Summary
Valideringen af enzymatiske aktiviteter i forbindelse med biokemiske veje kan belyses ved hjælp af funktionel komplementering analyse (FCA). Beskrevet i dette manuskript er FCA-analysen viser den enzymatiske aktivitet af enzymer involveret i metabolismen af aminosyrer, bakteriel strenge respons og bakteriel peptidoglycan biosyntese.
Abstract
Funktionel komplementering assay (FCA) er en in vivo assay, der er almindeligt anvendt til at belyse funktionen / rolle af gener / enzymer. Denne teknik er meget almindelig i biokemi, genetik og mange andre discipliner. En samlet oversigt over den teknik til at supplere undervisningen i biokemiske veje vedrørende aminosyrer, peptidoglycan og den bakterielle strenge respons rapporteret i dette manuskript. To cDNA'er fra modellen planteorganisme Arabidopsis thaliana, der er involveret i metabolismen af lysin (L, L-diaminopimelat aminotransferase (dapL) og tyrosin-aminotransferase (tyrB) involveret i metabolismen af tyrosin og phenylalanin er fremhævet. Derudover bakterielle peptidoglycan anabolske pathway er fremhævet gennem analyse af UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat- meso -2,6-diaminopimelat ligase (Mure) genet fra bakterien Verrucomicrobium spinosum involveret i indlægget-linking af peptidoglycan. Den bakterielle strenge reaktion er også rapporteret gennem analyse af rsh (r ela / s Pot h omolog) bifunktionel gen ansvarlig for en hyper-mucoid fænotype i bakterien Novosphingobium sp. Fire eksempler på FCA præsenteres. Videoen vil fokusere på tre af dem, nemlig lysin, peptidoglycan og stringent svar.
Introduction
Funktionel komplementering i forbindelse med afdækning funktion (er) / rolle (r) af et gen defineres som evnen af en særlig homologe eller ortologe gen til at gendanne en bestemt mutant med en observerbar fænotype til vildtype-tilstand, når den homologe eller ortologe gen indføres i cis eller trans i mutanten baggrund. Denne teknik er blevet meget anvendt til at isolere og identificere den funktion (er) / rolle (r) af mange gener. Et særligt eksempel er isoleringen og identifikationen af orotidin-5-phosphat-decarboxylase fra Candida albicans under anvendelse af ura3 mutant af S. cerevisiae og pyrF mutant af E. coli. 1 Forfatterne har brugt denne teknik til at belyse funktionen af gener, der er involveret i metabolismen af aminosyrer, peptidoglycan og stringente reaktion i deres forskningsprogrammer og har indarbejdet denne teknik i deres undervisningsforløb i Biotechnology og Molekylær Bioscience (BMB) program på Rochester Institute of Technology (RIT).
Forfatterne underviser Fundamentals of Plantebiokemi / Patologi (FPBP) (Hudson) og Bioseparations: principper og praksis (BPP) (Hudson / Savka), to øverste division elektiv laboratorium baserede kurser i BMB Program på RIT. Da nogle af de emner, der drøftes i kurserne er tilknyttet deres forskningsinteresser, har forfatterne indarbejdet mange af de teknikker og eksperimentelle værktøjer, der bruges i deres respektive forskningsprogrammer ind i disse to laboratorie-baserede kurser. Et sådant eksempel er funktionel komplementering som laboratorium øvelse at styrke undervisningsmateriale vedrørende aminosyre metabolisme fra planter, peptidoglycan og strenge svar stofskifte fra bakterier.
Tre af aminosyre-veje fra planter, der diskuteres i FPBB kurset er, at lysin (Lys), tyrosin(Tyr) og phenylalanin (phe). Lys pathway er fremhævet i løbet på grund af betydningen af den aminosyre som en essentiel aminosyre for alle dyr navnlig mennesker siden dyr mangler den genetiske maskineri til at syntetisere Lys de novo. Derudover blev det for nylig opdaget, at planter anvender en vej for syntese af lys, der er væsentlig forskellig fra den for bakterier. Denne opdagelse blev delvist lettes ved funktionel komplementering af E. coli diaminopimelat (DAP) mutanter ved anvendelse af en gen, der koder for enzymet L, L-diaminopimelat aminotransferase (DapL) fra modellen planten Arabidopsis thaliana. 2 Varianten veje til syntese af lys gennem den mellemliggende diaminopimelat er vist i figur 1. Ud syntesen af lys letter gennem aspartat afledte familie af aminosyrer, som er stærkt reguleret. 3 Ud over deres betydning på protein Synthesis, de veje for tyr og phe er fremhævet givet deres betydning i at betjene som precursorforbindelser for anabolismen af phenylpropanoid forbindelser involverede syntesen af plante forsvar forbindelser såsom:. alkaloider, ligniner, flavonoider, isoflavonoider, hydroxykanelsyre blandt andre 4 tyr og phe veje fremhæves også at vise forskellen mellem anlægget og bakterielle anabolske veje. I bakterier er enzymet tyrosin-aminotransferase (TyrB) involveret i anabolisme af både aminosyrer, hvorimod i planter, enzymet primært involveret i katabolisme af tyr og phe og er ikke involveret i anabolisme af disse aminosyrer. (Figur 2). 4
