Summary
生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。
Abstract
機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。
Introduction
遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。
原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コースで議論されたトピックのいくつかは、彼らの研究分野で提携しているので、著者らは、これらの2実験室ベースのコースに、それぞれの研究プログラムで使用されている技術と実験的なツールの多くが組み込まれています。その一例は、植物、ペプチドグリカンや細菌からの緊縮応答代謝から酸代謝をアミノ酸に関連する講義資料を強化するために、実験室の練習として機能的相補性です。
FPBBコースで議論されている植物由来のアミノ酸経路のうちの3つがあることリシン（リジン）の、チロシン（tyrで）とフェニルアラニン（Pheで）。動物がLys デノボを合成する遺伝子機構を欠いているため、Lysの経路があるため、すべての動物、特にヒトのための必須アミノ酸などのアミノ酸の重要性のコースで強調表示されます。また、最近、植物は細菌のものとは大きく異なるリジンの合成経路を用いることが発見されました。この発見は、部分的にEの機能的相補性によって促進されましたコリジアミノピメリン酸（DAP）のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの酵素L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）をコードする遺伝子を用いて、変異体2、中間ジアミノピメリン介してリジンの合成のための変形経路は、 図1に示されている。また、リジンの合成は、高度に調節されているアミノ酸のアスパラギン酸由来のファミリーを介して容易にする。3タンパク質SYNTにおけるそれらの重要性に加えてhesisは、TyrおよびPheのための経路はフェニル化合物の同化作用のための前駆体化合物のような植物の防御化合物の合成関与となる中で、その重要性を考慮強調表示されています：アルカロイド、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、とりわけヒドロキシ酸を4 TyrでおよびPhe経路は、植物や細菌の同化経路の違いを示すために強調されています。植物において、酵素は、TyrおよびPheへの異化作用における主に関与し、これらのアミノ酸の同化に関与していないのに対し、細菌は、酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）は、両方のアミノ酸の同化作用に関与しています。 （ 図2）。4
ペプチドグリカンの構造に関するグラム陽性およびグラム陰性菌（PG）との相違点は、FPBPコースで強調表示されます。グラム陰性菌のPGは、そのほとんど事実にに基づいて、植物病理学に関する関心があります植物病原体は、グラム陰性です。トップ10の細菌フィト病原体に関する最近のレビューは、すべてのグラム陰性であることを明らかにしました。細菌は属からのものであった： シュードモナス 、 ラルストニア 、 アグロバクテリウム 、 キサントモナス 、 エルウィニア 、Xylella、DickeyaとPectobacterium化学違いの5つのグラム陰性およびグラム陽性菌のPGステムを比較する架橋アミノ酸の差があります両方のタイプの酸です。 PGの異なる架橋のための最初のステップは、PG同化の細胞質工程で起こり、酵素UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）によって促進されます（ 図3A）。 MurEはペプチドステムの3番目の位置における特定のジアミン化合物の付加を触媒する大部分のグラム陰性細菌で6、最後から二番目のLysの前駆体、 メソ -diaminopimelate（
バイオセパレーションの場合：原則と実践（BPP）もちろん、細菌の培養のためのオープンとクローズドシステムの違いとどのように栄養のレベルは、環境の変化が議論されていると、両方のシステムで大幅に変更されます。これらのイベントは、「シフトダウン」や飢餓やアミノ酸やエネルギーの十分な供給を契機「シフトアップ」と呼ばれる規制の変更にリンクされています。細菌培養物を単一炭素源と化学的に定義された培地に豊かで複雑な媒体から転送されたときに、「シフトダウン」応答が発生する可能性があります。環境の変化が急速cessaにつながりますtRNAとrRNAの合成化。アミノ酸の生合成をアップレギュレートされていてもリボソーム、タンパク質およびDNA合成の欠如でこの停止をもたらします。
「ダウンシフト」の応答に続いて、既存のリボソーム培地または環境で利用できなくなったアミノ酸を合成する新しい酵素を生成するために使用されます。一定期間後、rRNAの合成と新しいリボソームが組み立てられ、細菌細胞の集団を減少した速度であるが成長し始めます。イベントのコースは「 緊縮応答」または「 ストコントロール」と呼ばれ 、世界的な細胞制御の一例であり、必要な基質およびエネルギー需要の利用可能性を補償するために、細胞の生合成機構を調整する機構と考えることができますされています8緊縮応答は、このような環境での栄養素のフラックスに迅速に対応するために、細菌を可能にし、貢献し、ENH栄養素およびまたは基板の可用性に関して迅速に変更することができる環境で競争する細菌の能力をances。8-9
緊縮応答は、アミノ酸、炭素、窒素、リン酸、および脂肪酸の利用が制限されている遺伝子発現において重要な役割を持っている。8,10-14この緊縮応答は、2個のヌクレオチド、グアノシン四リン酸（ppGpp）とグアノシンによって調整されています五（pppGpp）は、一般的にalarmone（P）ppGppとして一緒に呼ばれます。例えば、アミノ酸が限ら-れているタンパク質合成-alarmone、グアノシンのボトルネックにつながる可能性が3,5-（ビス）グアノシンの同化由来ピロリン酸（ppGpp）、3-二リン酸5 - 三リン酸（pppGpp）が蓄積セルインチ（p）ppGppレベルの変化は、直接、細胞増殖及びdevelopmenに関与している環境での基質の不足を克服するために応答を調節する遺伝子の発現に関与しますトン。このプロセスに関与する遺伝子のうちの2つがRELAとスポットと呼ばれています。 RelAのアミノ酸の制限の結果である非荷電tRNAの蓄積に応答に関与するリボソーム関連（p）ppGpp合成酵素です。二官能性（P）ppGpp合成酵素と加水分解酵素などのスポット機能します。スポットの合成酵素活性は、炭素および脂肪酸飢餓の欠如に応答に関与している。8のRelA /スポットホモログは、植物や細菌に広く分布しており、R ELA / Sポット時間 omologsのためのrshと呼ばれている。8,10 -12,16最近の原稿は、細菌Novosphingobium属 Rrを2月17日からこれらのalarmonesの合成に関与する特定のrshタンパク質が存在することを示した。17
