Summary
Valideringen av enzymatiska aktiviteter som ingår i biokemiska vägar kan belysas med hjälp av funktionell komplettering analys (FCA). Beskrivs i detta manuskript är Konkurrensverket analysen visar den enzymatiska aktiviteten av enzymer som är involverade i metabolismen av aminosyror, bakteriell stränga svar och bakteriell peptidoglykan biosyntesen.
Abstract
Funktionell komplettering analys (FCA) är en in vivo-analys som ofta används för att belysa funktionen / roll gener / enzymer. Denna teknik är mycket vanligt i biokemi, genetik och många andra discipliner. En omfattande översikt av tekniken för att komplettera undervisningen av biokemiska vägar som hänför sig till aminosyror, peptidoglykan och den bakteriella stränga svar redovisas i detta manuskript. Två cDNA från modellväxten organism Arabidopsis thaliana som är involverade i metabolismen av lysin (L, L-diaminopimelat aminotransferas (dapL) och tyrosin-aminotransferas (tyrB) som är involverade i metabolismen av tyrosin och fenylalanin är markerade. Dessutom den bakteriella peptidoglykan anabola pathway markeras genom analys av UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (MURE) genen från bakterien Verrucomicrobium spinosum involverad i tvär-linking av peptidoglykan. Den bakteriella stringent svar rapporteras också genom analys av den rsh (r ELA / s POT h omolog) bifunktionella gen som är ansvarig för en hyper-mukoid fenotyp i bakterien Novosphingobium sp. Fyra exempel på FCA presenteras. Videon kommer att fokusera på tre av dem, nämligen lysin, peptidoglykan och stringenta svaret.
Introduction
Funktionell komplettering i samband med kunskaper om funktionen (er) / roll (er) av en gen definieras som förmågan hos en viss homolog eller ortolog gen för att återställa en viss mutant med en observerbar fenotyp till vildtyp tillstånd när den homologa eller ortologa gen införs i cis eller träns i den muterade bakgrunden. Denna teknik har använts i stor utsträckning för att isolera och identifiera den funktion (er) / roll (er) av många gener. Ett särskilt exempel är isolering och identifiering av orotidin-5-fosfatdekarboxylas från Candida albicans med användning av ura3-mutant av S. cerevisiae och pyrF mutant av E. coli. 1 Författarna har använt denna teknik för att belysa funktionen av gener som är involverade i metabolismen av aminosyror, peptidoglykan och stränga svar i sina forskningsprogram och har införlivat denna teknik i sina undervisningsprogram i Biotechnology och molekylär biovetenskap (BMB) programmet vid Rochester Institute of Technology (RIT).
Författarna lär Fundamentals of växtbiokemi / patologi (FPBP) (Hudson) och bioseparationer: Principer och metoder (BPP) (Hudson / Savka), två övre division elektiv laboratorium baserade kurser i BMB Program vid KTH. Eftersom några av de ämnen som diskuteras i kurserna är anslutna med sina forskningsintressen har författarna införlivat många av de tekniker och experimentella verktyg som används i deras respektive forskningsprogram i dessa två laboratoriebaserade kurser. Ett sådant exempel är funktionell komplettering som en laboration att förstärka föreläsningsmaterial avseende aminosyrametabolismen från växter, peptidoglykan och stränga svar ämnesomsättning från bakterier.
Tre av aminosyravägar från växter som diskuteras i FPBB kursen är att lysin (Lys), tyrosin(Tyr) och fenylalanin (phe). Lys vägen markeras under på grund av vikten av aminosyran som en essentiell aminosyra för alla djur i synnerhet människor eftersom djur saknar den genetiska maskineri för att syntetisera lys de novo. Dessutom upptäcktes nyligen det att växter använder en väg för syntes av lys som är väsentligt skild från den hos bakterier. Denna upptäckt delvis underlättas genom funktionell komplettering av E. coli diaminopimelat (DAP) mutanter med användning av en gen som kodar för enzymet L, L-diaminopimelat aminotransferas (DapL) från modellväxten Arabidopsis thaliana. 2 Varianten vägar för syntes av lys genom den mellanliggande diaminopimelat visas i figur 1. Dessutom underlättar syntesen av lys genom aspartat härledda familj av aminosyror som är strängt reglerad. 3 Utöver deras betydelse i protein synthesis, banorna för tyr och phe är markerade med tanke på deras betydelse i tjänstgör som prekursorföreningar för anabolism av fenylpropanoider föreningar involverade syntesen av växtförsvars föreningar såsom:. alkaloider, ligniner, flavonoider, isoflavonoider, hydroxikanelsyra bl a 4 tyr och Phe vägar är också markeras för att visa skillnaden mellan växt- och bakterie anabola vägar. I bakterier, är enzymet tyrosinaminotransferas (TyrB) involverade i anabolism av både aminosyror, medan i växter, är i första hand involverade i katabolismen av tyr och phe enzymet och inte är involverad i anabolism av dessa aminosyror. (Figur 2). 4