Forskellene mellem Gram positive og Gram-negative bakterier vedrørende strukturen af peptidoglycan (PG) er fremhævet i FPBP kurset. PG af Gram-negative bakterier er af interesse med hensyn plantepatologi baseret på det faktum, at de flesteplantepatogener er Gram negative. En nylig gennemgang vedrørende de 10 bakterielle phyto-patogener afslørede, at alle er Gram negative. Bakterierne var fra slægterne:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya og Pectobacterium 5 En af de kemiske forskelle ved sammenligning PG stilken af gramnegative og grampositive bakterier er forskellen mellem den tværbindende amino syrer med begge typer. Det første skridt for at forskellige tværbinding af PG forekommer i den cytoplasmatiske trinnet PG anabolismen og lettes af enzymet UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat- meso -2,6-diaminopimelat ligase (MURE) (figur 3A). MURE katalyserer tilsætningen af en særlig diaminforbindelse på tredje position af peptidet stilken. 6 I de fleste Gram-negative bakterier, næstsidste lys precursor, meso -diaminopimelate (
I Bioseparations: principper og praksis (BPP) Selvfølgelig er forskellene mellem åbne og lukkede systemer til dyrkning af bakterier og hvordan næringsstoffer niveauer vil ændre sig betydeligt i begge systemer på grund af miljøændringer diskuteres. Disse begivenheder er knyttet til lovændringer kaldes en "geare ned" eller "skifte op" udløst af sult eller en tilstrækkelig forsyning af aminosyrer eller energi. "Shift ned" reaktion kan opstå, når en bakteriekultur overføres fra en rig og kompleks medium til et kemisk defineret medium med en enkelt kulstof kilde. Denne ændring i miljøet fører til den hurtige Cessation af tRNA og rRNA syntese. Dette ophør resulterer i manglende ribosomer, proteiner og DNA-syntese, selv om biosyntesen af aminosyrer opreguleres.
Efter "geare ned" svar, er de eksisterende ribosomer bruges til at producere nye enzymer til at syntetisere de aminosyrer, der ikke længere findes i mediet eller miljø. Efter en periode, er rRNA syntese og nye ribosomer samlet og populationen af bakterieceller begynder at vokse, selv på en reduceret sats. Forløbet betegnes "stringente reaktion" eller "streng kontrol" og er et eksempel på global cellulær regulering og kan opfattes som en mekanisme til justering af cellens biosyntetiske maskineri for at kompensere for tilgængelighed af de nødvendige substrater og energibehov . 8 den strenge respons således gør det muligt for bakterier til at reagere hurtigt på fluxe af næringsstoffer i miljøet og bidrager og enhrelser evne bakterier til at konkurrere i miljøer, der kan ændre sig hurtigt med hensyn til næringsstoffer og eller substrat tilgængelighed. 8-9
Den stringente reaktion har en integrerende rolle i genekspression, når tilgængeligheden af aminosyrer, carbon, nitrogen, phosphat og fedtsyrer er begrænset. 8,10-14 Denne strenge reaktion koordineres af to nukleotider, guanosin tetraphosphat (ppGpp) og guanosin pentaphosphat (pppGpp) almindeligvis betegnet sammen som alarmone (p) ppGpp. For eksempel, når aminosyrer begrænset hvilket kan føre til en flaskehals i proteinsyntese-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrophosphat (ppGpp), afledt fra anabolisme af guanosin-3-diphosphat 5-triphosphat (pppGpp) akkumulerer i cellen. Ændringen i (p) ppGpp niveau er involveret i ekspression af gener, der regulerer reaktion afhjælpe manglen på substrater i miljøet, der er direkte involveret i cellevækst og udviklit. To af de gener, der er involveret i denne proces kaldes relA og Spot. RelA er et ribosom-forbundet (p) ppGpp-syntetaseaktivitet, der er involveret i responset til akkumulering af ikke-ladede tRNA'er, som er resultatet af aminosyren begrænsning. Spot fungerer som et bifunktionelt (p) ppGpp-syntetaseaktivitet og hydrolase. Den syntetaseaktivitet SPOT er involveret i reaktion på den manglende kulstof og fedtsyre sult. 8 RelA / Spot homologer er udbredt i planter og bakterier og betegnes som Rsh for R ELA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 en nylig manuskript viste, at der er en specifik Rsh protein involveret i syntesen af disse alarmones fra bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Her præsenterer vi fire biokemiske veje bundet til de funktionelle komplementeringsgrupper assays. Komplementeringen analyser skitseret i dette manuskript giver en avenue at EXPLmalm anvendelse af denne in vivo-assay som et middel til at identificere og karakterisere eller enzymer, der forudsiges at have ukendt / formodede funktion (er) eller som pædagogiske værktøjer til at supplere undervisningen i biokemiske veje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Forfatterne er villige til at give bakteriestammer og rekombinante plasmider for at lette indarbejdelsen af funktionelle komplementering analyse til undervisningsbrug for personer, der er interesserede. Plasmiderne, der blev brugt til at lette funktionelle komplementerings- eksperimenter er anført i tabel 1.
1. Konstruktion af plasmider for Funktionel komplementering
- Kloning af diaminopimelat aminotransferase (dapL) for Funktionel komplementering.
- Amplificere dapL åben læseramme (ORF) fra V. spinosum og cDNA'er fra A. thaliana og C. reinhardtii ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM af hver af de 4 deoxynucleotidtriphosphater, og 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af PfxDNA-polymerase.