ここでは、機能的相補アッセイにつなが4生化学的経路を提示します。この原稿で概説相補アッセイは正しくありませんするための手段を提供します鉱石は識別し、または生化学的経路の授業を補完するために、未知/推定機能（複数可）または教育ツールとしてを有することが予測される酵素を特徴づけるための手段として、このインビボアッセイを使用します。
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Protocol
注：著者は興味を持っている個人のための教育目的のための機能的相補性分析の組み込みを容易にするために、細菌株および組換えプラスミドを提供するために喜んでいます。機能的相補性実験を容易にするために使用したプラスミドは、表1に記載されています。
1.機能補完のためのプラスミドの構築を
- 機能的相補性のためのジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）のクローニング。
- V.からDAPLオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅A.から有棘とのcDNA シロイヌナズナとC. PCRによるラインハーディ 。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4デオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれと、鋳型DNAの0.5 ngのとのPfxの1単位を含めますDNAポリメラーゼ。
注：工場Aから3 DAPLオルソログの組換えクローニングに関連する完全な説明シロイヌナズナ （-dapL 時 ）、細菌Verrucomicrobium有棘 （Vsを -dapL）および藻類クラミドモナス（Crを -dapL）は、以前に公開されました。2,18-20
注：次のようにDAPLオルソログのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。
DAPL F- 対 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
DAPL R 対 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
DAPL F- での 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
DAPL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 ' で
Crの DAPL F-5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Crの DAPL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - トンにPCR断片のクローンを作成彼たpET30a組換えプラスミドを産生するためにプラスミドのpET30a :: 対 DAPL、たpET30a :: DAPLプライマー、制限酵素およびT4 DNAリガーゼを用いたpET30a :: クロム DAPL ました 。
- 簡単に言うと、17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。18-20
- 制限のpET30a :: Crの DAPLのためのXbaIおよびSalIおよびXbaIおよびHindIII酵素で機能的相補用プラスミドを作成するには、DAPLプラスミドでのpET30a :: Vsの DAPLとのpET30aを::ダイジェスト。プラスミドpBAD33 :: 対 DAPLを生成するためにT4 DNAリガーゼを用いてプラスミドpBAD33にインサートを連結。 pBAD33 :: DAPLとpBAD33 :: Crの DAPL で 。
- インサート50ngのおよび20 ngをインキュベート1×リガーゼ緩衝液中でベクター、一晩17℃でT4 DNAリガーゼ1単位。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34μgの/ mlの-1カナマイシンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。20
- V.からDAPLオープンリーディングフレーム（ORF）を増幅A.から有棘とのcDNA シロイヌナズナとC. PCRによるラインハーディ 。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4デオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれと、鋳型DNAの0.5 ngのとのPfxの1単位を含めますDNAポリメラーゼ。
- A.からのチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）のクローニング機能的相補性のためのシロイヌナズナ 。
注：A.からのcDNAのクローニングに関する完全な詳細At5g36160は、以前に記載されている遺伝子座タグによって注釈さシロイヌナズナ 4- PCRによりcDNAを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、および鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。
注：CLのために使用されるプライマー次のようにAt5g36160のoningは、次のとおりです。
なtyrB F- での 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - EcoR1とのSal1でPCR断片を消化することによって、組換えプラスミドのpET30a :: At5g36160を生成するために、プラスミドのpET30aへの断片のクローンを作成。後述のようにT4 DNAリガーゼを用いたpET30a中にフラグメントにライゲーション4
- 、機能的相補性プラスミドの作成制限をXbaIおよびHindIII酵素でたpET30a :: At5g36160を消化し、T4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: At5g3160を生成するために同じ制限酵素部位を用いてpBAD33にインサートを連結します。