Skillnaderna mellan grampositiva och gramnegativa bakterier om strukturen av peptidoglykan (PG) är markerade i FPBP kursen. PG av gramnegativa bakterier är av intresse när det gäller växtpatologi baserat på det faktum att de flestaväxtpatogener är gramnegativa. En nyligen genomförd granskning beträffande de 10 bakteriella fyto-patogener visade att alla är gramnegativa. Bakterierna var från släktena:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya och Pectobacterium 5 En av de kemiska skillnaderna när man jämför PG stammen av gramnegativa och grampositiva bakterier är skillnaden mellan tvärbindnings amino syror av båda typerna. Det första steget för att olika tvärbindning av PG förekommer i den cytoplasmiska steget av PG anabolism och underlättas av enzymet UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (MURE) (figur 3A). MURE katalyserar additionen av en speciell diaminförening vid tredje positionen av peptiden stammen. 6 I de flesta gramnegativa bakterier, de näst sista lys prekursor, meso -diaminopimelate (
I bioseparationer: Principles and Practices (BPP) Naturligtvis är skillnaderna mellan öppna och slutna system för odling av bakterier och hur näringsnivåer kommer att förändras avsevärt i båda systemen på grund av miljöförändringar diskuteras. Dessa händelser är kopplade till regeländringar som kallas en "nedväxling" eller "växla upp" utlöses av svält eller ett tillräckligt utbud av aminosyror eller energi. Den "skifta ned" svar kan uppstå när en bakteriekultur överförs från en rik och komplex medium till ett kemiskt definierat medium med en enda kolkälla. Denna förändring i miljön leder till den snabba cessaning av tRNA och rRNA syntes. Denna avbrutna resulterar i avsaknaden av ribosomer, protein och DNA-syntes, även om biosyntesen av aminosyror är uppreglerade.
Efter "nedväxling" svar, de befintliga ribosomer för att ta fram nya enzymer för att syntetisera aminosyrorna inte längre finns i mediet eller miljön. Efter en tid, är rRNA syntes och nya ribosomer monteras och populationen av bakterieceller börjar växa om än i reducerad hastighet. Händelseförloppet kallas "stringenta svaret" eller "sträng kontroll" och är ett exempel på global cellulär reglering och kan ses som en mekanism för att justera cellens biosyntetiska maskineri för att kompensera för tillgängligheten av de nödvändiga substrat och energibehov . 8 stränga svar möjliggör sålunda bakterier att snabbt reagera på flöden av näringsämnen i miljön och bidrar och enhrätterna bakteriers förmåga att konkurrera i miljöer som kan ändras snabbt när det gäller näringsämnen och eller substrat tillgänglighet. 8-9
Den stränga svar har en viktig roll i genuttryck när tillgången av aminosyror, kol, kväve, fosfat och fettsyror är begränsade. 8,10-14 Denna stränga svar samordnas av två nukleotider, guanosin tetra (ppGpp) och guanosin pentafosfat (pppGpp) som vanligtvis tillsammans som alarmone (p) ppGpp. Till exempel, när aminosyror är begränsade-som kan leda till en flaskhals i proteinsyntes-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrofosfat (ppGpp), härledd från anabolism av guanosin 3-difosfat 5-trifosfat (pppGpp) ackumulerar i cellen. Förändringen i (p) ppGpp nivå är involverade i expression av gener som styr svaret för att övervinna bristen på substraten i miljön som är direkt involverade i celltillväxt och development. Två av de gener som är involverade i denna process kallas Rela och Spot. RelA är ett ribosom-associerade (p) ppGpp syntetas som är involverad i responsen till en ackumulering av oladdade tRNA-sekvenser som är resultatet av aminosyra begränsning. Spot fungerar som en bifunktionen (p) ppGpp syntetas och hydrolas. Den syntetasaktivitet av fläck är involverad i reaktion på avsaknaden av kol och fettsyra svält. 8 De RelA / Spot-homologer är utbrett i växter och bakterier och kallas Rsh för R Ela / S POT h omologs. 8,10 -12,16 en nyligen manuskript visade att det finns en specifik Rsh protein involverat i syntesen av dessa alarmones från bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Här presenterar vi fyra biokemiska vägar bundna till funktionell komplettering analyser. Komplemente analyser som beskrivs i detta manuskript ger en väg att EXPLmalm med användning av denna analys in vivo som ett medel för att identifiera och eller karakterisera enzymer som förutsägs ha okänd / förmodade funktion (er) eller som pedagogiska verktyg för att komplettera undervisningen av biokemiska vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Författarna är villiga att ge bakteriestammar och rekombinanta plasmider för att underlätta införandet av funktionell komplettering analys för undervisningsändamål för personer som är intresserade. Plasmiderna som användes för att underlätta funktionell komplettering experiment är angivna i tabell 1.
1. Konstruktion av plasmider för funktionell komplettering
- Kloning av diaminopimelat-aminotransferas (dapL) för funktionell komplettering.
- Amplifiera dapL öppen läsram (ORF) från V. spinosum och cDNA från A. thaliana och C. reinhardtii med PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkludera 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de 4 deoxinukleotidtrifosfater, och 0,5 ng mall-DNA och 1 enhet PfxDNA-polymeras.