BEMÆRK: komplet beskrivelse vedrørende den rekombinante kloning af tre dapL ortologer fra planten A. thaliana (Hos -dapL), bakterien Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) og algen Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) tidligere har været offentliggjort. 2,18-20
BEMÆRK: De anvendte primere til kloningen af dapL ortologer er som følger:
Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs dapL R 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
På dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
På dapL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Klone PCR-fragmenter i than plasmid pET30A at producere de rekombinante plasmider, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: At dapL og pET30A :: Cr dapL hjælp af primere, restriktionsenzymer og T4 DNA ligase.
- Kort fortalt inkuberes 50 ng insert og 20 ng af vektor i 1 x ligasepuffer og 1 enhed T4 DNA-ligase natten over ved 17 ° C. Omdan ligering ind i E. coli DH5a-celler og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 50 ug / ml-1 kanamycin ved inkubering ved 37 ° C i 24 timer. 18-20
- At skabe plasmidet til funktionel komplementering, fordøje pET30A :: Vs dapL og pET30A :: At dapL plasmider med restriktionsenzymer XbaI og Sall og XbaI og HindIII for pET30A :: Cr dapL. Ligere indsatserne i plasmidet pBAD33 anvendelse af T4 DNA-ligase til frembringelse af plasmiderne pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: På dapL og pBAD33 :: Cr dapL.
- Inkuber 50 ng insert og 20 ngaf vektor i 1 x ligasepuffer og 1 enhed T4 DNA-ligase natten over ved 17 ° C. Omdan ligering ind i E. coli DH5a-celler og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 34 ug / ml-1 kanamycin ved inkubering 37 ° C i 24 timer. 20
- Amplificere dapL åben læseramme (ORF) fra V. spinosum og cDNA'er fra A. thaliana og C. reinhardtii ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM af hver af de 4 deoxynucleotidtriphosphater, og 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af PfxDNA-polymerase.
- Kloning af Tyrosin aminotransferase (tyrB) fra A. thaliana for Funktionel komplementering.
BEMÆRK: De fuldstændige oplysninger om kloning af cDNA fra A. thaliana kommenteret af locus tags At5g36160 er tidligere blevet beskrevet. 4- Amplificere cDNA'et ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater og 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af Pfx DNA polymerase.
BEMÆRK: De anvendte primere til cloning af At5g36160 er som følger:
På tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Klone fragmentet i plasmidet pET30A at producere de rekombinante plasmider pET30A :: At5g36160 ved fordøjelse af PCR-fragmentet med EcoR1 og Sal1; ligere i fragmentet i pET30A anvendelse af T4 DNA ligase som beskrevet nedenfor. 4
- At skabe den funktionelle komplementering plasmid, fordøje pET30A :: At5g36160 med restriktionsenzymerne Xbal og HindIII, og liger indsatsen ind pBAD33 anvendelse af de samme restriktionsenzymsites til at producere det rekombinante plasmid pBAD33 :: At5g3160 anvendelse af T4 DNA-ligase.
- Inkuber 50 ng insert og 20 ng af vektor i 1 x ligasepuffer og 1 enhed T4 DNA-ligase natten over ved 17 ° C. Omdan ligering ind i E. coli DH5a-celler og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 34 ug / ml-1 chloramphenicol ved inkubering 37 ° C i 24 timer. 4
- Amplificere cDNA'et ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater og 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af Pfx DNA polymerase.
- Kloning af UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat- meso -2,6-diaminopimelat Ligase (Mure) fra V. spinosum for Funktionel komplementering.
BEMÆRK: Kloningen af Mure ORF fra V. spinosum er tidligere blevet beskrevet. 18- Amplificere åbne læseramme ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af Pfx DNA polymerase. Derefter klone i plasmidet pET100D at producere plasmidet pET100D :: Vs MURE.
BEMÆRK: De anvendte primere til kloningen af Vs MURE er som følger:
Vs MURE F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
vsMURE R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - At producere plasmidet til funktionel komplementering, fordøje pET100D :: Vs MURE
Med restriktionsenzymerne Xbal og Sal1 og liger indsatsen ind pBAD33 at producere det rekombinante plasmid pBAD33 :: Vs MURE anvendelse af T4 DNA-ligase.- Inkuber 50 ng insert og 20 ng af vektor i 1 x ligasepuffer, sammen med 1 enhed T4 DNA-ligase natten over ved 17 ° C. Omdan ligering ind i E. coli DH5a-celler og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 34 ug / ml-1 chloramphenicol ved inkubering 37 ° C i 24 timer. 8
- Amplificere åbne læseramme ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 0,5 ng template-DNA og 1 enhed af Pfx DNA polymerase. Derefter klone i plasmidet pET100D at producere plasmidet pET100D :: Vs MURE.
- Kloning af relA / s Pot (rsh) fra Novosphingobium sp for Funktionel komplementering.
BEMÆRK:. Kloning af rsh fra Novosphingobium sp tidligere er blevet beskrevet 17.- Forstærk rsh ORF foruden 599 nukleotider upstpakke af indledningen startstedet og 46 nukleotider nedstrøms ved afslutningen sted ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 0,5 ng template-DNA og 1 enhed Taq-DNA-polymerase. Derefter klone i plasmidet pCR2.1 at fremstille pCR2.1 :: Nsp rsh.
