labels At5g36160 is eerder beschreven. 4- Amplificeren het cDNA door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase.
OPMERKING: De primers die voor de cloning van de At5g36160 zijn:
Bij tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Kloon het fragment in het plasmide pET30A de recombinante plasmiden pET30A :: At5g36160 produceren door digestie van het PCR-fragment met EcoR1 en Sal1; ligeren van het fragment in pET30A met T4 DNA ligase zoals hieronder beschreven. 4
- De functionele complementatie plasmide, verteren het pET30A :: At5g36160 met de restrictie-enzymen XbaI en HindIII en ligeren het inzetstuk in pBAD33 met dezelfde restrictie-enzymplaatsen op de recombinante plasmide pBAD33 :: At5g3160 gebruikmaking van T4 DNA ligase produceren.
- Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer de ligatie in E. coli DH5a cellen en het scherm voor de kolonies op LB-platen, aangevuld met 34 ug / ml -1 chloramphenicol door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 4
- Amplificeren het cDNA door PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, en 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase.
- Klonen van UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat meso -2,6-diaminopimelaatdehydrogenase Ligase (Mure) van V. spinosum voor Functionele Complementatie.
LET OP: Het klonen van het MURE ORF van V. spinosum is eerder beschreven. 18- Versterken het open afleesraam met PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase. Dan klonen in het plasmide pET100D het plasmide pET100D :: Vs mure produceren.
OPMERKING: De primers die voor klonering van de Vs MURE zijn:
Vs mure F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
vsMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - Om het plasmide voor functionele complementatie te produceren, te verteren de pET100D :: Vs mure
Met de restrictie-enzymen XbaI en Sal1 en ligeren het inzetstuk in pBAD33 het recombinante plasmide pBAD33 :: Vs Muré gebruikmaking van T4 DNA ligase produceren.- Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1x ligasebuffer met 1 eenheid T4 DNA-ligase, overnacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 34 ug / ml chlooramfenicol -1 door incubatie 37 ° C gedurende 24 uur. 8
- Versterken het open afleesraam met PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid van Pfx DNA polymerase. Dan klonen in het plasmide pET100D het plasmide pET100D :: Vs mure produceren.
- Klonen van Rela / s POT (rsh) van Novosphingobium sp voor Functionele Complementatie.
Opmerking. Het klonen van de rsh uit Novosphingobium sp is eerder beschreven 17.- Versterken de rsh ORF in aanvulling op 599 nucleotiden upstpak de initiatie startplaats en 46 nucleotiden stroomafwaarts bij de beëindiging plaats met behulp van PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid Taq DNA-polymerase. Vervolgens klonen in het plasmide pCR2.1 om pCR2.1 :: Nsp rsh produceren.
- Incubeer 1 ul geamplificeerd PCR-fragment, 1 ui vector pCR2.1, 1 pl zoutoplossing en 1 pl water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 5 min en 2 pi ligatie in E. coli-cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 50 ug / ml kanamycine -1 door incuberen 37 ° C gedurende 24 uur.
OPMERKING: De primers die voor klonering van de rsh zijn:
rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - Voor functionele complementatie, verteren het plasmide pCR2.1 :: Nsp rsh met EcoR1 en ligeren het inzetstuk in de breed gastheerbereik pRK290 op de recombinante plasmide pRK290 :: Nsp produceren RSH met behulp van T4 DNA ligase.
- Incubeer 50 ng insert en 20 ng vector in 1 x ligasebuffer en 1 eenheid T4 DNA-ligase gedurende de nacht bij 17 ° C. Transformeer ligatie in E. coli DH5a cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 10 ug / ml tetracycline -1 door incuberen 37 ° C gedurende 24 uur. 17
- Incubeer 1 ul geamplificeerd PCR-fragment, 1 ui vector pCR2.1, 1 pl zoutoplossing en 1 pl water. Incubeer bij 25 ° C gedurende 5 min en 2 pi ligatie in E. coli-cellen en scherm kolonies op LB-platen aangevuld met 50 ug / ml kanamycine -1 door incuberen 37 ° C gedurende 24 uur.