OBS: Den fullständiga beskrivningen som hänför sig till rekombinanta kloning av tre dapL ortologer från växt A. thaliana (At -dapL), bakterien Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) och algen Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) har tidigare publicerats. 2,18-20
OBS: De primrar som användes för kloning av de dapL ortologer är som följer:
Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
Vid dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
Vid dapL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Klona PCR-fragment i than plasmiden pET30A för att producera de rekombinanta plasmiderna, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Vid dapL och pET30A :: Cr dapL med användning av primrarna, restriktionsenzymer och T4 DNA-ligas.
- Kortfattat, inkubera 50 ng av insatsen och 20 ng vektor i 1x ligasbuffert och 1 enhet T4 DNA-ligas över natten vid 17 ° C. Omvandla ligering in i E. coli DH5a-celler och skärm för kolonier på LB-plattor som kompletterats med 50 | ig / ml -1 kanamycin genom att inkubera vid 37 ° C under 24 h. 18-20
- För att skapa den plasmid för funktionell komplettering, smälta pET30A :: Vs dapL och pET30A :: Vid dapL plasmider med restriktionsenzymerna Xbal och Sall och Xbal och Hindlll för pET30A :: Cr dapL. Ligera skären i plasmiden pBAD33 användning av T4-DNA-ligas för att producera plasmiderna pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: Vid dapL och pBAD33 :: Cr dapL.
- Inkubera 50 ng av insatsen och 20 ngav vektor i 1x ligasbuffert och 1 enhet T4 DNA-ligas över natten vid 17 ° C. Omvandla ligering in i E. coli DH5a-celler och skärm för kolonier på LB-plattor som kompletterats med 34 | ig / ml -1 kanamycin genom att inkubera 37 ° C under 24 h. 20
- Amplifiera dapL öppen läsram (ORF) från V. spinosum och cDNA från A. thaliana och C. reinhardtii med PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkludera 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de 4 deoxinukleotidtrifosfater, och 0,5 ng mall-DNA och 1 enhet PfxDNA-polymeras.
- Kloning av tyrosinaminotransferas (tyrB) från A. thaliana för funktionell komplettering.
OBS: Den fullständiga uppgifter om kloning av cDNA från A. thaliana kommenterad av locus taggar At5g36160 har beskrivits tidigare. 4- Amplifiera cDNA genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, och 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet av Pfx DNA-polymeras.
OBS: De primrar som användes för cloning av At5g36160 är följande:
Vid tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Klona fragmentet i plasmiden pET30A att producera de rekombinanta plasmiderna pET30A :: At5g36160 genom digerering av PCR-fragmentet med EcoR1 och Sal1; ligera in fragmentet i pET30A med användning av T4 DNA-ligas, såsom beskrivs nedan. 4
- För att skapa den funktionella komplemente plasmiden, smälta den pET30A :: At5g36160 med restriktionsenzymerna Xbal och Hindlll och ligera in insatsen i pBAD33 med användning av samma restriktionsenzymställen för att producera den rekombinanta plasmiden pBAD33 :: At5g3160 med användning av T4 DNA-ligas.
- Inkubera 50 ng av insatsen och 20 ng vektor i 1x ligasbuffert och 1 enhet T4 DNA-ligas under natten vid 17 ° C. Omvandla ligering till E. coli DH5a-celler och skärm för kolonier på LB-plattor kompletterade med 34 mikrogram / ml -1 Chloramphenicol genom att inkubera 37 ° C under 24 h. 4
- Amplifiera cDNA genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, och 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet av Pfx DNA-polymeras.
- Kloning av UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (Mure) från V. spinosum för funktionell komplettering.
OBS: Kloningen av MURE ORF från V. spinosum har beskrivits tidigare. 18- Amplifiera den öppna läsramen genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet av Pfx DNA-polymeras. Därefter klona in i plasmiden pET100D att producera plasmiden pET100D :: Vs MURE.
OBS: De primrar som användes för kloning av den Vs MURE är som följer:
Vs MURE F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
MotMURE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - För att framställa plasmiden för funktionell komplettering, smälta pET100D :: Vs MURE
Med restriktionsenzymerna Xbal och Sal1 och ligera in insatsen i pBAD33 för att producera den rekombinanta plasmiden pBAD33 :: Vs MURE med användning av T4 DNA-ligas.- Inkubera 50 ng av insatsen och 20 ng vektor i 1x ligasbuffert, tillsammans med en enhet T4 DNA-ligas, över natten vid 17 ° C. Omvandla ligering in i E. coli DH5a-celler och skärm för kolonier på LB-plattor kompletterade med 34 | ig / ml -1 kloramfenikol genom att inkubera 37 ° C under 24 h. 8
- Amplifiera den öppna läsramen genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet av Pfx DNA-polymeras. Därefter klona in i plasmiden pET100D att producera plasmiden pET100D :: Vs MURE.
- Kloning av Rela / s POT (rsh) från Novosphingobium sp för funktionell komplettering.
OBS:. Kloningen av rsh från Novosphingobium sp har beskrivits tidigare 17.- Förstärka rsh ORF förutom 599 nukleotider upstream av inledstartstället och 46 nukleotider nedströms vid termineringsställe genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet Taq-DNA-polymeras. Sedan klona in i plasmid pCR2.1 att producera pCR2.1 :: Nsp rsh.