- Inkuber 1 pi amplificeret PCR-fragment, 1 pi pCR2.1 vektor, 1 pi saltopløsning og 1 pi af vand. Inkuber ved 25 ° C i 5 minutter og 2 pi ligering ind i E. coli celler, og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 50 ug / ml -1 kanamycin ved at inkubere 37 ° C i 24 timer.
BEMÆRK: De anvendte primere til kloningen af rsh er som følger:
rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - Til funktionel komplementering, fordøje plasmidet pCR2.1 :: Nsp RSH med EcoR1 og liger indsatsen ind i bredt værtsområde pRK290 at producere det rekombinante plasmid pRK290 :: Nsp RSH anvendelse af T4 DNA-ligase.
- Inkuber 50 ng insert og 20 ng af vektor i 1 x ligasepuffer og 1 enhed T4 DNA-ligase natten over ved 17 ° C. Omdan ligering ind i E. coli DH5a-celler og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 10 ug / ml-1 tetracyclin ved inkubering 37 ° C i 24 timer. 17
- Inkuber 1 pi amplificeret PCR-fragment, 1 pi pCR2.1 vektor, 1 pi saltopløsning og 1 pi af vand. Inkuber ved 25 ° C i 5 minutter og 2 pi ligering ind i E. coli celler, og en skærm til kolonier på LB-plader suppleret med 50 ug / ml -1 kanamycin ved at inkubere 37 ° C i 24 timer.
- Forstærk rsh ORF foruden 599 nukleotider upstpakke af indledningen startstedet og 46 nukleotider nedstrøms ved afslutningen sted ved PCR. Brug 1 cyklus ved 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol af hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 0,5 ng template-DNA og 1 enhed Taq-DNA-polymerase. Derefter klone i plasmidet pCR2.1 at fremstille pCR2.1 :: Nsp rsh.
2. Udarbejdelse af Electro-kompetente bakterieceller at lette Transformation
BEMÆRK: Fremstillingen af elektro-kompetente celler er baseret på protokollen 26 til 1,0 I kultur, der kan skaleres ned til et mindre volumen (dvs. 250 ml). Bemærk, at denne protokol kan be bruges til at gøre alle de stammer kompetent der er beskrevet i dette manuskript at lette FCA. 22
- Podes 50 ml flydende medium med en enkelt koloni i en kolbe og vokse i løbet af natten, og sørg for at tjekke genotypen af mutant, før de påbegynder dette trin (tabel 2).
- På dag to, pode 1,0 I det passende medium (LB for E. coli-mutanter og PD for Novosphingobium sp) med 50 ml af natten over kultur, og vokse til en OD 600 til 0,4-0,6 (log fase) ved 30 ° C.
- Harvest celler ved centrifugering ved 5000 xg i 15 minutter ved 4 ° C, dekanter supernatanten, og pellet resuspenderes i 500 ml sterilt iskoldt ren H 2 O.
- Centrifuger cellerne ved 5000 xg i 20 minutter ved 4 ° C, dekanter supernatanten og resuspender pellet i 250 ml sterilt iskold 10% glycerol.
- Centrifuger cellerne ved 5000 xg i 20 minutter ved 4 ° C, dekanteres supernatant, og pellet resuspenderes i 2,0 ml 10% glycerol.
- Alikvot cellerne ved at overføre 50 pi i mikro-centrifugerør og straks nedfryses ved at anbringe rørene i et tøris-ethanol-bad. Opbevar kompetente celler ved -80 ° C i elektroporation.
3. Elektroporation af bakterieceller med komplementering plasmider
- For elektroporation, tilsættes 1,0 pi (10-50 ng) af rekombinant plasmid til en portion (50 pi) af kompetente celler og anbring på is i 5 min.
- Overfør blandingen via pipettering til en elektroporation cuvette og sæt elektroporationsapparat til følgende indstilling: 25 uF kapacitans, 2,5 kV og 200 ohm modstand og levere en puls.
- Tilføj 1,0 ml genoprettelsesmedier (LB) til elektroporation kuvetten og overførsel ved hjælp af en pipette til en 15 ml konisk rør. Recover under forsigtig rotation i 60 minutter i en rysteinkubator.
- Plate 100 pi af kultur fra Recomeget skridt på agarpladerne til at vælge for transformanter ved pipettering og sprede ved hjælp af en steril spreder.
BEMÆRK: Sørg for at kontrollere tabel 1 og tabel 2, før de påbegynder dette trin for at kontrollere antibiotika og genotyper at gøre de rigtige agarplader.
4. Transformation af AOH1 at lette Funktionel komplementering Brug L, L-diaminopimelat aminotransferase (dapL)
- For komplementeringsanalyse, transformere AOH1 med den tomme vektor (pBAD33), og med de DapL ekspressionsvektorer i separate transformationsbegivenheder hjælp af elektroporation proceduren skitseret i afsnit 3.0.
- Vælg transformanter ved udpladning på LB-agar-medium suppleret med 50 ug / ml -1 DAP og 34 ug / ml-1 chloramphenicol og 50 pg / ml-1 kanamycin.
- Test for funktionel komplementering af replika-plating kolonier ved udstrygning på LB migdium med 0,2% (vægt / volumen) arabinose med og uden 50 ug / ml -1 DAP og 34 ug / ml-1 kanamycin.
- Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 24 timer og observere resultater.