- 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換LBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面が34 / mlの-1 chloを補っ24時間37℃でインキュベートすることによってラムフェニコール4
- PCRによりcDNAを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、および鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。
- V.からUDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）のクローニング機能的相補性のための有棘 。
注：V.から牟礼ORFのクローニング有棘は、以前に記載されている。18- PCRによるオープンリーディングフレームを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後、プラスミドpET100D :: Vsのむれを生成するために、プラスミドpET100Dにクローニングします。
注：以下のように対牟礼のクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。
MurE F-5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT 対 -3 '
対MurE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - 機能的相補性のためのプラスミドを作製するために、pET100D :: 対牟礼ダイジェスト
制限XbaIとのSal1酵素およびT4 DNAリガーゼを用いて組換えプラスミドpBAD33 :: Vsのむれを生成するためにpBAD33への挿入を連結。- 一晩17℃で、T4 DNAリガーゼの1単位と一緒に、1×リガーゼ緩衝液中で、インサートの50 ngのベクターの20 ngのをインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換24時間37℃でインキュベートすることにより34 / mlの-1のクロラムフェニコールを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面。8
- PCRによるオープンリーディングフレームを増幅します。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとのPfx DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後、プラスミドpET100D :: Vsのむれを生成するために、プラスミドpET100Dにクローニングします。
- 機能的相補性のためのNovosphingobium属からRELA / sのポット（RSH）のクローニング。
注：Novosphingobium属からのrshのクローニングは、以前に記載されている17。- 599ヌクレオチドupstに加えてのrsh ORFを増幅PCRによる終結部位で下流の開始部位と46ヌクレオチドの連。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後のpCR2.1 :: のNSPにrshを生成するために、プラスミドpCR2.1にクローニングします。
- 増幅されたPCR断片の1μlを、pCR2.1ベクターの1μlを、塩溶液1μlおよび水の1μLをインキュベートします。 5分間25℃でインキュベートし、ライゲーションの2μlのE.へ大腸菌細胞、および37をインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための画面が 24時間Cを°。
注：以下のようにrshのクローニングに用いたプライマーは以下のとおりです。
rshのF-5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rshのR- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - 機能的相補のために、プラスミドpCR2.1を消化:: NSPは EcoR1でrshと組換えプラスミドpRK290を生産するために広い宿主範囲pRK290への挿入を連結:: NSPは 、T4 DNAリガーゼを用いてrshを実行。
- 17℃で一晩、インサートの50 ngのと1×リガーゼ緩衝液中のベクターの20 ngのとT4 DNAリガーゼの1単位をインキュベートします。 E.へのライゲーションを変換37をインキュベートすることにより、10μg/ mlの-1テトラサイクリンを補充したLBプレート上のコロニーのための大腸菌 DH5α細胞と画面 24時間°C。17
- 増幅されたPCR断片の1μlを、pCR2.1ベクターの1μlを、塩溶液1μlおよび水の1μLをインキュベートします。 5分間25℃でインキュベートし、ライゲーションの2μlのE.へ大腸菌細胞、および37をインキュベートすることによりを50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLBプレート上のコロニーのための画面が 24時間Cを°。
- 599ヌクレオチドupstに加えてのrsh ORFを増幅PCRによる終結部位で下流の開始部位と46ヌクレオチドの連。 60°Cで2分間、30秒、72℃、15秒間94℃の30サイクル、続いて2分間94℃で1サイクルを使用してください。各プライマー12ピコモル、1 mMの硫酸マグネシウム、0.5 mMの4種のデオキシヌクレオチド三リン酸、鋳型DNAとTaq DNAポリメラーゼの1単位の0.5 ngのそれぞれが含まれます。その後のpCR2.1 :: のNSPにrshを生成するために、プラスミドpCR2.1にクローニングします。
形質転換を容易にするためのエレクトロコンピテント細菌細胞の調製
注：エレクトロコンピテント細胞の調製は、少量（ すなわち、250ml）中に縮小することができる培養物の1.0 Lのプロトコル26に基づいています。このプロトコルをbすることができますのでご注意くださいeはFCAを容易にするために、本 稿に記載されている有能なすべての株を作製するために使用される。22
- フラスコ内に単一コロニーを液体培地50mlに接種し、一晩成長し、この工程（ 表2）を開始する前に、変異体の遺伝子型を確認してくださいとなっています。
- 2日目に、一晩培養物50mlで適切な培地（ 大腸菌変異株とNovosphingobium属のためのPDのためのLB）の1.0 Lに接種し、30℃で（対数期）0.4から0.6へのOD 600に成長C.