- Versterken de rsh ORF in aanvulling op 599 nucleotiden upstpak de initiatie startplaats en 46 nucleotiden stroomafwaarts bij de beëindiging plaats met behulp van PCR. Met 1 cyclus bij 94 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 30 cycli van 94 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 2 minuten. Bevatten 12 pmol van elke primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM elk van de vier deoxynucleotide trifosfaten, 0,5 ng template-DNA en 1 eenheid Taq DNA-polymerase. Vervolgens klonen in het plasmide pCR2.1 om pCR2.1 :: Nsp rsh produceren.
2. Voorbereiding van de elektro-competente bacteriecellen op Transformation vergemakkelijken
Opmerking: Het preparaat van elektro-competente cellen is gebaseerd op het protocol 26 van 1,0 liter cultuur die tot een kleiner volume (bijvoorbeeld, 250 ml) worden geschaald. Houdt u er rekening mee dat dit protocol kan be gebruikt om alle stammen bevoegde die worden beschreven in dit manuscript om FCA te vergemakkelijken. 22
- Wordt geënt in 50 ml vloeibaar medium met een enkele kolonie in een kolf en groeien 's nachts, en zorg ervoor dat het genotype van de mutant te controleren alvorens te beginnen met deze stap (tabel 2).
- Op dag twee enten 1,0 L van het geschikte medium (LB E. coli mutanten en PD Novosphingobium sp) met 50 ml van de overnachtkweek en groeien tot een OD 600 tot 0,4-0,6 (log fase) bij 30 ° C.
- Oogst cellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ml steriele ijskoude pure H2O
- Centrifugeer de cellen bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 ml steriele ijskoude 10% glycerol.
- Centrifugeer de cellen bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, giet de supernatant en resuspendeer de pellet in 2,0 ml van 10% glycerol.
- Aliquot de cellen door overdracht van 50 gl in micro-centrifugebuizen en onmiddellijk bevriezen door het plaatsen van de buizen in een droogijs-ethanol bad. Bewaar de competente cellen bij -80 ° C voor elektroporatie.
3. Elektroporatie van bacteriële cellen met plasmiden Complementatie
- Voor elektroporatie, voeg 1,0 pl (10-50 ng) recombinant plasmide een aliquot (50 pl) van competente cellen en plaats op ijs gedurende 5 minuten.
- Breng het mengsel via pipetteren een elektroporatie cuvet en stel de elektroporatie apparaat naar de volgende instelling: 25 uF capaciteit, 2,5 kV en 200 ohm weerstand en zorgen voor een impuls.
- Voeg 1,0 ml van herstel media (LB) aan de elektroporatie cuvette en de overdracht met behulp van een pipet om een 15 ml conische buis. Recover met zachte rotatie gedurende 60 minuten in een schuddend incubator.
- Plate 100 pl van de cultuur van de Recozeer stap op de agarplaten te selecteren op transformanten door pipetteren en verspreiden met een steriele spreader.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de tabellen 1 en 2 te controleren alvorens te beginnen met deze stap om de antibiotica en genotypes te controleren om de juiste agar platen te maken.
4. Transformatie van AOH1 naar Functional Complementatie vergemakkelijken Met behulp van L, L-diaminopimelaatdehydrogenase Aminotransferase (dapL)
- Voor complementatie analyse transformeren AOH1 met de lege vector (pBAD33), en met de DapL expressievectoren in afzonderlijke transformatie gebeurtenissen met behulp van de elektroporatie protocol beschreven in paragraaf 3.0.
- Selecteer transformanten door uitplaten op LB agar medium aangevuld met 50 ug / ml -1 DAP en 34 ug / ml chlooramfenicol -1 en 50 ug / ml kanamycine -1.
- Test voor functionele complementatie door replica-plating kolonies door uitstrijken op LB medium met 0,2% (w / v) arabinose met en zonder 50 ug / ml -1 DAP en 34 ug / ml kanamycine -1.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur en observeer resultaten.
Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de mutant alleen in staat te groeien op DAP vrije media wanneer de dapL expressie wordt gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.
5. Transformatie van TKL-11 tot en met Functionele Complementatie vergemakkelijken met behulp van UDP-N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso -diaminopimelate Ligase (mure)
- Transformeer de mutant met de lege vector (pBAD33) en met de MURE uitdrukken vector (pBAD33 :: VsmurE) met behulp van het protocol beschreven in paragraaf 3.0.