- Inkubera 1 ni av amplifierade PCR-fragmentet, ett pl av pCR2.1 vektor, 1 pl saltlösning och 1 | il vatten. Inkubera vid 25 ° C under 5 min och 2 pl av ligering till E. coli-celler och skärm för kolonier på LB-plattor kompletterade med 50 mikrogram / ml -1 kanamycin genom inkubation 37 ° C under 24 h.
OBS: De primrar som användes för kloning av den rsh är följande:
rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rsh R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - För funktionell komplettering, smälta plasmiden pCR2.1 :: Nsp rsh med EcoR1 och ligera in insatsen i det breda värdområde pRK290 för att producera den rekombinanta plasmiden pRK290 :: Nsp RSH med användning av T4 DNA-ligas.
- Inkubera 50 ng av insatsen och 20 ng vektor i 1x ligasbuffert och 1 enhet T4 DNA-ligas under natten vid 17 ° C. Omvandla ligering in i E. coli DH5a-celler och skärm för kolonier på LB-plattor kompletterade med 10 mikrogram / ml -1 tetracyklin genom inkubation 37 ° C under 24 h. 17
- Inkubera 1 ni av amplifierade PCR-fragmentet, ett pl av pCR2.1 vektor, 1 pl saltlösning och 1 | il vatten. Inkubera vid 25 ° C under 5 min och 2 pl av ligering till E. coli-celler och skärm för kolonier på LB-plattor kompletterade med 50 mikrogram / ml -1 kanamycin genom inkubation 37 ° C under 24 h.
- Förstärka rsh ORF förutom 599 nukleotider upstream av inledstartstället och 46 nukleotider nedströms vid termineringsställe genom PCR. Använda en cykel vid 94 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 15 sek, 60 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 2 min. Inkluderar 12 pmol av varje primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM vardera av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna, 0,5 ng av schablon-DNA och 1 enhet Taq-DNA-polymeras. Sedan klona in i plasmid pCR2.1 att producera pCR2.1 :: Nsp rsh.
2. Framställning av Electro-kompetenta bakterieceller för att underlätta Transformation
OBS: Framställningen av elektrokompetenta celler är baserad på protokollet 26 för 1,0 L av kulturen som kan skalas ned till en mindre volym (dvs 250 ml). Observera att detta protokoll kan be används för att göra alla stammar kompetenta som beskrivs i detta manuskript för att underlätta FCA. 22
- Ympa 50 ml flytande medium med en enda koloni i en kolv och växa över natten, och se till att kontrollera genotypen av mutanten innan du börjar detta steg (tabell 2).
- På dag två, ympa 1,0 L i lämpligt medium (LB för E. coli-mutanter och PD för Novosphingobium sp) med 50 ml av natten kultur och växa till en OD 600 till 0,4-0,6 (log fas) vid 30 ° C.
- Harvest cellerna genom centrifugering vid 5000 xg under 15 min vid 4 ° C, dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 ml steril iskall ren H 2 O.
- Centrifugera cellerna vid 5000 xg under 20 min vid 4 ° C, dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 ml steril iskall 10% glycerol.
- Centrifugera cellerna vid 5000 xg under 20 min vid 4 ° C, dekantera supernatant, och återsuspendera pelleten i 2,0 ml av 10% glycerol.
- Alikvot av cellerna genom att överföra 50 | il i mikro-centrifugrör och omedelbart frysa genom att placera rören i ett torris-etanolbad. Lagra de kompetenta cellerna vid -80 ° C under elektroporering.
3. Elektroporation av bakterieceller med komplemente plasmider
- För elektroporering, tillsätt 1,0 l (10-50 ng) av rekombinant plasmid till en portion (50 ^) av kompetenta celler och placera på is i 5 minuter.
- Överför blandningen via pipettering till en elektroporeringskyvett och ställ in elektroporering apparaten till följande inställning: 25 iF kapacitans, 2,5 kV och 200 ohm motstånd och leverera en puls.
- Tillsätt 1,0 ml media (LB) till elektroporeringskyvett och överföring med hjälp av en pipett till en 15 ml koniska rör. Återhämta sig med varsam rotation i 60 minuter i ett skakande inkubator.
- Plattan 100 | il av kulturen från recomycket steg på agarplattorna att selektera för transformanter genom att pipettera och sprida med en steril spridare.
OBS: Se till att kontrollera Tabell 1 och Tabell 2 innan du börjar detta steg för att kontrollera antibiotika och genotyper att göra rätt agarplattor.
4. Transformation av AOH1 att underlätta funktionell komplettering Använda L, L-diaminopimelat Aminotransferase (dapL)
- För komplemente analys, trans AOH1 med tom vektor (pBAD33), och med DapL expressionsvektorer i separata transformationshändelser genom att använda elektroporering protokoll som beskrivs i avsnitt 3.0.
- Välja transformanter genom utstrykning på LB-agar-medium kompletterat med 50 | ig / ml -1 DAP och 34 | ig / ml -1 kloramfenikol och 50 | ig / ml -1 kanamycin.
- Test för funktionell komplettering av replika-plating kolonierna genom strimmor på LB migDIUM med 0,2% (vikt / volym) arabinos med och utan 50 | ig / ml -1 DAP och 34 | ig / ml -1 kanamycin.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 24 timmar och observera resultat.