- 4℃で15分間5000×gで遠心分離することによって収穫の細胞は、上清をデカントし、滅菌氷冷純粋なH 2 O 500ml中にペレットを再懸濁します
- 遠心分離し、細胞を4℃で20分間、5000×gで、上清を除去し、無菌の氷冷10％グリセロールの250ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
- 4で20分間5,000×gで細胞を遠心 °C、スーパーをデカント浮遊性の、および10％グリセロールの2.0ミリリットルでペレットを再懸濁。
- ドライアイス - エタノール浴中に管を配置することによって、凍結直ちにマイクロ遠心チューブに50μlのを転送することにより、細胞をアリコートし、。エレクトロポレーションのために-80℃でコンピテント細胞を保管してください。
相補プラスミドを持つ細菌細胞の3エレクトロポレーション
- エレクトロポレーションのために、コンピテント細胞のアリコート（50μl）をへの組換えプラスミドの1.0μlの（10-50 ngの）を追加し、5分間氷上に置きます。
- エレクトロポレーションキュベットにピペッティングを介して混合物を移し、以下の設定にエレクトロポレーション装置を設定：25μFの容量、2.5 kVで、200オームの抵抗とパルスを提供します。
- 15ミリリットルコニカルチューブにピペットを用いてエレクトロポレーションキュベットと転送にリカバリメディア（LB）の1.0ミリリットルを追加します。振とう培養器で60分間穏やかに回転して回復します。
- RECOから培養物100μlをプレート非常にピペッティングすることにより形質転換体を選択するために、寒天プレート上にステップし、滅菌スプレッダーを使用して拡散します。
注記：適切な寒天プレートを作るために抗生物質や遺伝子型を確認するには、この手順を開始する前に、表1と表2を確認してください。
Lを使用した機能的相補性を容易にするために、AOH1の4形質転換、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）
- 相補性解析のために、空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したエレクトロポレーションプロトコルを使用して、別々の形質転換事象でDAPL発現ベクターでAOH1を変換します。
- 50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1のクロラムフェニコールおよび50μg/ ml -1のカナマイシンを添加したLB寒天培地上にプレーティングすることによって、形質転換体を選択します。
- LB私にストリーキングによってレプリカメッキコロニーによる機能補完のためのテスト0.2％及び50μg/ mlの-1 DAPおよび34 / mlの-1カナマイシンなし（w / v）のアラビノースとdium。
- 24時間、30℃でプレートをインキュベートし、その結果を観察します。
注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一のDAPL遺伝子が変異体バックグラウンドで表現されている唯一のDAPを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。
UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-グルタミル-2,6- メソ -diaminopimelateリガーゼ（むれ）を使用して機能的相補性を容易にするために、TKL-11の5変容
- 空のベクター（pBAD33）とし、セクション3.0で概説したプロトコルを使用してのMurE発現するベクター（pBAD33 :: VsmurE）と変異型を変換します。
- LB寒天培地上でプレートを選択した形質転換体は、/ ml -1のクロラムフェニコール50μg/ mlの-1チミンおよび34μgのを補充し、24時間、30℃でプレートをインキュベートします。
- コントロールと2 LB培地+ 0.2％（w / v）でアラビノースおよび50μg/ ml -1のチミンへの実験的な変換の両方からコロニーをストリーキングやメッキによって補完のためのテスト。
- 視覚的に増殖表現型を評価するために24時間、42℃で30℃、他に一つのプレートをインキュベートします。
注：結果は、変異体はむれ遺伝子がベクターのみの対照と比較して、変異体バックグラウンドで表現されている場合にのみ、42℃で増殖することが可能であることを示す必要があります。
チロシンアミノトランスフェラーゼを使用した機能的相補性を容易にするために、DL39の6.変換（なtyrB）
- LB寒天プレート上pBAD33もしくはpBAD33 :: At5g36160のいずれかとDL39を変換して、選択した形質転換体は、セクションで概説した50μg/ mlの-1チロシン、50μg/ mlの-1フェニルアラニン、およびプロトコルを使用して、34 / mlの-1クロラムフェニコールを補っ3.0。
- レプリカ50μg/ mlの-1フェニルアラニンおよび50μg/ ml -1のチロシン、50μg/ mlの-1アスパラギン酸、50μg/ mlの-1ロイシン、を50μg/ ml -1のバリンと最小限（M9）メディア上の-plateコロニー、 50μg/ mlの-1イソロイシン、を10μg/ ml -1のウラシル0.5％（w / v）のグリセロール、0.2％（w / v）でアラビノース。両方のプレートの同じコロニーを画線することによってフェニルアラニンおよびチロシンを欠くプレート上でもレプリカプレートコロニー。
