Summary
La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l'analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l'attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.
Abstract
Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l'insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l'analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l'analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.
Introduction
complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l'omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l'isolamento e l'identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e il mutante pyrF di E. coli. 1 Gli autori hanno usato questa tecnica per chiarire la funzione dei geni che sono coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta rigorosi nei loro programmi di ricerca e hanno incorporato questa tecnica nei loro programmi di insegnamento in Biotechnology e Bioscience Molecolare (BMB) programma al Rochester Institute of Technology (RIT).
Gli autori insegnano Fondamenti di Biochimica delle piante / Pathology (FPBP) (Hudson) e Bioseparations: principi e le pratiche (BPP) (Hudson / Savka), due corsi di base di divisione superiore di laboratorio elettiva nel programma BMB al RIT. Dal momento che alcuni degli argomenti che vengono discussi nei corsi sono affiliati con i loro interessi di ricerca, gli autori hanno incorporato molte delle tecniche e strumenti sperimentali che vengono utilizzati nei rispettivi programmi di ricerca in questi due corsi di laboratorio-based. Un esempio è complementazione funzionale come un esercizio di laboratorio per rinforzare i materiali delle lezioni relative al metabolismo degli aminoacidi da piante, peptidoglicano e la stringente metabolismo risposta da batteri.
Tre dei percorsi di aminoacidi dalle piante che sono discussi nel corso FPBB sono quello della lisina (LYS), la tirosina(Tyr) e fenilalanina (phe). Il percorso lys è evidenziata in corso per l'importanza degli aminoacidi come un amminoacido essenziale per tutti gli animali in particolare gli esseri umani poiché gli animali non hanno la macchina genetica di sintetizzare lys de novo. Inoltre, è stato recentemente scoperto che le piante utilizzano un percorso per la sintesi di lys che è significativamente diversa da quella dei batteri. Questa scoperta è stata parzialmente facilitato da complementazione funzionale del E. coli diaminopimelate (DAP) mutanti utilizzando un gene che codifica l'enzima L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) dalla pianta modello Arabidopsis thaliana. 2 I percorsi varianti per la sintesi del lys attraverso la diaminopimelate intermedi sono mostrati in Figura 1. Oltre , la sintesi di lys facilita attraverso l'aspartato derivato famiglia di amminoacidi che è altamente regolata. 3 Oltre alla loro importanza in synt proteineESI, i percorsi per tyr e phe sono evidenziate data la loro importanza nel servire come composti precursori per l'anabolismo di composti fenilpropanoidi prevede la sintesi di composti difesa delle piante quali:. alcaloidi, lignine, flavonoidi, isoflavoni, acido idrossicinnamico tra gli altri 4 Il tyr e percorsi phe sono state evidenziate anche per mostrare la differenza tra l'impianto e percorsi di anabolizzanti batteriche. Nei batteri, l'aminotransferasi tirosina (TyrB) è coinvolto nella anabolismo dei due amminoacidi, che nelle piante, l'enzima è principalmente coinvolto nel catabolismo di tyr e phe e non è coinvolta nella anabolismo di questi aminoacidi. (Figura 2). 4
Le differenze tra Gram positivi e Gram negativi per quanto riguarda la struttura del peptidoglicano (PG) sono evidenziati nel corso FPBP. Il PG dei batteri Gram negativi è di interesse rispetto patologia vegetale in base al fatto che la maggior partepatogeni delle piante sono Gram negativi. Una recente revisione per quanto riguarda i primi 10 batteriche fito-patogeni ha rivelato che tutti sono Gram-negativi. I batteri erano dalla generi:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Una delle differenze chimiche confrontando lo stelo PG di batteri Gram positivi negativi e Gram è la differenza tra la reticolazione amminico acidi di entrambi i tipi. Il primo scatto di tale diverso reticolazione PG si verifica nella fase citoplasmatica di PG anabolismo ed è facilitata dall'enzima UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (mûre) (Figura 3A). Mure catalizza l'aggiunta di un particolare composto diammina in terza posizione dell'asta peptide. 6 Nella maggior parte dei batteri Gram negativi, i lys penultimo precursore, meso -diaminopimelate (
Nei Bioseparations: Principles and Practices corso (BPP), le differenze tra i sistemi aperti e chiusi per la coltivazione di batteri e come nutriente livelli cambierà in modo significativo in entrambi i sistemi a causa di cambiamenti ambientali sono discussi. Questi eventi sono legati a cambiamenti normativi chiamato "spostamento verso il basso" o "Shift up" attivati da fame o un adeguato apporto di aminoacidi o di energia. La risposta "scalare" può verificarsi quando una coltura batterica viene trasferito da un supporto ricco e complesso ad un mezzo chimicamente definito con una singola fonte di carbonio. Questo cambiamento nell'ambiente porta alla rapida Cessazione della sintesi tRNA e rRNA. Questa cessazione comporta la mancanza di ribosomi, proteine e la sintesi del DNA, anche se la biosintesi degli amminoacidi sono upregulated.