- Plaat en selecteer transformanten op LB agar medium aangevuld met 50 ug / ml -1 thymine en 34 ug / ml chlooramfenicol -1 en incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.
- Test op complementatie door uitstrijken of uitplaten kolonies van zowel de controle en de experimentele transformaties op twee LB-medium met 0,2% (w / v) arabinose en 50 ug / ml -1 thymine.
- Incubeer een plaat bij 30 ° C en de andere bij 42 ° C gedurende 24 uur visueel beoordelen van de groei fenotype.
NB: De resultaten moeten aantonen dat de mutant in staat te groeien bij 42 ° C wanneer het MURE expressie wordt gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.
6. Transformatie van DL39 tot Functional Complementatie Faciliteren Met behulp van tyrosine Aminotransferase (tyrB)
- DL39 transformatie met ofwel pBAD33 of pBAD33 :: At5g36160 en selecteer transformanten op LB-agarplaten gesupplementeerd met 50 ug / ml -1 tyrosine, 50 ug / ml -1 fenylalanine en 34 ug / ml chloramfenicol -1 gebruik van het protocol beschreven in sectie 3,0.
- kopiestalen frame, enzovoort kolonies op een minimale (M9) medium met 50 ug / ml -1 fenylalanine en 50 ug / ml -1 tyrosine, 50 ug / ml -1 aspartaat, 50 ug / ml leucine -1, 50 ug / ml valine -1, 50 ug / ml -1 isoleucine, 10 ug / ml uracil -1 0,5% (w / v) glycerol, 0,2% (w / v) arabinose. Ook replica-plaat kolonies op platen ontbreekt fenylalanine en tyrosine door strepen dezelfde kolonie van beide platen.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 48 uur tot groeifenotype observeren.
Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de mutant alleen in staat te groeien op fenylalanine en tyrosine vrije media, alleen wanneer de tyrB gen wordt tot expressie gebracht in de mutante achtergrond in vergelijking met de controle vector alleen.
7. Transformatie van Hx699 om Functionele Complementatie van de Hypomucoid fenotype van Novosphingobium sp vergemakkelijken. Strain Hx699
Opmerking: Het resultaat moet blijken dat de hypo-mucoïde fenotype wordt aangevuld rsh wordt uitgedrukt in de achtergrond mutant in vergelijking met de controle vector alleen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bacteriële stammen die gebruikt worden in de verschillende functionele complementatie analyses worden in tabel 2.
Functionele complementatie analyse: L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL)
E. coli dubbele mutant AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) herbergt een mutatie in het gen dapE en een complete deletie van het dapD-gen (Figuur 1). Als zodanig is de mutant kan groeien tenzij DAP voorzien. Door deze mutaties wordt AOH1 auxotrofe geacht. AOH1 geschikt voor functionele complementatie analyse van L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (DapL) orthologen als DapL katalyseert de synthese van L, L-diaminopimelinezuur rechtstreeks van THDP PG en lys synthese te vergemakkelijken (Fig 1).
AOH1 mutant tot expressie DapLs kunnen groeien op L, L-DAP-vrije media aangetoond dat het recombinante enzymen kunnen THDP converteren naar L, L-DAP ontduiken dapD en dapE enzymatische stappen in de DAP / lys route (Figuur 5).
Functionele complementatie analyse: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat meso -2,6-diaminopimelaatdehydrogenase ligase (mure)
-diaminopimelate meso (m -DAP) het verknopen aminozuren in de PG van Gram-negatieve bacteriën. Het enzym UDP-N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2,6-meso -diaminopimelate ligase (Mure) vergemakkelijkt de toevoeging van m -DAP in dit proces (figuur 3A - B). E. coli mutant TKL-11 herbergt een mutatie in het MURE gen waardoor het vermogen van de mutant om te groeien bij 42 ° C vanwege het feit dat het gemuteerde enzym niet goed kunnen vouwen bij deze temperatuur.
De resultaten tonen aan dat er groei bij de permissieve temperatuur van 30 ° C door de controlegroep en het experiment. Echter, alleen de cellen die MURE (experiment) kunnen groeien bij de niet-permissieve temperatuur van 42 zijn ° C (Figuur 6).