- 増殖表現型を観察するために48時間、30℃でプレートをインキュベートします。
注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合、変異体は、唯一の変異体バックグラウンドでなtyrB遺伝子が発現されている場合にのみ、フェニルアラニンおよびチロシンを含まない培地上で生育することが可能であることを示す必要があります。
Novosphingobium属のHypomucoid表現型の機能的相補を容易にするために、Hx699の7変容。ひずみHx699
注：結果は、ベクターのみの対照と比較した場合にrshが変異体バックグラウンドで発現される場合ハイポムコイド表現型が補完されていることを示すべきです。
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Representative Results
様々な機能相補分析に使用される菌株は、 表2に記載されています。
機能的相補性解析：L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）
E.大腸菌二重変異体AOH1（ΔDAPD :: Kan2、dapE6）は DAPE遺伝子の変異とDAPD遺伝子の完全な欠失（ 図1）を保有します。このように、変異体は、DAPが提供されていない限り、成長することができません。これらの突然変異に、AOH1が栄養要求性であると考えられる。DAPLはPGおよびLys合成（ 図を容易にするために、THDPから直接L、L-ジアミノピメリン酸の合成を触媒としてAOH1は L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）オルソログの機能相補性解析に適しています1）。
AOH1変異体はLに増殖することができることを示す必要があり、L-DAPを含まない培地は、組換え酵素はLにTHDPを変換することができることを実証し、 DAP / Lysの経路にDAPDとDAPE酵素工程を回避L-DAP（ 図5）。
機能的相補性解析：UDP - N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（むれ）
メソ -diaminopimelate（m個 -dap）は、グラム陰性菌のPG中の架橋アミノ酸です。酵素UDP- N -acetylmuramoylalanyl- Dの -glutamyl -2,6- メソ -diaminopimelateリガーゼ（のMurE）は、このプロセス（ - B 図3A）におけるm個の -dapの追加を容易にします。 E.大腸菌変異株TKL-11が muを保有します42で成長する変異体の能力をもたらす牟礼遺伝子でテーション 変異した酵素は、この温度で適切に折り畳むことができないという事実にC°。
結果は、対照と実験の両方で30°Cの許容温度での成長があることを実証します。しかし、のMurE（実験）を発現する細胞のみが42の非許容温度で成長することができるようになります °C（ 図6）。
機能的相補性解析：チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）
シロイヌナズナは、チロシンおよび4-ヒドロキシフェニル、およびAt5g36160（ 図2）によって注釈を付けフェニルアラニンおよびフェニルピルを相互変換することが可能であるチロシンアミノトランスフェラーゼをコードしている。4 E.コル私は（DL39）はフェニルアラニンとチロシンのための栄養要求性になりなtyrB遺伝子に変異を保有突然変異体。24-26変異体は、アミノ酸チロシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、ロイシン、イソロイシンおよびバリンについて栄養要求性であることに留意すべきである、並びに他の突然変異に起因します。菌株は、EからなtyrB酵素のオルソログのでなtyrBオルソログの機能を評価するのに適しています大腸菌は、タンパク質合成を促進するチロシンおよびフェニルアラニンの合成に直接関与しています。
結果は、DL39変異体は、チロシンとフェニルアラニンが提供されているのみM9に増殖することが可能である一方であることを示す必要があります。しかし、 シロイヌナズナ （At5g36160）を発現する株は、（F酵素がフェニルピルのトンから4 -ヒドロキシフェニル、およびフェニルアラニンからチロシンを合成することが可能であることが実証されたチロシンとフェニルアラニンを欠いたM9培地上で増殖することが可能ですigure 7）。4
機能的相補性解析：Rshを （RelAのとS POTホモログ）
Novosphingobium属からのrshをタンパク質。 （Rr2-17）は、N末端 ホスホ及び（P）ppGpp合成酵素ドメインの両方を含み、したがって、Eのスポットのような提案された二官能的な役割を持っていますコリ。これは、Eの相補性分析を用いて確認されていますNovosphingobium属からのrsh遺伝子を用いたRelAスポットに突然変異を保有大腸菌二重変異体、CF1693。 Hx699（RSH :: EZ-Tn5の、菅 R）という名前のRr2-17 のrsh変異体の表現型、ハイポムコイドをもたらし、これは非機能のrshによるものです。 Hx699のハイポムコイド表現型をすることによって評価しました クローン化されたネイティブRSH のNSP遺伝子によって容易に相補広宿主域ベクターpRK290に。ハイポムコイド表現型と一致して、空のベクターpRK290を保有Hx699が pRK290またはpRK290 :: rshのNspのを含む溶解性の低いトランス補完Hx699によって生成される多糖（pRK290 :: RSH Nspの ）とRr2-17を示す（ 図8） 。