Dopo la risposta "scalare", i ribosomi esistenti siano utilizzati per produrre nuovi enzimi per sintetizzare gli amminoacidi non disponibili a medio o ambiente. Dopo un periodo di tempo, la sintesi rRNA e nuovi ribosomi sono assemblati e la popolazione di cellule batteriche comincia a crescere anche se ad un tasso ridotto. Il corso degli eventi è denominata "risposta stringente" o "controllo rigoroso" ed è un esempio di regolazione cellulare globale e può essere pensato come un meccanismo per la regolazione macchine biosintetica della cellula per compensare la disponibilità dei substrati necessari e fabbisogno energetico . 8 la risposta rigorosa consente quindi di batteri di rispondere rapidamente ai flussi di nutrienti nell'ambiente e contribuisce e ENHANCES la capacità dei batteri di competere in ambienti che possono cambiare rapidamente quanto riguarda nutrienti eo disponibilità di substrato. 8-9
La risposta stringente ha un ruolo fondamentale nel espressione genica quando la disponibilità di aminoacidi, carbonio, azoto, fosfato e acidi grassi sono limitati. 8,10-14 Questa risposta stringente è coordinata da due nucleotidi, guanosina tetrafosfato (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) comunemente indicata insieme come il alarmone (p) ppGpp. Ad esempio, quando gli amminoacidi sono limitati-che può portare ad un collo di bottiglia di proteine sintesi-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivato da anabolismo di guanosina difosfato 3-5-trifosfato (pppGpp) accumula nella cella. La variazione del livello di (p) ppGpp è coinvolto nella espressione dei geni che regolano la risposta a superare la mancanza di substrati per l'ambiente che sono direttamente coinvolti nella crescita cellulare e SVILUPPOt. Due dei geni che sono coinvolti in questo processo sono chiamati RELA e Spot. RelA è un (p) ppGpp sintetasi ribosoma-associata che è coinvolto nella risposta all'accumulo di tRNA caricate che è il risultato di limitazione aminoacidi. funzioni di punto come un bifunzionale (p) ppGpp sintetasi e idrolasi. L'attività sintetasi di spot è coinvolto nella risposta alla mancanza di carbonio e acido grasso inedia. 8 Le omologhi RelA / SPOT sono diffusi nelle piante e batteri e sono indicati come Rsh per R ELA / S pot h omologs. 8,10 -12,16 un recente manoscritto dimostrato che vi è una specifica proteina Rsh coinvolto nella sintesi di questi alarmones dal batterio Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Qui vi presentiamo quattro vie biochimiche impastoiati ai saggi di complementazione funzionale. I saggi di complementazione delineati in questo manoscritto fornisce una strada per explminerale di impiegare questo test in vivo come un mezzo per identificare e caratterizzare o enzimi che sono previsti ad avere funzione sconosciuta / putativa (s) o come strumenti didattici per integrare l'insegnamento di vie biochimiche.
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Protocol
NOTA: Gli autori sono disposti a fornire ceppi batterici e plasmidi ricombinanti per facilitare l'inserimento di analisi complementazione funzionale a scopo didattico per gli individui che sono interessati. I plasmidi che sono stati utilizzati per facilitare esperimenti di complementazione funzionali sono elencati nella Tabella 1.
1. Costruzione di plasmidi per complementazione funzionale
- Clonazione di Diaminopimelate aminotransferasi (dapL) per complementazione funzionale.