Functionele complementatie analyse: tyrosine aminotransferase (tyrB)
Arabidopsis thaliana codeert voor een tyrosine aminotransferase die in staat is tyrosine en 4-hydroxyfenylpyruvaat, en fenylalanine en fenylpyruvaat geannoteerd door de At5g36160 (figuur 2) interconversie. 4 De E. coli mutant (DL39) herbergt een mutatie in het gen dat tyrB auxotrofe voor fenylalanine en tyrosine maakt. 24-26 Opgemerkt zij dat de auxotrofe mutant is voor de aminozuren tyrosine, fenylalanine, aspartaat, leucine, isoleucine en valine, alsook door andere mutaties. De stam is geschikt voor de functie van tyrB orthologen beoordelen omdat de tyrB ortholoog enzym uit E. coli is direct betrokken bij de synthese van tyrosine en fenylalanine eiwitsynthese vergemakkelijken.
Het resultaat moet tonen dat terwijl de DL39 mutant kan groeien op M9 wanneer tyrosine en fenylalanine zijn aanwezig. De stam die het A. thaliana (At5g36160) in staat te groeien op M9 medium dat tyrosine en fenylalanine aangetoond dat het enzym in staat is tyrosine synthetiseren van 4-hydroxyfenylpyruvaat en fenylalanine van fenylpyruvaat t (FIGUUR 7). 4
Functionele complementatie analyse: Rsh (RelA en S POT homoloog)
De Rsh eiwit uit Novosphingobium sp. (Rr2-17) bevat zowel het N-terminale fosfohydrolase en (p) ppGpp synthase domeinen, en heeft dus de voorgestelde bifunctionele rol als plek van E. coli. Dit werd bevestigd middels complementatie analyse van E. coli dubbele mutant, CF1693 die mutatie herbergt in Rela en Spot met behulp van de rsh gen uit Novosphingobium sp. Het fenotype van de Rr2-17 rsh mutant, genaamd Hx699 (rsh :: Tn5-EZ, Kan R), leidt tot een hypo-mucoïde en dit wordt veroorzaakt door een niet-functioneel rsh. De hypo-mucoïde fenotype van Hx699 werd beoordeeld door complementering gefaciliteerd door de inheemse rsh Nsp gen dat werd gekloondin het brede gastheerbereik vector pRK290. In overeenstemming met de hypo-mucoïd fenotype, de Hx699 herbergen lege vector pRK290 minder oplosbaar polysaccharide van die geproduceerd door de trans-aangevuld Hx699 (pRK290 :: rsh Nsp) en Rr2-17 bevatten pRK290 of pRK290 :: rsh Nsp tonen (figuur 8) .
Figuur 1:. De varianten van de lysine anabole routes van aspartaat die verder door de tussenliggende diaminopimelinezuur (DAP) De paden zijn geannoteerd door (A) de acyl paden, (B) de diaminopimelaatdehydrogenase (DDH) route en (C) de L , L-diaminopimelinezuur aminotransferase (DapL) route. De afkorting definities voor de enzymen zijn: aspartaat kinase (LysC), aspartaatsemialdehydedehydrogenase (ASD), tetrahydrodipicolinate synthase (DAPA), tetrahydrodipicolinate reductase (dapB), tetrahydrodipicolinate acylase (DAPD), N-acyl-2-amino-6-ketopimelate aminotransferase (DAPC), N-acyl-L, L-2, 6-diaminopimelaatdehydrogenase deacylase (dape), diaminopimelaatdehydrogenase epimerase (dapF), meso -diaminopimelate dehydrogenase (DDH), meso -diaminopimelate decarboxylase (Lysa), L, L-diaminopimelaatdehydrogenase aminotransferase (DapL), UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl- d-glutamaat. meso -2,6-diaminopimelaatdehydrogenase ligase (Mure) en lysyl-tRNA synthetase (LysU) klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Anabole routes voor de aminozuren Tyrosine en fenylalanine. (A) De bacterie (E. coli) route door het tussenproduct chorismaat en (B) de plant route door het tussenproduct arogenate. De afkortingen voor de enzymen zijn: chorismaatmutase / prephenate dehydratase (PHEA), chorismaatmutase, prephenate dehydrogenase (tyrA) en tyrosine aminotransferase (tyrB). Het schema werd goedgekeurd en gewijzigde vorm Prabhu en Hudson, 2010. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De cytoplasmatische stap van peptidoglycan synthese (A) Schematische weergave van de cytoplasmatische stap van peptidoglycan synthese.. de afkortingen de enzymen zijn: UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase (Mura), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP-N -acetylmuramate-L-alanine ligase (Murc), UDP-N-acetyl-D-muramoylalanine -glutamate ligase (Murd), UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-d-glutamaat 2,6 meso -diaminopimelate ligase (Mure), UDP-N -acetylmuramoyl-tripeptide-d-alanyl-d-alanine ligase (Murf ), D-alanine-D-alanine ligase (ddl). (B) Schematische voorstelling van een monomere eenheid van