図1：中間ジアミノピメリン酸（DAP）を進めるアスパラギン酸からリシンの同化経路の変異体は、経路は（A）アシル経路によってアノテートされ、（B）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（DDH）経路および（C）L 、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）経路。次のような酵素の略語の定義は次のとおりです：アスパラギン酸キナーゼ（のLysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ASD）、テトラヒドロシンターゼ（DAPA）、テトラヒドロレダクターゼ（のdapB）、テトラヒドロアシラーゼ（DAPD）、N -アシル-2-アミノ-6- ketopimelateアミノトランスフェラーゼ（DAPC）、N -アシル- L、L-2、 6 -ジアミノピメリン酸デアシラーゼ（DAPE）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（DapF）、 メソ -diaminopimelateデヒドロゲナーゼ（DDH）、 メソ -diaminopimelateデカルボキシラーゼ（リサ）、L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）、UDP-N -acetylmuramoyl-L-アラニルD-グルタミン酸： メソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）とリジルtRNA合成酵素（LysU） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： アミノ酸の初心者のための同化経路正弦及びフェニルアラニン（A）中間体コリスミ及び（B）から（ 大腸菌 ）細菌経路の中間arogenate介してプラント経路。次のような酵素のための略語は以下のとおりです。コリスミ酸ムターゼ/プレフェン酸デヒドラターゼ（PHEA）、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（タイラ）、およびチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）。図は2010年4、フォームプラブーとハドソンを採用し、変更された。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：ペプチドグリカン合成の細胞質工程 （A）ペプチドグリカン合成の細胞質工程の模式図。略語次のような酵素である：UDP- N -acetylglucosamineエノールピルビルトランスフェラーゼ（村）、UDP-Nの -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase（MurB）、UDP-Nは -acetylmuramate -L-アラニンリガーゼ（MURC）、UDP-N -アセチルmuramoylalanine-D -グルタミン酸リガーゼ（MURD）、UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタミン酸-2,6- メソ -diaminopimelateリガーゼ（のMurE）、UDP- N -acetylmuramoyl -トリペプチド-D-アラニル-D-アラニンリガーゼ（MurF ）、D-アラニン-D-アラニンリガーゼ（DDL）。 （B）二糖を示すペプチドグリカンの単量体単位の概略図N -acetylglucosamineグルコサミン（GlcNAc）とN -acetylmuramic（MurNAc）β-1,4-グリコシド結合を介して連結されました。ステムペプチドの3位のアミノ酸はほとんどのグラム陽性細菌中で大部分のグラム陰性菌およびLysでメソ -diaminopimelate（m個 -dap）によって表す架橋に関与しています。_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：細菌における緊縮応答の概略モデル表現栄養劣悪な環境への曝露は、GTP（グアノシン三リン酸）にリン酸基を付加することによりalarmone（P）ppGpp（グアノシン五）をanabolizeするのrsh（RelAのまたはスポット）を誘導します。栄養豊富な環境への曝露は、成長阻害剤である（p）のppGppを加水分解するためのrshの発現を誘導します。図はラスキン氏らから採用され、修正された。2007年27 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：DAPLを用いた機能補完 AOH1 Eの機能補完。 V.細菌からL、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）遺伝子を持つ大腸菌変異有棘 （ 対 DAPL）、植物A.シロイヌナズナ （DAPL 時 ）及び藻類、C.ラインハーディ （Crの DAPL）。プラスミド、pBAD33、pBAD33 :: Vsの DAPL、pBAD33を保有:: DAPLとpBAD33 で :: Crの DAPL変異体は、50μg/ mlの有無にかかわらず0.2％（w / v）のアラビノースを添加したLB寒天プレートにレプリカプレーティングしましたL、L -ジアミノピメリンと30で成長させました 24時間Cを°。図を採用し、よりNachar ら変更された、2012年18は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：のMurEを用いた機能補完 TKL-11 Eの機能補完。 