- Amplificare il quadro di lettura aperto dapL (ORF) dal V. spinoso e cDNAs da A. thaliana e C. reinhardtii mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei 4 deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di pfxDNA polimerasi.
NOTA: La descrizione completa di pertinenza della clonazione ricombinante di tre ortologhi dapL dalla pianta A. thaliana (A -dapL), il batterio Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) e l'alga Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) è stato pubblicato in precedenza. 2,18-20
NOTA: I primer utilizzati per la clonazione degli ortologhi dapL sono i seguenti:
Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
A dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
A dapL R-5'-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Clonare i frammenti di PCR in tegli plasmid pET30A per produrre i plasmidi ricombinanti, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Al dapL e pET30A :: Cr dapL utilizzando i primer, enzimi di restrizione e ligasi T4 DNA.
- In breve, incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 50 mg / ml -1 kanamicina incubando a 37 ° C per 24 ore. 18-20
- Per creare il plasmide per complementazione funzionale, digerire pET30A :: Vs dapL e pET30A :: A plasmidi dapL con gli enzimi di restrizione XbaI e Sali e XbaI e HindIII per la pET30A :: Cr dapL. Legare gli inserti nelle pBAD33 plasmide utilizzando ligasi T4 DNA per produrre i plasmidi pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: Al dapL e pBAD33 :: Cr dapL.
- Incubare 50 ng di inserimento e 20 ngdel vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 34 mg / ml -1 kanamicina incubando 37 ° C per 24 ore. 20
- Amplificare il quadro di lettura aperto dapL (ORF) dal V. spinoso e cDNAs da A. thaliana e C. reinhardtii mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei 4 deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di pfxDNA polimerasi.
- Clonazione di tirosina aminotransferasi (tyrB) da A. thaliana per complementazione funzionale.
NOTA: I dettagli completi per quanto riguarda la clonazione del cDNA da A. thaliana annotato dai tag locus At5g36160 è stata descritta in precedenza. 4- Amplificare il cDNA mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA.
NOTA: I primer utilizzati per la cldicazioni del At5g36160 sono i seguenti:
A tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Clonare il frammento nel pET30A plasmide per produrre i plasmidi ricombinanti pET30A :: At5g36160 digerendo il frammento PCR con EcoR1 e SAL1; legare nel frammento in pET30A usando T4 DNA ligasi, come descritto di seguito. 4
- Per creare il plasmide complementazione funzionale, digerire il pET30A :: At5g36160 con gli enzimi di restrizione XbaI e HindIII, e legare l'inserto in pBAD33 utilizzando gli stessi siti di enzimi di restrizione per produrre il plasmide ricombinante pBAD33 :: At5g3160 utilizzando ligasi T4 DNA.
- Incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasformare la legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 34 mg / ml chlo -1ramphenicol incubando 37 ° C per 24 ore. 4
- Amplificare il cDNA mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA.
- Clonazione di UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (Mure) da V. spinoso per complementazione funzionale.
NOTA: La clonazione del Mure ORF da V. spinoso è stato descritto in precedenza. 18- Amplificare l'open reading frame mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA. Poi clonare nel plasmide pET100D per produrre il plasmide pET100D :: Vs Mure.
NOTA: I primer utilizzati per la clonazione del Vs Mure sono i seguenti:
Vs Mure F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
vsMure R- 5'-GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - Per produrre il plasmide per complementazione funzionale, digerire il pET100D :: Vs Mure
Con gli enzimi di restrizione XbaI e SAL1 e legare l'inserto in pBAD33 per produrre il plasmide ricombinante pBAD33 :: Vs Mure utilizzando ligasi T4 DNA.- Incubare 50 ng dell'inserto e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x, insieme con 1 unità di T4 DNA ligasi, per una notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB addizionato con cloramfenicolo -1 34 mg / ml incubando 37 ° C per 24 ore. 8
- Amplificare l'open reading frame mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA. Poi clonare nel plasmide pET100D per produrre il plasmide pET100D :: Vs Mure.
- Clonazione di RelA / s pot (rsh) dal Novosphingobium sp per complementazione funzionale.
NOTA:. La clonazione del rsh da Novosphingobium sp è stato descritto in precedenza 17.- Amplificare la ORF rsh, oltre a 599 nucleotidi upstrisma di sito di inizio apertura e 46 nucleotidi a valle del sito di terminazione mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi Taq DNA. Poi clonare nel plasmide pCR2.1 per produrre pCR2.1 :: Nsp rsh.