peptidoglycaan toont het disaccharide N-acetylglucosamine (GIcNAc) en N -acetylmuramic (MurNAc) verbonden via een β-1,4 glycosidische binding. Het aminozuur op positie 3 van de steel peptide is betrokken bij verknoping geven door -diaminopimelate meso (m -DAP) in de meeste Gram-negatieve bacteriën en lys meeste Gram-positieve bacteriën._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Schematisch model weergave van de stringente respons in bacteriën blootstelling aan een voedselarme omgeving induceert Rsh (RelA of spot) aan de alarmoon (p) ppGpp (guanosine pentaphosphate) anabolize door toevoeging van een fosfaatgroep aan GTP (guanosine trifosfaat). Blootstelling aan een voedingsrijke omgeving induceert de expressie van Rsh hydrolyseren (p) ppGpp die remmend. Het schema werd goedgekeurd en gewijzigd van Raskin et al., 2007. 27 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Functionele complementatie gebruikt DapL Functionele complementatie van de AOH1 E. coli mutant met L, L-diaminopimelinezuur aminotransferase (dapL) gen uit het bacterie V. spinosum (Vs dapL), de plant A. thaliana (At dapL) en de alg, C. reinhardtii (Cr dapL). De mutant die het op plasmiden, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: Voor dapL en pBAD33 :: Cr dapL werden replica-uitgeplaat op LB-agarplaten gesupplementeerd met 0,2% (w / v) arabinose met of zonder 50 ug / ml L, L - diaminopimelinezuur en werden bij 30 ° C gedurende 24 uur. Het schema werd goedgekeurd en gewijzigd van Nachar et al., 2012. 18 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Functionele complementatie behulp Mure Functionele complementatie van de TKL-11 E. coli mutant met de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamaat meso -2,6-diaminopimelaatdehydrogenase ligase (Mure) gen van V. spinosum. De mutante plasmiden herbergen de BAD33 of pBAD33 :: VsmurE werden gekweekt in LB medium tot een OD 600 van 0,1 en werden serieel verdund tot 10 -1, -2 10 en 10 -3 behulp 0,85% (w / v) zoutoplossing . 5 pl verschillende verdunningen werden replica-uitgeplaat op LB medium aangevuld met 0,2% (w / v) en arabinose werden gekweekt geëvalueerd bij 30 ° C en 42 ° C gedurende 24 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Functionele complementatie van de DL39 E. coli met een tyrosine aminotransferase gen geannoteerd door de locus tag At5g36160 van A. thaliana. De mutante plasmiden pBAD33 of pBAD33 :: At5g36160 werden geselecteerd op LB-agarplaten gesupplementeerd met 50 ug / ml -1 tyrosine, 50 ug / ml -1 fenylalanine en 34 ug / ml chlooramfenicol -1. De stam werd gekweekt in LB-bouillon tot een OD OD 600 van 1,0 en werden serieel verdund tot 10 -1, -2 10 en 10 -3 behulp 0,85% (w / v) zoutoplossing. 5 pl van de verschillende verdunningen werden vervolgens replica-uitgeplaat op M9-agarplaten gesupplementeerd met 50 ug / ml -1 fenylalanine en 50 ug / ml -1 tyrosine, 0,5% (w / v) glycerol, 0,2% (w / v) arabinose, 50 ug / ml -1 aspartaat, 50 ug / ml leucine -1, 50 ug / ml -1 valine, 50 ug / ml -1 isoleucine, 10 ug / ml uracil -1, alsmede op platen weinig fenylalanine en tyrosine en werden gedurende 48 uur geïncubeerd bij 30 ° C. Het schema werd goedgekeurd en gewijzigde vorm Prabhu en Hudson, 2010. 4 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Functionele complementatie van de hypomucoid fenotype van de Novosphingobium sp. mutante stam Hx699. Thij wildtype Novosphingobium sp. (Rr2-17) en de mutante stam Hx699 werden met pRK290 of pRK290 :: rsh Nsp. De stammen werden in een "X" streaked en werden verder gekweekt op PD-agar bij 30 ° C ten minste 4 dagen voor de fenotypes observeren. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| complementering plasmiden | Antibioticaresistentiemerkers | Citaat |
| pBAD33 | Cmr | 21 |
| pBAD33 :: At dapL | Cmr | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | Cmr | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | Cmr | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | Cmr | 4 |
| pBAD33 :: Vs mure | Cmr | 18 |
| pRK290 | tet r | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | tet r | 17 |
Tabel 1: Functionele complementatie plasmide gebruikt in deze studie Lijst van gebruikte plasmiden voor functionele complementatie analyse.. Cm R en R duiden Tet chlooramfenicol en tetracycline resistentie respectievelijk.