V.からUDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（むれ）遺伝子を持つ大腸菌変異有棘。プラスミドBAD33またはpBAD33 :: VsmurEを保有する変異体は、0.85％を用いて、10 -2、10 -3を OD 0.1の600にLB培地中で増殖させ、連続10 -1に希釈した生理食塩水（w / v）の。 5 種々の希釈μLの0.2％（w / v）のアラビノースを補充したLB培地上にレプリカプレーティングし、30℃、42で評価増殖させ °Cで24時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：DL39 E. の機能補完 A. からの軌跡タグAt5g36160によって注釈付きのチロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子を持つ 大腸菌 シロイヌナズナ 。プラスミドpBAD33またはpBAD33 :: At5g36160を保有する突然変異体を50μg/ ml -1のチロシン、50μg/ mlの-1フェニルアラニンを補充したLB寒天プレート上で選択し、34μgの/ ml -1のクロラムフェニコールしました。歪みが1.0のODのOD 600までLBブロス中で増殖させ、連続10 -1に希釈し、10 -2、10 -3 0.85％を用いて、生理食塩水（w / v）の。様々な希釈の5μlを、その後50μg/ mlの-1フェニルを補ったM9寒天プレート上にレプリカ培養しましたアラニンおよび50μg/ ml -1のチロシン、0.5％（w / v）のグリセロール、0.2％（w / v）でアラビノース、50μg/ mlの-1アスパラギン酸、50μg/ mlの-1ロイシン、50μg/ mlの-1バリン、50μg/ mlの-1イソロイシン、10μgの、また、フェニルアラニンおよびチロシンを欠くし、48時間30℃でインキュベートしたプレート上/ ml -1のウラシル。図は2010年4、フォームプラブーとハドソンを採用し、変更された。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 8：Novosphingobium属 のhypomucoid表現型の機能補完 。変異株 Hx699。 T彼野生型株Novosphingobium 属 。（Rr2-17）と変異株Hx699は pRK290またはpRK290 :: rshを Nspの形質転換した。株は、「X」に画線し、さらに30℃でPD寒天培地上で生育させました表現型を観察するために、少なくとも4日間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 相補プラスミド | 抗生物質耐性マーカー | 引用 |
| pBAD33 | CM R | 21 |
| pBAD33 :: DAPL で | CM R | 2 |
| pBAD33 :: Crの DAPL | CM R | 20 |
| pBAD33 :: 対 DAPL | CmR | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | CM R | 4 |
| pBAD33 :: 対牟礼 | CM R | 18 |
| pRK290 | テトR | 28 |
| pRK290 :: RSH Nspの | テトR | 17 |
表1： 本研究で使用した機能的相補性プラスミドの機能的相補性分析に使用したプラスミドのリスト。 CM RとのTet Rは、それぞれ、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン耐性を示します。
| ひずみ名 | 生体 | 遺伝子型 | 表現型 | ソース |
| AOH1 | 大腸菌 | ΔDAPD :: Kan2、dapE6 | ジアミノピメリンのための栄養要求性 | ハドソン研究所 |
| TKL-11 * | 大腸菌 | THR-1、leuB6（アム）、murE1、fhuA21、codA1、lacY1、TSX-95、glnV44（AS）、λ - 、pyrF101、 彼-108、thyA6、argG66、ilvA634、THI-1、deoC1 | 成長感受性表現型変異体は、42°C 30°Cではなく、成長しました | CGSC（＃5989） |
| DL39 * | 大腸菌 | LAM-、aspC13、FNR-25、RPH-1 ilvE12、tyrB507 | アミノ酸の栄養要求性。チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン | CGSC（＃6913） |
| Rr2-17 | Novosphingobium属 （野生型） - | ハイパームコイド | Savka研究所 | |
| Hx699 | Novosphingobium属。 | RSH :: EZ-Tn5の、菅R | ハイポムコイド | Savka研究所 |
表2：本研究で使用した細菌株この研究で使用されるそれぞれの遺伝子型と表現型と一緒に細菌株のリスト。アスタリスクで示さ株（TKL-11およびDL39）は大腸菌ジェネティックストックセンター（CGSC）（http://cgsc.biology.yale.edu/）から直接得ることができますのでご注意ください。
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Discussion
ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/実験室のコースとバイオセパレーションの基礎です：原則と実践（BPP）、実験室ベースのコース。
各コースの実験室の成分は、講義資料を強化するように設計されています。例えば、生化学的経路および代謝が重くFPBPとBPPで強調されています。トピックのいくつかは、アミノ酸代謝、ペプチドグリカン生合成、植物二次代謝、とりわけ環境ニッチに細菌の応答が含まれています。著者は、機能complemを統合しています講義およびまたはプレ実験室のプレゼンテーションで議論されている代謝経路の理解を強化する両コースでの実験室での演習としてentation。リジン、PG、Tyrを、Pheおよび細菌の緊縮応答の生化学的経路に関与する遺伝子の機能を分析するための機能的相補性実験を用いて、4つの例が説明されています。
著者は彼らのコースにこの実験的なモジュールを統合した理由はいくつかあります。まず、機能的相補性への曝露分析は、強化または遺伝学、進化、ゲノミクス、バイオインフォマティクスや生化学に関連するトピックを紹介するための優れたツールです。第二に、実験が容易であり、当然の実験室環境で行うことができます。使用されている試薬のすべてが安全であり、使用されている細菌はバイオセーフティーレベル1として示され、病原性はありません。このように、著者はそのようなプラスミドおよびBaなどの試薬を作るために喜んでいます彼らの指導経験の一部として機能補完を組み込んでに興味のある人に利用できるcterial株。細菌株（TKL-11およびDL39）の二つが大腸菌ジェネティックストックセンター（CGSC）（http://cgsc.biology.yale.edu/）から直接入手したことに留意すべきです。
機能的相補プロトコルのいくつかの重要なステップがあることに留意することが重要です。最初のステップは、変異体（複数可）は、任意の実験を開始する前に培養されることが可能であることを確認することです。その理由は、 表2の通り、各変異体に関連するいくつかの遺伝子型が存在することです。実験前コンピテント細胞を調製するための変異体を成長させるために、PG牟礼変異体に関する必要な化学物質およびまたは温度要件の有無にかかわらず変異体を成長してみてください。それは変異体は、任意の実験の前に、本物であることを証明するため、これはまた、教育の瞬間です。
それまた、この遺伝子の機能（単数または複数）を試験するための優れたツールであるが、それは常ににより、目的の遺伝子（単数または複数）は、適切性の欠如のために翻訳することができないそのようなコドンの使用など、いくつかの要因に動作しないことに留意すべきです変異生物で適切なのtRNA。しかし、これは、通常、変異体（単数または複数）のコドン使用頻度に適合するようにヌクレオチドを変化させることにより、目的の遺伝子を合成することによって行われ、クローニング工程の間のオープンリーディングフレームまたはcDNAのコドン最適化によって回避することができます。別の問題は、いくつかの真核生物のタンパク質が機能のために翻訳後修飾を必要とすることです。翻訳後修飾は、細菌の特徴ではなく、そのようなものとして、細菌の変異体を用いて、遺伝子の機能（複数可）をテストするには、この技術を使用することができない場合があります。
私たちはコースで強調技術の重要性は、FCAは、in vivoでの遺伝子の機能をテストするための優れた方法であるということです。のキャラクタリゼーション酵素は、主に酵素を精製し、従来の酵素アッセイが行われているin vitro試験に基づいている。29また、従来の酵素アッセイは、測定したり、酵素活性を検出するのに最適です、1ができ、多くの場合、「圧送」ではありません市販の基質を有する酵素酵素の純粋なまたは自然。30 FCAは、生理的条件下で、通常ではありません、それはインビトロに並置などの生理的条件下で動作しているという事実与えられた遺伝子の機能に関するより本格的な証拠を提供などのin vivo系。2考えます多くの遺伝子の機能に関する情報の欠如であり、最も注釈が予測に基づいており、31はこの技術を習得することは漠然と残る多くの遺伝子の機能または現在種々に推定される機能を有すると考えられるものを解明するための実験を容易にするという事実公共データベース。
jove_content ">しばしば経験される技術に関する問題の一つは、コンピテントセルの調製である。一つは、細胞を確認した細胞を作るに加えて、形質転換する十分な細胞が存在することを確認するために、正しく準備されていることを確認する必要がありますエレクトロポレーションプロセスの間にアーチを防ぐために、水とグリセロールと適切に洗浄されている。1つはまた、細胞が初期の成長の両方を容易にするために、適切な化学または適切な温度で成長していることを確認することにより、変異体の表現型を認識すべきです機能的相補性解析のための変異体とも。この技術を習得したら、研究者がいる限り、この分析を容易にするために利用可能な生物に適切な変異があるとして遺伝子の機能を評価するために、機能的相補アッセイを使用することができます。この原稿内のプロトコルは、細菌の使用が記載されていることに注意してください。しかしこのような、他の生物植物および哺乳動物細胞、特に、遺伝子の機能を評価するために使用され得る。32-33は、一つだけの適切なベクターは、実験を容易にするために、変換及び又は細胞のトランスフェクションの最適化に加えて使用されていることを確認しなければなりません。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
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