- Incubare 1 ml di amplificato frammento di PCR, 1 ml di pCR2.1 vettore, 1 ml di soluzione di sale e 1 ml di acqua. Incubare a 25 ° C per 5 minuti e 2 ml di legatura in E. coli, e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 50 mg / ml -1 kanamicina incubando 37 ° C per 24 ore.
NOTA: I primer utilizzati per la clonazione del rsh sono i seguenti:
rsh F- 5'-GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rsh R- 5'-GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - Per complementazione funzionale, digerire il plasmide pCR2.1 :: Nsp rsh con EcoR1 e legare l'inserto nella vasta gamma di ospiti pRK290 per produrre il plasmide ricombinante pRK290 :: Nsp RSH utilizzando ligasi T4 DNA.
- Incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 10 mg / ml di tetraciclina -1 incubando 37 ° C per 24 ore. 17
- Incubare 1 ml di amplificato frammento di PCR, 1 ml di pCR2.1 vettore, 1 ml di soluzione di sale e 1 ml di acqua. Incubare a 25 ° C per 5 minuti e 2 ml di legatura in E. coli, e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 50 mg / ml -1 kanamicina incubando 37 ° C per 24 ore.
- Amplificare la ORF rsh, oltre a 599 nucleotidi upstrisma di sito di inizio apertura e 46 nucleotidi a valle del sito di terminazione mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi Taq DNA. Poi clonare nel plasmide pCR2.1 per produrre pCR2.1 :: Nsp rsh.
2. Preparazione di cellule batteriche Electro-competenti per facilitare la trasformazione
NOTA: La preparazione di cellule elettro-competenti si basa sul protocollo 26 per 1,0 L di coltura che può essere ridotta a un volume più piccolo (cioè 250 ml). Si prega di notare che questo protocollo può be usato per fare tutti i ceppi che competenti descritti in questo manoscritto per facilitare FCA. 22
- Seminare 50 ml di terreno liquido con una singola colonia in un pallone e crescere durante la notte, avendo cura di controllare il genotipo mutante prima di iniziare questo passaggio (Tabella 2).
- Il secondo giorno, inoculare 1.0 L del mezzo appropriato (LB per E. coli mutanti e PD per Novosphingobium sp) con l'50 ml della cultura durante la notte, e crescere per un OD 600 di 0,4-0,6 (fase log) a 30 ° C.
- Celle di raccolta per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min a 4 ° C, decantare il surnatante, e risospendere il pellet in 500 ml di sterile ghiacciata puro H 2 O.
- Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C, decantare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di sterile ghiacciata 10% glicerolo.
- Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C, decantare il supernatant, e risospendere il pellet in 2,0 ml di 10% glicerolo.
- Aliquotare cellule trasferendo 50 microlitri in tubi micro-centrifuga e subito congelamento ponendo i tubi in un bagno di ghiaccio secco-etanolo. Conservare le cellule competenti a -80 ° C per elettroporazione.
3. elettroporazione di cellule batteriche con complementazione Plasmidi
- Per elettroporazione, aggiungere 1,0 microlitri (10-50 ng) del plasmide ricombinante ad una aliquota (50 ml) di cellule competenti e posto in ghiaccio per 5 min.
- Trasferire la miscela tramite pipettamento a un cuvetta elettroporazione e impostare l'apparato elettroporazione per la seguente impostazione: 25 uF capacità, 2,5 kV e 200 ohm resistenza e fornire un impulso.
- Aggiungere 1,0 ml di supporti di ripristino (LB) alla cuvetta elettroporazione e trasferire con una pipetta ad un tubo da 15 ml. Recuperare con rotazione dolce per 60 minuti in un incubatore agitazione.
- Piastra 100 ml di cultura dal recomolto passo sulle piastre di agar per selezionare per trasformanti pipettando e diffusione utilizzando una spatola sterile.
NOTA: Assicurarsi di controllare Tabella 1 e Tabella 2 prima di iniziare questo passaggio per controllare i antibiotici e genotipi per rendere le piastre di agar corretto.