OBS: Resultatet bör visa att mutanten är endast i stånd att växa på DAP fria medier endast när dapL genen uttrycks i den mutanta bakgrund jämfört med enbart vektor-kontroll.
5. Transformation av TKL-11 för att underlätta funktionell komplettering Använda UDP N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso -diaminopimelate ligas (Mure)
- Transformera mutanten med den tomma vektorn (pBAD33) och med MURE uttryckande vektorn (pBAD33 :: VsmurE) med användning av det protokoll som beskrivs i avsnitt 3.0.
- Plate och väljer transformanter på LB-agar-medium kompletterat med 50 | ig / ml -1 tymin och 34 | ig / ml -1 kloramfenikol och inkubera plattorna vid 30 ° C under 24 h.
- Test för komplettering av strimmor eller plätering kolonier från både kontroll- och experiment transformationer på två LB-medium plus 0,2% (w / v) arabinos och 50 mikrogram / ml -1 tymin.
- Inkubera en platta vid 30 ° C och den andra vid 42 ° C under 24 timmar för att visuellt bedöma tillväxt fenotypen.
OBS: Resultaten bör visa att mutanten kan växa vid 42 ° C endast när Mure genen uttrycks i den muterade bakgrunden jämfört med enbart vektor kontroll.
6. Omvandling av DL39 att underlätta funktionell komplettering Använda tyrosinaminotransferas (tyrB)
- Omvandla DL39 med antingen pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160 och väljer transformanter på LB-agarplattor kompletterade med 50 | ig / ml -1 tyrosin, 50 | ig / ml -1 fenylalanin, och 34 | ig / ml -1 kloramfenikol användning av det protokoll som beskrivs i avsnitt 3.0.
- Kopia-plate kolonier på minimala (M9) media med 50 | ig / ml -1 fenylalanin och 50 | ig / ml -1 tyrosin, 50 | ig / ml -1 aspartat, 50 | ig / ml -1 leucin, 50 | ig / ml -1 valin, 50 | ig / ml -1 isoleucin, 10 | ig / ml -1 uracil 0,5% (vikt / volym) glycerol, 0,2% (vikt / volym) arabinos. Även replika-platta kolonier på plattor som saknar fenylalanin och tyrosin genom strimmor samma koloni av båda plattorna.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 48 h för att observera tillväxt fenotyp.
OBS: Resultatet bör visa att mutanten är endast i stånd att växa på fenylalanin och tyrosin fria medier, endast när tyrB genen uttrycks i den mutanta bakgrund jämfört med enbart vektor-kontroll.
7. Omvandling av Hx699 att underlätta funktionell komplettering av Hypomucoid Fenotyp av Novosphingobium sp. stam Hx699
OBS: Resultatet bör visa att hypo-slemmig fenotyp kompletteras när rsh uttrycks i den muterade bakgrunden jämfört med enbart vektor kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bakteriestammar som används i de olika funktionella komplemente analyser är angivna i tabell 2.
Funktionell komplettering Analys: L, L-diaminopimelat aminotransferas (dapL)
E. coli dubbel mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) hyser en mutation i dapE genen och en fullständig deletion av DAPD genen (Figur 1). Som sådan är den mutanta oförmögna att växa om inte DAP tillhandahålls. På grund av dessa mutationer är AOH1 anses auxotrof. AOH1 är lämplig för funktionell komplettering analys av L, L-diaminopimelat aminotransferas (DapL) ortologer som DapL katalyserar syntesen av L, L-diaminopimelat direkt från THDP att underlätta PG och lys-syntes (Figur 1).
AOH1 mutanta uttryck DapLs har möjlighet att växa på L, L-DAP-fria medier som visar att de rekombinanta enzymerna kan omvandla THDP till L, L-DAP kringgår DAPD och DapE enzymatiska steg i DAP / lys vägen (Figur 5).
Funktionell komplettering analys: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (Mure)
meso -diaminopimelate (m -DAP) är den tvärbindande aminosyran i PG av gramnegativa bakterier. Enzymet UDP N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2,6-meso -diaminopimelate ligas (Mure) underlättar tillsats av m -DAP i denna process (Figur 3A - B). E. coli mutant TKL-11 hyser en muförandet i MURE genen som resulterar i förmågan för mutanten att växa i 42 ° C på grund av det faktum att det muterade enzymet inte kan vika ordentligt vid denna temperatur.
Resultaten kommer att visa att det finns tillväxt vid den tillåtna temperaturen av 30 ° C genom både kontrollen och experimentet. Emellertid kommer endast celler som uttrycker Mure (experiment) kunna växa på den icke-tillåtna temperaturen av 42 ° C (Figur 6).
Funktionell komplettering Analys: Tyrosin aminotransferas (tyrB)
Arabidopsis thaliana kodar en tyrosinaminotransferas som kan interconvert tyrosin och 4-hydroxifenylpyruvatdioxygenas, och fenylalanin och fenylpyruvat kommenterad av At5g36160 (Figur 2). 4 E. coli mutant (DL39) härbärgerar en mutation i tyrB-genen som gör auxotrof för fenylalanin och tyrosin. 24-26 Det bör noteras att mutanten är auxotrof för aminosyrorna tyrosin, fenylalanin, aspartat, leucin, isoleucin och valin, såväl på grund av andra mutationer. Stammen är lämpligt att bedöma funktionen hos tyrB ortologer sedan TyrB enzymet ortolog från E. coli är direkt involverade i syntesen av tyrosin och fenylalanin för att underlätta proteinsyntes.