BEMÆRK: Resultatet skal vise, at mutanten er kun i stand til at vokse på DAP frie medier kun, når dapL genet udtrykkes i den mutante baggrunden i forhold til vektoren kun kontrol.
5. Transformation af TKL-11 til lette Funktionel komplementering Brug UDP N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate Ligase (MURE)
- Transformer mutant med den tomme vektor (pBAD33) og med Mure udtrykke vektor (pBAD33 :: VsmurE) ved anvendelse af protokollen beskrevet i afsnit 3.0.
- Plate og vælge transformanter på LB-agar-medium suppleret med 50 ug / ml-1 thymin og 34 ug / ml-1 chloramphenicol og Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 24 timer.
- Test for komplementation ved udstrygning eller plettering kolonier fra både kontrollen og de eksperimentelle transformationer på to LB-medium plus 0,2% (vægt / volumen) arabinose og 50 ug / ml-1 thymin.
- Inkuber én plade ved 30 ° C og den anden ved 42 ° C i 24 timer til visuelt vurdere væksten fænotype.
BEMÆRK: Resultaterne skal vise, at mutanten er i stand til at vokse ved 42 ° C, når MURE genet udtrykkes i mutanten baggrunden i forhold til vektoren kun kontrol.
6. Transformation af DL39 at lette Funktionel komplementering Brug Tyrosin aminotransferase (tyrB)
- Omdan DL39 med enten pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160 og vælge transformanter på LB-agarplader suppleret med 50 ug / ml-1 tyrosin, 50 ug / ml-1 phenylalanin og 34 ug / ml-1 chloramphenicol ved anvendelse af protokollen beskrevet i afsnit 3.0.
- Replica-plate kolonier på minimal (M9) medier med 50 ug / ml-1 phenylalanin og 50 ug / ml-1 tyrosin, 50 ug / ml-1 aspartat, 50 ug / ml-1 leucin, 50 ug / ml -1 valin, 50 ug / ml-1 isoleucin, 10 ug / ml -1 uracil 0,5% (vægt / vol) glycerol, 0,2% (vægt / volumen) arabinose. Også replika-plade kolonier på plader, der mangler phenylalanin og tyrosin ved at udstryge den samme koloni af begge plader.
- Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 48 timer for at observere vækst fænotype.
BEMÆRK: Resultatet skal vise, at mutanten er kun i stand til at vokse på phenylalanin og tyrosin frie medier, kun, når tyrB-genet udtrykkes i den mutante baggrunden i forhold til vektoren kun kontrol.
7. Transformation af Hx699 at lette Funktionel komplementering af den Hypomucoid Fænotype af Novosphingobium sp. Strain Hx699
BEMÆRK: Resultatet skulle vise, at hypo-mucoid fænotype suppleres når rsh udtrykkes i mutant baggrunden i forhold til vektoren kun kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bakteriestammer, der anvendes i de forskellige funktionelle komplementerings- analyser er anført i tabel 2.
Funktionel komplementering analyse: L, L-diaminopimelat aminotransferase (dapL)
E. coli dobbeltmutanten AOH1 (Δ dapD :: KAN2, dapE6) indeholder en mutation i dapE-genet og en komplet deletion af dapD-genet (figur 1). Som sådan mutanten er ude af stand til at vokse medmindre DAP er tilvejebragt. På grund af disse mutationer, er AOH1 anses auxotrof. AOH1 er egnet til funktionel komplementering analyse af L, L-diaminopimelat aminotransferase (DapL) ortologer som DapL katalyserer syntesen af L, L-diaminopimelat direkte fra THDP at lette PG og Lys syntese (figur 1).
AOH1 mutant udtrykke DapLs er i stand til at vokse på L, L-DAP-frie medier viser, at de rekombinante enzymer er i stand til at konvertere THDP til L, L-DAP omgå dapD og dapE enzymatiske trin i DAP / lys-vejen (figur 5).
Funktionel komplementering analyse: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat- meso -2,6-diaminopimelat ligase (MURE)
meso -diaminopimelate (m -DAP) er den tværbindende aminosyre i PG gramnegative bakterier. Enzymet UDP- N -acetylmuramoylalanyl- D-glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate ligase (Mure) letter tilsætningen af m -DAP i denne proces (figur 3A - B). E. coli mutant TKL-11 huser en muførelsen i MURE genet, som resulterer i evnen til mutanten at vokse ved 42 ° C på grund af det faktum, at det muterede enzym er ikke i stand til at folde korrekt ved denne temperatur.
Resultaterne vil vise, at der er vækst på permissive temperatur på 30 ° C ved både kontrol- og eksperimentet. kun de celler, der udtrykker Mure (eksperiment), vil imidlertid være i stand til at vokse ved den ikke-permissive temperatur på 42 ° C (figur 6).
Funktionel komplementering analyse: Tyrosin aminotransferase (tyrB)
Arabidopsis thaliana koder for en tyrosin-aminotransferase, der er i stand til at interconvert tyrosin og 4-hydroxyfenylpyruvatdioxygenase, og phenylalanin og phenylpyruvate kommenteret af At5g36160 (figur 2). 4 E. colJeg mutant (DL39) indeholder en mutation i tyrB gen, som gør auxotrof for phenylalanin og tyrosin. 24-26 Det skal bemærkes, at mutanten er auxotrof for aminosyrer tyrosin, phenylalanin, aspartat, leucin, isoleucin og valin, såvel skyldes andre mutationer. Stammen er velegnet til at vurdere funktionen af tyrB ortologer siden TyrB enzymet ortolog fra E. coli er direkte involveret i syntesen af tyrosin og fenylalanin at lette proteinsyntese.