4. Trasformazione di AOH1 per Facilitare complementazione funzionale utilizzando L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL)
- Per l'analisi complementazione, trasformare AOH1 con il vettore vuoto (pBAD33), e con i vettori di espressione DapL in eventi di trasformazione separati utilizzando il protocollo di elettroporazione descritto nel paragrafo 3.0.
- Selezionare trasformanti da placcatura su agar LB integrato con 50 mg / ml -1 DAP e 34 ug / ml cloramfenicolo -1 e 50 mg / ml -1 kanamicina.
- Test per complementazione funzionale da colonie replica-placcatura strisciando su LB medium con 0.2% (w / v) arabinosio con e senza 50 ug / ml -1 DAP e 34 ug / ml -1 kanamicina.
- Incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore e osservare i risultati.
NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il mutante è solo in grado di crescere su DAP supporto libero solo quando il gene è espresso dapL in background mutante rispetto al vettore unico controllo.
5. Trasformazione di TKL-11 a Facilitare complementazione funzionale utilizzando meso UDP N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6- -diaminopimelate ligasi (Mure)
- Trasformare il mutante con il vettore vuoto (pBAD33) e con il vettore che esprime Mure (pBAD33 :: VsmurE) utilizzando il protocollo descritto nel paragrafo 3.0.
- E selezionandone trasformanti su terreno LB agar integrato con 50 mg / ml timina -1 e 34 ug / ml -1 cloramfenicolo e incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore.
- Test per complementazione strisciando o placcatura colonie sia dal controllo e le trasformazioni sperimentali su due terreno LB più 0.2% (w / v) arabinosio e 50 ug / ml timina -1.
- Incubare una piastra a 30 ° C e l'altro a 42 ° C per 24 ore per valutare visivamente il fenotipo di crescita.
NOTA: I risultati dovrebbero mostrare che il mutante è in grado di crescere a 42 ° C solo quando il gene è espresso Mure in background mutante rispetto al vettore unico controllo.
6. Trasformazione di DL39 per Facilitare complementazione funzionale utilizzando tirosina aminotransferasi (tyrB)
- Trasforma DL39 sia con pBAD33 o pBAD33 :: At5g36160, e selezionare trasformanti su piastre di agar LB integrato con 50 mg / ml tirosina -1, 50 mg / ml fenilalanina -1, e 34 mg / ml cloramfenicolo -1 utilizzando il protocollo descritto nella sezione 3.0.
- Replicacolonie plate su terreno minimo (M9) con 50 mg / ml fenilalanina -1 e 50 mg / ml -1 tirosina, 50 mg / ml -1 aspartato, 50 mg / ml leucina -1, 50 mg / ml -1 valina, 50 ug / ml isoleucina -1, 10 ug / ml -1 uracile 0,5% (w / v) glicerolo, 0,2% (w / v) arabinosio. Anche colonie replica-piastra su piastre prive di fenilalanina e tirosina strisciando la stessa colonia di entrambe le piastre.
- Incubare le piastre a 30 ° C per 48 ore per osservare la crescita fenotipo.
NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il mutante è solo in grado di crescere su fenilalanina e tirosina media liberi, solo quando il gene è espresso tyrB in background mutante rispetto al vettore unico controllo.
7. Trasformazione di Hx699 per Facilitare complementazione funzionale del Hypomucoid fenotipo di Novosphingobium sp. Strain Hx699
NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il fenotipo ipo-mucoide è completata quando rsh è espressa in background mutante rispetto al vettore unico controllo.
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Representative Results
I ceppi batterici che sono impiegati nelle varie analisi di complementazione funzionali sono riportati in Tabella 2.
Analisi Funzionale complementazione: L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL)
Il E. coli doppio mutante AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) ospita una mutazione nel gene Dape e una delezione completa del gene DAPD (Figura 1). Come tale, il mutante è in grado di crescere se viene fornita DAP. A causa di queste mutazioni, AOH1 è ritenuto auxotrophic. AOH1 è adatto per l'analisi complementazione funzionale di L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) ortologhi come DapL catalizza la sintesi di L, L-diaminopimelate direttamente da THDP per facilitare la sintesi di PG e Lys (Figura 1).
AOH1 mutanti esprimere DapLs sono in grado di crescere su L, supporti L-DAP-liberi dimostrando che gli enzimi ricombinanti sono in grado di convertire THDP a L, L-DAP eludere la DAPD e Dape passaggi enzimatici nel pathway DAP / lys (Figura 5).