Resultatet bör visa att medan DL39 mutant kan växa på M9 endast när tyrosin och fenylalanin tillhandahålls. Emellertid är i stånd att växa på M9-medier som saknar tyrosin och fenylalanin som visar att enzymet är i stånd att syntetisera tyrosin från 4-hydroxifenylpyruvat, och fenylalanin från fenylpyruvat t den stam som uttrycker A. thaliana (At5g36160) (Figure 7). 4
Funktionell komplettering Analys: Rsh (RelA och S POT homolog)
RSH proteinet från Novosphingobium sp. (Rr2-17) innehåller både den N-terminala phosphohydrolase och de (p) ppGpp syntas domäner, och har således den föreslagna bifunktionella roll som Fläck av E. coli. Detta har bekräftats med hjälp av komplemente analys av en E. coli dubbel mutant, CF1693 som hyser mutation i relation och plats med hjälp av rsh genen från Novosphingobium sp. Fenotypen av Rr2-17 rsh mutant som namnges Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R), resulterar i en hypo-slemmig och detta beror på en icke-funktionell rsh. Hypo-mukoid fenotyp Hx699 bedömdes genom komplemente underlättas av den nativa rsh Nsp gen som klonadesi brett spektrum av värdvektor pRK290. I överensstämmelse med hypo-mukoida fenotyp, det Hx699 hyser tomma vektor pRK290 visar mindre löslig polysackarid som produceras av trans kompletteras Hx699 (pRK290 :: rsh Nsp) och Rr2-17 innehållande pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp (Figur 8) .
Figur 1:. Varianterna av lysin anabola vägar från aspartat som gå vidare genom mellan diaminopimelat (DAP) Vägarna är kommenterad av (A) acyl vägar (B) diaminopimelat dehydrogenas (Ddh) vägen och (C) L , L-diaminopimelat aminotransferas (DapL) reaktionsvägen. Förkortningen definitioner för enzymerna är följande: aspartat kinas (LysC), aspartatsemialdehyd dehydrogenas (asd), tetrahydrodipicolinate syntas (DAPA), tetrahydrodipicolinate reduktas (DapB), tetrahydrodipicolinate acylas (DAPD), N-acyl-2-amino-6-ketopimelate aminotransferas (DAPC), N-acyl-L, L-2, 6-diaminopimelat deacylas (DapE), diaminopimelat epimeras (DapF), meso -diaminopimelate dehydrogenas (Ddh), meso -diaminopimelate dekarboxylas (Lysa), L, L-diaminopimelat aminotransferas (DapL), UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl d-glutamat. meso -2,6-diaminopimelat ligas (Mure) och lysyl-tRNA-syntetas (LysU) klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Anabola vägar för aminosyrorna tyrosinus och fenylalanin. (A) Den bakteriella (E. coli) -vägen genom mellan korismat och (B) anläggningen vägen genom den mellanliggande arogenate. Förkortningarna för enzymerna är följande: korismat mutas / prefenatdehydratas (PHEA), korismat mutas, prephenate dehydrogenas (tyra), och tyrosin-aminotransferas (TyrB). Diagrammet antogs och modifierad form Prabhu och Hudson, 2010. 4 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Den cytoplasmatiska steget av peptidoglykansyntesen (A) Schematisk representation av den cytoplasmatiska steget av peptidoglykansyntesen.. förkortningarna av enzymerna är följande: UDP- N -acetylglucosamine enolpyruvyl transferas (Mura), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- N -acetylmuramate-L-alanin-ligas (MurC), UDP- N -acetyl-muramoylalanine-D glutamat ligas (MuRD), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-d-glutamat 2,6- meso -diaminopimelate ligas (MURE), UDP- N -acetylmuramoyl-tripeptid-d-alanyl-d-alanin-ligas (Murf ), D-alanin-D-alanin-ligas (DDL). (B) Schematisk bild av en monomer enhet av peptidoglykan som visar disackariden N -acetylglucosamine (GlcNAc) och N -acetylmuramic (MurNAc) kopplad via en β-1,4 glykosidbindning. Aminosyran vid position 3 av skaftet peptiden är involverad i tvärbindning betecknar med meso -diaminopimelate (m -DAP) i de flesta gramnegativa bakterier och lys i de flesta grampositiva bakterier._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Schematisk modell representation av stränga svaret i bakterier Exponering för en näringsfattig miljö inducerar Rsh (RelA eller spot) att anabolize den alarmone (p) ppGpp (guanosin pentafosfat) genom att tillsätta en fosfatgrupp till GTP (guanosintrifosfat). Exponering för en näringsrik miljö inducerar uttryck av Rsh att hydrolysera (p) ppGpp som är en tillväxthämmare. Diagrammet antogs och ändras från Raskin et al., 2007. 27 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Funktionell komplettering med användning DapL Funktionell komplementering av AOH1 E. coli-mutant med L, L-diaminopimelat aminotransferas (dapL) -genen från bakterierna V. spinosum (Vs dapL), växt A. thaliana (At dapL) och alg, C. reinhardtii (Cr dapL). Mutanten som härbärgerar plasmiderna, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: Vid dapL och pBAD33 :: Cr dapL ades replika-plattades på LB-agarplattor kompletterade med 0,2% (vikt / volym) arabinos med eller utan 50 | ig / ml L, L - diaminopimelat och odlades vid 30 ° C under 24 h. Diagrammet antogs och ändras från Nachar et al., 2012. 