Resultatet skal vise, at mens DL39 mutanten er i stand til at vokse på M9 kun når tyrosin og phenylalanin leveres. Imidlertid stammen udtrykker A. thaliana (At5g36160) er i stand til at vokse på M9 medier, der mangler tyrosin og phenylalanin demonstrerer, at enzymet er i stand til at syntetisere tyrosin fra 4-hydroxyfenylpyruvatdioxygenase, og phenylalanin fra phenylpyruvate t (Figur 7). 4
Funktionel komplementering analyse: Rsh (RelA og S POT homolog)
RSH protein fra Novosphingobium sp. (Rr2-17) indeholder både det N-terminale phosphohydrolase og (p) ppGpp-synthase domæner, og således har den foreslåede bifunktionelle rolle som Spot of E. coli. Dette er blevet bekræftet ved anvendelse komplementering analyse af en E. coli dobbelt mutant, CF1693 som huser mutation i relA og stedet ved hjælp af rsh genet fra Novosphingobium sp. Fænotypen af den Rr2-17 rsh mutanten, opkaldt Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R), resulterer i en hypo-mucoid og dette skyldes en ikke-funktionel rsh. Den hypo-mucoid fænotype af Hx699 blev vurderet ved komplementering lettes ved det native rsh Nsp gen, der blev klonetind i de bredt værten rækkevidde vektor pRK290. I overensstemmelse med hypo-mucoid fænotype, den Hx699 huser tomme vektor pRK290 viser mindre opløseligt polysaccharid af, der produceres af det transeuropæiske suppleret Hx699 (pRK290 :: rsh Nsp) og Rr2-17 indeholder pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp (figur 8) .
Figur 1:. Varianterne af lysin anabolske veje fra aspartat, der forløber via mellemproduktet diaminopimelat (DAP) De veje er kommenteret af (A) acyl veje, (B) den diaminopimelatdehydrogenase (Ddh) pathway og (C) L , L-diaminopimelat aminotransferase (DapL) pathway. Forkortelsen definitioner for enzymerne er som følger: aspartat kinase (LysC), aspartatsemialdehyd-dehydrogenase (asd), tetrahydrodipicolinat syntase (DAPA), tetrahydrodipicolinat reduktase (dapB), tetrahydrodipicolinat acylase (dapD), N-acyl-2-amino-6-ketopimelate aminotransferase (DAPC), N-acyl-L, L-2, 6-diaminopimelat deacylase (dapE), diaminopimelatepimerase (dapF), meso -diaminopimelate dehydrogenase (Ddh), meso -diaminopimelate decarboxylase (lysA), L, L-diaminopimelat aminotransferase (DapL), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl d-glutamat:. meso -2,6-diaminopimelat ligase (MURE) og lysyl-tRNA-syntetase (LysU) klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Anabolske pathways for aminosyrerne tyrosinus og phenylalanin. (A) Det bakterielle (E. coli) pathway gennem den mellemliggende chorismat og (B) Anlægget pathway gennem den mellemliggende arogenate. Forkortelserne for enzymerne er som følger: chorismatmutase / præphenatdehydratase (PHEA), chorismatmutase, prephenate dehydrogenase (tyrA) og tyrosin-aminotransferase (TyrB). Diagrammet blev vedtaget og ændret form Prabhu og Hudson, 2010. 4 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Det cytoplasmatiske trin med peptidoglycansyntese (A) Skematisk repræsentation af det cytoplasmatiske trinnet peptidoglycansyntesen.. forkortelserne af enzymerne er som følger: UDP- N -acetylglucosamine enolpyruvyl transferase (Mura), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- N -acetylmuramate-L-alanin ligase (Murc), UDP- N-acetyl-muramoylalanine-D -glutamat ligase (MurD), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-d-glutamat 2,6- meso -diaminopimelate ligase (MURE), UDP- N -acetylmuramoyl-tripeptid-d-alanyl-d-alanin ligase (Murf ), D-alanin-D-alanin ligase (DDL). (B) Skematisk fremstilling af en monomer enhed af peptidoglycan viser disaccharidet N -acetylglucosamine (GlcNAc) og N -acetylmuramic (MurNAc) bundet via en β-1,4 glycosidbinding. Aminosyren i position 3 af stammen peptidet er involveret i tværbinding betegne som meso -diaminopimelate (m -DAP) i de fleste Gram-negative bakterier og lys i de fleste Gram-positive bakterier._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Skematisk model repræsentation af strenge respons i bakterier Udsættelse for et næringsstof dårligt miljø inducerer Rsh (RelA eller SPOT) for at anabolize den alarmone (p) ppGpp (guanosin pentaphosphat) ved at tilføje en fosfat gruppe GTP (guanosintriphosphat). Eksponering for et næringsstof rigt miljø inducerer ekspressionen af Rsh at hydrolysere (p) ppGpp som er en vækstinhibitor. Diagrammet blev vedtaget og ændret fra Raskin et al., 2007. 