| Strain naam | Organisme | Genotype | fenotype | Bron |
| AOH1 | E coli | Δ dapD :: Kan2, dapE6 | Auxotrofe voor diaminopimelaatdehydrogenase | Hudson Laboratory |
| TKL-11 * | E coli | thr-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, zijn-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-1, deoC1 | Groei fenotype waren de mutant groeit bij 30 ° C maar niet een 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E coli | LAM-, aspC13, FNR-25, rph-1 ilvE12, tyrB507 | Auxotrofe de aminozuren; tyrosine, fenylalanine, leucine, isoleucine en valine | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Wild-type) - | Hyper-mucoïde | savka Laboratory | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-mucoïde | savka Laboratory |
Tabel 2:. Bacteriestammen gebruikt in deze studie Lijst van bacteriestammen met respectievelijk genotypen en fenotypen die in deze studie. Let stammen (TKL-11 en DL39) aangeduid met asterisk direct van de Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel van de cursussen die integraal zijn voor de Biotechnologie en Moleculaire Bioscience curriculum aan het Rochester Institute of Technology hebben een laboratorium component in aanvulling op de lezing deel van de cursus. Het curriculum voor het academisch jaar 2014-2015 een totaal van 48 cursussen, waarvan 29 bevatten een laboratorium component die ongeveer 60% vertegenwoordigen. Een van deze cursus is Fundamentals of Plant Biochemie en Pathologie (FPBP), een gemengde lezing / practicum en Bioseparations: Principles and Practices (BPP), een laboratorium gebaseerde cursus.
Het laboratorium onderdeel van elke cursus is bedoeld om de lezing materialen te versterken. Zo worden biochemische routes en de stofwisseling sterk benadrukt in FPBP en BPP. Enkele onderwerpen zijn aminozuurmetabolisme, peptidoglycan biosynthese installatie secundair metabolisme, bacteriële respons op omgevingsveranderingen niches, onder anderen. De auteurs hebben functionele complem geïntegreerdentatie als laboratorium oefeningen in beide cursussen om het begrijpen van metabole routes die worden besproken in het college en of pre-laboratorium presentaties te versterken. Vier voorbeelden van het gebruik van functionele complementatie-experiment om de functie van genen in biochemische routes van lys, PG, tyr, phe en de stringente respons bacteriën analyseren besproken.
Er zijn verschillende redenen waarom de auteurs deze experimentele module in hun cursussen hebben geïntegreerd. Ten eerste, de blootstelling aan functionele complementatie analyse is een uitstekend hulpmiddel om te versterken of onderwerpen die gerelateerd zijn aan de genetica, evolutie, genomics, bioinformatica en biochemie te introduceren. Anderzijds het experiment is gemakkelijk en kan op een cursus laboratoriumomgeving. Alle reagentia die worden gebruikt zijn veilig en bacteriën die gebruikt worden aangeduid als bioveiligheidsniveau 1 en zijn niet pathogeen. Als zodanig, de auteurs bereid reagentia zoals plasmiden en ba makencterial stammen beschikbaar voor iedereen die is geïnteresseerd in het opnemen van functionele complementatie als een deel van hun ervaring met lesgeven. Opgemerkt wordt dat twee van de bacteriestammen (TKL-11 en DL39) rechtstreeks bij de Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) werden verkregen.