18 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Funktionell komplettering med hjälp av Mure funktionell komplettering av TKL-11 E. coli mutant med UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (Mure) genen från V. spinosum. Mutanten härbärgerar plasmiderna BAD33 eller pBAD33 :: VsmurE odlades i LB-medium till ett OD 600 av 0,1 och serieutspäddes till 10 -1, 10 -2, och 10 -3 med användning av 0,85% (vikt / volym) saltlösning . 5 il av olika spädningar replika-plattades på LB-medium som kompletterats med 0,2% (vikt / volym) arabinos och odlades bedömdes vid 30 ° C och 42 ° C under 24 h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Funktionell komplettering av DL39 E. coli med en tyrosinaminotransferas gen kommenterad av locus tag At5g36160 från A. thaliana. Mutanten härbärgerar plasmider pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160 selekterades på LB-agarplattor kompletterade med 50 | ig / ml -1 tyrosin, 50 | ig / ml -1 fenylalanin, och 34 | ig / ml -1 kloramfenikol. Stammen odlades i LB-buljong till ett OD OD 600 av 1,0 och serieutspäddes till 10 -1, 10 -2, och 10 -3 med användning av 0,85% (vikt / volym) saltlösning. 5 | il av de olika spädningarna var sedan replika-utstrykes på M9 agarplattor kompletterade med 50 | ig / ml -1 fenylalanin och 50 | ig / ml -1 tyrosin, 0,5% (vikt / volym) glycerol, 0,2% (vikt / volym) arabinos, 50 | ig / ml -1 aspartat, 50 | ig / ml -1 leucin, 50 | ig / ml -1 valin, 50 pg / ml -1 isoleucin, 10 pg / ml -1 uracil, och även på plattor som saknar fenylalanin och tyrosin och inkuberades vid 30 ° C under 48 h. Diagrammet antogs och modifierad form Prabhu och Hudson, 2010. 4 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Funktionell komplementering av hypomucoid fenotypen av Novosphingobium sp. mutant stam Hx699. Than vildtypstammen Novosphingobium sp. (Rr2-17) och den mutanta stammen Hx699 transformerades med pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp. Stammarna ströks i ett "X" och var odlas ytterligare på PD agar vid 30 ° C under åtminstone 4 dagar att observera fenotyper. klicka här för att se en större version av denna siffra.
| komplemente plasmider | Antibiotikaresistensmarkörer | Citat |
| pBAD33 | cm r | 21 |
| pBAD33 :: Vid dapL | cm r | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | cm r | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | Centimeterr | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | cm r | 4 |
| pBAD33 :: Vs MURE | cm r | 18 |
| pRK290 | Tet r | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | Tet r | 17 |
Tabell 1: Funktionell komplemente plasmid som används i denna studie Förteckning av plasmider som används för funktionell komplettering analys.. Cm R och Tet R betecknar kloramfenikol och tetracyklinresistens respektive.
| stam namn | Organism | Genotyp | Fenotyp | Källa |
| AOH1 | E. coli | Δ DAPD :: Kan2, dapE6 | Auxotrof för diaminopimelat | Hudson Laboratory |
| TKL-11 * | E. coli | thr-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, tsx-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, hans-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-1, deoC1 | Tillväxt känsliga fenotyp var mutanten växer vid 30 ° C men inte en 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E. coli | LAM-, aspC13, FNR-25, rph-1 ilvE12, tyrB507 | Auxotrof för aminosyror; tyrosin, fenylalanin, leucin, isoleucin och valin | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Vildtyp) - | Hyper-slemmig | Savka Laboratory | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-slemmig | Savka Laboratory |
Tabell 2:. Bakteriestammar som användes i denna studie Förteckning över bakteriestammar tillsammans med respektive genotyper och fenotyper som används i denna studie. Observera att man kan få stammar (TKL-11 och DL39) som betecknas med asterisken direkt från Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många av de kurser som är en integrerad del av bioteknik och molekylär biovetenskap läroplan vid Rochester Institute of Technology har en laboratoriekomponent utöver föreläsningen del av kursen. Läroplanen för läsåret 2014-2015 innehåller totalt 48 kurser, 29 som innehåller ett laboratorium komponent som utgör cirka 60%. En sådan kurs är Fundamentals of växtbiokemi och patologi (FPBP), en blandad föreläsning / laborationer och bioseparationer: Principer och metoder (BPP), ett laboratoriebaserat kurs.