27 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Funktionel komplementering ved hjælp DapL Funktionel komplementering af AOH1 E. coli mutant med L, L-diaminopimelat aminotransferase (dapL) genet fra bakterien V. spinosum (Vs dapL), anlægget A. thaliana (At dapL) og algen, C. reinhardtii (Cr dapL). Mutanten huser plasmiderne, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: På dapL og pBAD33 :: Cr dapL blev replika-udpladet på LB-agarplader suppleret med 0,2% (vægt / volumen) arabinose med eller uden 50 ug / ml L, L - diaminopimelat og blev dyrket ved 30 ° C i 24 timer. Diagrammet blev vedtaget og ændret fra Nachar et al., 2012. 18 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Funktionel komplementering ved hjælp Mure Funktionel komplementering af TKL-11 E. coli mutant med UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat- meso -2,6-diaminopimelat ligase (Mure) genet fra V. spinosum. Mutanten huser plasmiderne BAD33 eller pBAD33 :: VsmurE blev dyrket i LB-medium til en OD 600 på 0,1 og blev seriefortyndet til 10 -1, 10 -2, og 10 -3 under anvendelse 0,85% (vægt / volumen) saltopløsning . 5 pi af forskellige fortyndinger blev replika-udpladet på LB medium suppleret med 0,2% (vægt / volumen) arabinose og dyrkedes vurderet ved 30 ° C og 42 ° C i 24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Funktionel komplementering af DL39 E. coli med en tyrosin-aminotransferase gen kommenteret af locus tag At5g36160 fra A. thaliana. Mutanten huser plasmider pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160 blev selekteret på LB-agarplader suppleret med 50 ug / ml-1 tyrosin, 50 ug / ml-1 phenylalanin og 34 ug / ml-1 chloramphenicol. Stammen blev dyrket i LB-medium til en OD OD 600 på 1,0 og blev seriefortyndet til 10 -1, 10 -2, og 10 -3 under anvendelse 0,85% (vægt / volumen) saltopløsning. 5 pi af de forskellige fortyndinger blev derefter replika-udpladet på M9-agarplader suppleret med 50 ug / ml-1 phenylalanin og 50 ug / ml-1 tyrosin, 0,5% (vægt / vol) glycerol, 0,2% (vægt / volumen) arabinose, 50 ug / ml-1 aspartat, 50 ug / ml-1 leucin, 50 ug / ml-1 valin, 50 ug / ml-1 isoleucin, 10 ug / ml-1 uracil, og også på plader, der mangler phenylalanin og tyrosin og blev inkuberet ved 30 ° C i 48 timer. Diagrammet blev vedtaget og ændret form Prabhu og Hudson, 2010. 4 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Funktionel komplementering af hypomucoid fænotype Novosphingobium sp. mutantstamme Hx699. Than vildtypestamme Novosphingobium sp. (Rr2-17) og mutantstammen Hx699 blev transformeret med pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp. Stammerne blev udstrøget i et "X" og blev yderligere dyrket på PD-agar ved 30 ° C i mindst 4 dage til at observere de fænotyper. klik her for at se en større version af dette tal.
| komplementering plasmider | Antibiotikaresistensmarkører | Citation |
| pBAD33 | Cmr | 21 |
| pBAD33 :: At dapL | Cmr | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | Cmr | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | cmr | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | Cmr | 4 |
| pBAD33 :: Vs MURE | Cmr | 18 |
| pRK290 | TetR | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | TetR | 17 |
Tabel 1: Funktionel komplementering plasmid anvendes i denne undersøgelse Liste over plasmider, der anvendes til funktionel komplementering analyse.. Cm R og TetR betegner chloramphenicol og tetracyclin resistens henholdsvis.
| Strain navn | organisme | Genotype | fænotype | Kilde |
| AOH1 | E coli | Δ dapD :: KAN2, dapE6 | Auxotrofisk for diaminopimelat | Hudson Laboratory |
| TKL-11 * | E coli | thr-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, hans-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-1, deoC1 | Vækst følsom fænotype var mutanten vokser ved 30 ° C, men ikke en 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E coli | LAM-, aspC13, FNR-25, rph-1 ilvE12, tyrB507 | Auxotrof for aminosyrerne; tyrosin, phenylalanin, leucin, isoleucin og valin | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Vildtype) - | Hyper-mucoid | Savka Laboratory | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-mucoid | Savka Laboratory |
Tabel 2:. Bakteriestammer anvendt i denne undersøgelse Liste over bakteriestammer sammen med respektive genotyper og fænotyper anvendt i denne undersøgelse. Bemærk at der kan opnås stammer (TKL-11 og DL39) betegnet med asterisk direkte fra Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange af de kurser, der er en integreret del af bioteknologi og Molekylær Bioscience pensum på Rochester Institute of Technology har et laboratorium komponent ud over foredraget del af kurset. Studieordningen for det akademiske år 2014-2015 indeholder i alt 48 kurser, 29, der indeholder et laboratorium komponent, som udgør omkring 60%. En sådan kursus er Fundamentals of Plantebiokemi og Patologi (FPBP), en blandet foredrag / laboratorium kursus og Bioseparations: Principper og praksis (BPP), et laboratorium baseret kursus.