Het is belangrijk op te merken dat er verschillende kritische stappen om de functionele complementatie protocol. De eerste stap is om ervoor te zorgen dat de mutant (s) kunnen worden gekweekt, voordat u hieraan experimenten. De reden is dat volgens Tabel 2, zijn er verschillende genotypes geassocieerd met elke mutant. Om de mutant competente cellen te bereiden voor het experiment groeien, groeien proberen de mutant met of zonder de vereiste chemicaliën en temperatuur of eisen aan de PG MURE mutant. Dit is ook een leermoment omdat het zal blijken dat de mutant authentieke voordat experimenten.
Hetdient te worden opgemerkt dat, hoewel dit een uitstekend hulpmiddel om de functie (s) van genen testen, het niet altijd door verschillende factoren, zoals codongebruik waarin gen (en) plaats niet goed kan worden vertaald door het ontbreken van de juiste tRNAs in de mutant organisme. Dit kan echter worden omzeild door codonoptimalisering van het open leesraam of cDNA gedurende de kloneringsstap die gewoonlijk wordt uitgevoerd door het synthetiseren van het betreffende gen door verandering van de nucleotiden aan het codongebruik van de mutant (en) passen. Een ander probleem is dat sommige eukaryote eiwitten vereisen post-translationele modificaties voor de functie. Posttranslationele modificatie is geen kenmerk van bacteriën en als zodanig zou men niet in staat om deze techniek te gebruiken om de functie (s) van genen via bacteriemutanten testen.
De betekenis van de techniek die we benadrukken in de cursussen is dat FCA is een uitstekende manier om te testen om de functie van genen in vivo. Karakterisering van enzymen zijn meestal gebaseerd op in vitro studies waarbij het enzym is gezuiverd en traditionele enzymatische assays worden uitgevoerd. 29 Ook traditionele enzymatische assays zijn goed te meten of detecteren van enzymatische activiteit, kan men vaak "force voer" het enzym met commercieel verkrijgbare substraten die niet puur of natuurlijk voor het enzym. 30 een in vivo systeem, zoals FCA een meer authentieke bewijs omtrent de functie van genen aangezien zij actief is onder fysiologische omstandigheden zoals appose in vitro die gewoonlijk niet onder fysiologische omstandigheden. 2 gegeven gebrek aan informatie over de functies van vele genen en dat de meeste annotaties zijn gebaseerd op prognoses, 31 beheersen van deze techniek experimenten om de functies van vele genen die vaag blijven of die welke momenteel worden beschouwd als mogelijke functies in de verschillende hebben helderen vergemakkelijken publieke databanken.
jove_content "> Een van de problemen met de techniek die vaak wordt ondervonden in de bereiding van de competente cellen. Men moet ervoor zorgen dat de cellen goed bereid zodat er voldoende cellen te transformeren behalve ervoor te zorgen dat de cellen correct met water en glycerol brugvorming te voorkomen tijdens het elektroporatie proces gewassen. Men moet ook bewust van het fenotype van de mutant door ervoor te zorgen dat de cellen worden gekweekt met de juiste chemische of op de juiste temperatuur voor de initiële groei bevorderen de mutant en ook voor de functionele complementatie analyse.Zodra deze techniek beheerst, kunnen onderzoekers functionele complementatie assay gebruikt om de functie van genen zolang er een geschikte mutatie in een organisme beschikbaar om deze analyse te vergemakkelijken beoordelen. Houd er rekening mee dat het protocol in dit manuscript beschrijft het gebruik van bacteriën. Echter, andere organismen zoalsplanten en zoogdiercellen, onder andere, kunnen worden gebruikt om de functie van genen te evalueren. 32-33 Men zou alleen moeten ervoor zorgen dat de juiste vectoren worden gebruikt als aanvulling op het optimaliseren van de transformerende en of transfectie van de cellen om het experiment te vergemakkelijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
AOH en MAS erkent het College of Science en de Thomas H. Gosnell School of Life Sciences aan het Rochester Institute of Technology voor ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) toe te kennen aan AOH MCB-1120541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S.
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y.
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