Laboratoriet del av varje kurs är utformad för att förstärka föreläsningsmaterial. Till exempel är biokemiska vägar och metabolism starkt betonas i FPBP och BPP. Några av de teman aminosyrametabolismen, peptidoglykan-biosyntesen, växt sekundär metabolism, bakteriell svar på miljö nischer, bland annat. Författarna har integrerade funktionell complemsenta som laborationer i båda banorna för att stärka förståelsen av metaboliska vägar som diskuteras i föreläsningen och eller pre-laboratorie presentationer. Fyra exempel på användning av funktionell komplettering experiment för att analysera funktionen av gener som är involverade i biokemiska vägar av lys, PG, tyr, phe och stringenta svaret hos bakterier diskuteras.
Det finns flera skäl till varför författarna har integrerat detta experimentella modul i sina kurser. För det första, exponering för funktionell komplettering analyser är ett utmärkt verktyg för att förstärka eller införa ämnen som är relaterade till genetik, evolution, genomik, bioinformatik och biokemi. För det andra är experimentet facile och kan åstadkommas på en kurs laboratoriemiljö. Alla reagens som används är säkra och de bakterier som används betecknas enligt skyddsnivå 1 och är inte patogena. Som sådan, författarna är villiga att göra reagens såsom plasmider och bacterial stammar tillgängliga för vem som helst som är i intresserad av att införliva funktionell komplettering som en del av sin erfarenhet av undervisning. Det bör noteras att två av de bakteriestammar (TKL-11 och DL39) erhölls direkt från Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Det är viktigt att notera att det finns flera viktiga steg till funktionell komplettering protokollet. Det första steget är att se till att mutanten (er) kan odlas innan de börjar några experiment. Anledningen är att enligt tabell 2, finns det flera genotyper associerade med varje mutant. För att kunna växa mutanten att förbereda kompetenta celler före försöket, försöker odla mutanten med eller utan kemikalier som krävs och eller temperaturkrav avseende PG MURE mutanten. Detta är också en undervisningstillfälle, eftersom det kommer att visa sig att mutanten är giltig innan några experiment.
Detbör också noteras att även om detta är ett utmärkt verktyg för att testa funktionen (s) av gener, det fungerar inte alltid beror på flera faktorer såsom kodonanvändning där gen (er) av intresse inte kan korrekt översättas på grund av bristande lämpliga tRNA i mutantorganism. Detta kan dock kringgås genom kodon optimering av den öppna läsramen eller cDNA under kloning steget vilket normalt sker genom att syntetisera genen av intresse genom att ändra nukleotider för att matcha kodonanvändningen av mutanten (er). En annan fråga är att vissa eukaryota proteiner kräver post-translationella modifieringar för funktion. Post translationell modifiering är inte en funktion av bakterier och som sådan kan man inte kunna använda den här tekniken för att testa funktionen (s) av gener med bakterie- mutanter.
Betydelsen av den teknik som vi betonar i kurserna är att Konkurrensverket är ett utmärkt sätt att testa att funktionen hos gener in vivo. Characterization of enzymer är mestadels baserade på in vitro-studier där enzymet renas och traditionella enzymatiska analyser genomförs. 29 Även traditionella enzymatiska analyser är bra att mäta eller upptäcka enzymatisk aktivitet, kan man ofta "kraft feed" enzymet med kommersiellt tillgängliga substrat som inte är ren eller naturlig för enzymet. 30 ett in vivo system, såsom FCA ger en mer autentisk bevis avseende funktionen hos gener med tanke på att den är i drift under fysiologiska betingelser som appose till in vitro som normalt inte under fysiologiska betingelser. 2 med tanke på bristen på information om funktionerna hos många gener och det faktum att de flesta kommentarer är baserade på förutsägelse, 31 bemästra denna teknik kommer att underlätta försök att belysa funktionerna hos många gener som förblir oklar eller de som för närvarande bedöms ha förmodade funktioner i olika offentliga databaser.
jove_content "> En av de frågor som rör teknik som ofta upplevs är vid framställningen av de kompetenta cellerna. Man bör se till att cellerna är korrekt beredda att se till att det finns tillräckligt med celler som skall omvandlas i Förutom att se till att cellerna är ordentligt tvättas med vatten och glycerol för att förhindra valvbildning under elektroporation processen. Man bör också vara medveten om fenotypen av mutanten genom att se till att cellerna odlas med den lämpliga kemiska eller vid rätt temperatur för att underlätta både den initiala tillväxten av mutanten och även för funktionell komplettering analysen.När denna teknik är behärskar, kan forskare använder funktionell komplettering analys för att bedöma funktionen hos gener, så länge som det finns en lämplig mutation i en organism som finns tillgänglig för att underlätta denna analys. Observera att protokollet i detta manuskript beskriver användningen av bakterier. Emellertid kan andra organismer såsomväxter och däggdjursceller, bland annat kan användas för att bedöma funktionen hos gener. 32-33 Man skulle bara måste se till att rätt vektorer används förutom att optimera transformerande och eller transfektion av cellerna för att underlätta experimentet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
AOH och MAS erkänner College of Science och Thomas H. Gosnell School of Life Sciences vid Rochester Institute of Technology för stöd. Detta arbete stöddes delvis av USA National Science Foundation (NSF) utmärkelse till AOH MCB-1.120.541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S.
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y.
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