Laboratoriet komponent i hvert kursus er designet til at styrke forelæsning materialer. For eksempel er biokemiske veje og stofskifte stærkt understreget i FPBP og BPP. Nogle af emnerne omfatter aminosyre metabolisme, peptidoglycan biosyntese, plante sekundær metabolisme, bakteriel reaktion på miljømæssige nicher, blandt andre. Forfatterne har integreret funktionel complementation som laboratorieøvelser i begge kurser for at styrke forståelsen af metaboliske veje, der omtales i foredraget og eller pre-laboratorium præsentationer. Fire eksempler på anvendelse af funktionel komplementering eksperiment for at analysere funktionen af gener involveret i biokemiske veje af lys, PG, tyr, phe og den stringente reaktion af bakterier diskuteres.
Der er flere grunde til, at forfatterne har integreret denne eksperimentelle modul i deres kurser. For det første udsættelse for funktionel komplementering analyser er et fremragende værktøj til at styrke eller indføre emner, der er relateret til genetik, evolution, genomforskning, bioinformatik og biokemi. For det andet, at forsøget er facile og kan udføres i et forløb laboratoriemiljø. Alle reagenserne, der anvendes, er sikre og bakterierne, der anvendes betegnes som biosikkerhed niveau 1 og er ikke patogene. Som sådan forfatterne villige til at gøre reagenser, såsom plasmider og bacterial stammer rådighed for alle, der er i interesseret i at indarbejde funktionel komplementering som en del af deres undervisningserfaring. Det skal bemærkes, at to af de bakterielle stammer (TKL-11 og DL39) blev opnået direkte fra Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Det er vigtigt at bemærke, at der er flere kritiske trin til den funktionelle komplementering protokollen. Det første skridt er at sørge for, at mutant (e) er i stand til at dyrkes, før de påbegynder nogen eksperimenter. Årsagen er, at som pr tabel 2, er der flere genotyper forbundet med hver mutant. For at vokse mutanten at fremstille kompetente celler før eksperimentet, prøv voksende mutanten med eller uden de krævede kemikalier og eller temperaturkrav vedrørende PG MURE mutanten. Dette er også en undervisningsøjeblik fordi det vil vise sig, at mutanten er autentisk før eventuelle forsøg.
Detbør også bemærkes, at selv om dette er et udmærket redskab til at teste funktion (er) af gener, det virker ikke altid på grund af flere faktorer såsom kodonanvendelse hvor gen (er) af interesse ikke kan blive ordentligt oversat grund af manglende passende tRNA'er i mutanten organisme. Dette kan dog omgås ved codon optimering af den åbne læseramme eller cDNA under kloningsprocessen skridt, som normalt sker ved at syntetisere genet af interesse ved at ændre nukleotider, der svarer til kodonanvendelse af mutant (er). Et andet problem er, at nogle eukaryote proteiner kræver posttranslationelle modifikationer for funktionen. Posttranslationelle modifikation er ikke en funktion af bakterier og som sådan kunne man ikke være i stand til at anvende denne teknik til at teste funktionen (er) af gener med bakterie- mutanter.
Betydningen af den teknik, vi lægger vægt på kurserne er, at FCA er en glimrende måde at teste at funktionen af gener in vivo. Karakterisering af enzymer er hovedsagelig baseret på in vitro-undersøgelser, hvor enzymet er oprensede og traditionelle enzymatiske assays udføres. 29 Også traditionelle enzymatiske assays er gode til at måle eller detektere enzymaktivitet, kan man ofte "force feed" enzymet med kommercielt tilgængelige substrater, der ikke er ren eller naturligt for enzymet. 30 et in vivo system, såsom FCA giver en mere autentisk bevis om funktionen af gener i betragtning af, at den fungerer under fysiologiske betingelser som appose til in vitro som normalt ikke under fysiologiske betingelser. 2 givet manglende oplysninger om funktionerne af mange gener og det faktum, at de fleste anmærkninger er baseret på forudsigelse, 31 mastering denne teknik vil lette eksperimenter at belyse funktioner mange gener, der forbliver tåget eller dem, der i øjeblikket anses for at have formodede funktioner i de forskellige offentlige databaser.
jove_content "> Et af de spørgsmål vedrørende teknik, der ofte opleves i udarbejdelsen af de kompetente celler. Man skal sørge for, at cellerne er forberedt korrekt for at sikre, at der er nok celler, der skal omdannes i tillæg til at sikre cellerne vaskes ordentligt med vand og glycerol for at forhindre brodannelse under elektroporation processen. Man bør også være bekendt med fænotypen af mutanten ved at sikre, at cellerne dyrkes med den passende kemiske eller ved den rette temperatur for at lette både den oprindelige vækst af mutanten og også for den funktionelle komplementering analyse.Når denne teknik beherskes, kan forskerne bruge funktionel komplementering assay til at vurdere funktionen af gener, så længe der er en passende mutation i en organisme rådighed for at lette denne analyse. Bemærk venligst, at protokollen i dette manuskript beskriver brugen af bakterier. Men andre organismer såsomplanter og pattedyrceller, blandt andre, kan anvendes til at vurdere funktionen af gener. 32-33 Man ville blot have for at sikre, at de korrekte vektorer anvendes som supplement til optimering af transformerende og eller transfektion af cellerne for at lette eksperimentet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
AOH og MAS anerkender College of Science og Thomas H. Gosnell School of Life Sciences på Rochester Institute of Technology for støtte. Dette arbejde blev støttet delvist af USA National Science Foundation (NSF) pris til AOH MCB-1.120.541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S.
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y.
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