Analisi complementazione funzionale: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (Mure)
meso -diaminopimelate (m -DAP) è l'aminoacido reticolazione nel PG di batteri Gram-negativi. L'enzima UDP N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2,6- meso ligasi -diaminopimelate (Mure) facilita l'aggiunta di m -DAP in questo processo (Figura 3A - B). Il E. coli mutante TKL-11 ospita un muzione nel gene Mure che determina la capacità del mutante di crescere a 42 ° C a causa del fatto che l'enzima mutato non è in grado di piegare correttamente a questa temperatura.
I risultati dimostrano che c'è crescita a temperatura permissiva di 30 ° C sia il controllo e l'esperimento. Tuttavia, solo le cellule che esprimono Mure (esperimento) saranno in grado di crescere alla temperatura non permissiva di 42 ° C (Figura 6).
Analisi Funzionale complementazione: aminotransferasi tirosina (tyrB)
Arabidopsis thaliana codifica per una aminotransferasi tirosina che è in grado di interconversione tirosina e 4 idrossifenilpiruvato, e fenilalanina e phenylpyruvate annotato dal At5g36160 (Figura 2). 4 Il E. colI mutante (DL39) ospita una mutazione nel gene tyrB che rende auxotrophic per fenilalanina e tirosina. 24-26 Va notato che il mutante è auxotrophic per l'amminoacidi tirosina, fenilalanina, aspartato, leucina, isoleucina e valina, nonché a causa di altre mutazioni. Il ceppo è adatto per valutare la funzione di ortologhi tyrB poiché l'enzima ortologo TyrB da E. coli è direttamente coinvolta nella sintesi della tirosina e fenilalanina per facilitare la sintesi proteica.
Il risultato dovrebbe mostrare che, mentre il mutante DL39 è in grado di crescere su M9 solo quando sono forniti tirosina e fenilalanina. Tuttavia, il ceppo che esprime la A. thaliana (At5g36160) è in grado di crescere su terreni privi M9 tirosina e fenilalanina dimostrando che l'enzima è in grado di sintetizzare tirosina dal 4-idrossifenilpiruvato e fenilalanina da phenylpyruvate t (FIGURA 7). 4
Analisi complementazione funzionale: Rsh (RelA e S pot omologo)
La proteina Rsh da Novosphingobium sp. (Rr2-17) contiene sia l'phosphohydrolase N-terminale e (P) domini sintasi ppGpp, e, quindi, ha il ruolo bifunzionale proposto come punto di E. coli. Questo è stato confermato con l'analisi complementazione di un E. coli doppio mutante, CF1693 che ospita mutazione in Rela e Spot utilizzando il gene rsh da Novosphingobium sp. Il fenotipo del mutante rsh Rr2-17, chiamato Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R), si traduce in una ipo-mucoide e questo è dovuto ad una rsh non funzionale. Il fenotipo ipo-mucoide di Hx699 è stata valutata mediante complementazione facilitato dal gene nativo rsh Nsp che è stato clonatonelle ampio ospitanti gamma Vector pRK290. Coerentemente con il fenotipo ipo-mucoso, il Hx699 ospitare pRK290 vuoto vettore mostrano polisaccaride meno solubile di quella prodotta dal trans-integrata Hx699 (pRK290 :: rsh PSN) e Rr2-17 contenente pRK290 o pRK290 :: rsh Nsp (Figura 8) .
Figura 1:. Le varianti dei percorsi lisina anabolizzanti da aspartato che procedono attraverso il diaminopimelate intermedio (DAP) I percorsi sono annotati da (A) le vie acilici, (B) il diaminopimelate deidrogenasi (DDH) percorso e (C) L , L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) percorso. Le definizioni abbreviazione per gli enzimi sono le seguenti: aspartato chinasi (LysC), aspartatosemialdeide deidrogenasi (ASD), sintasi tetrahydrodipicolinate (daPa), reduttasi tetrahydrodipicolinate (DapB), acilasi tetrahydrodipicolinate (DAPD), N -acyl-2-amino-6-ketopimelate aminotransferasi (DAPC), N -acyl-L, L-2, deacylase 6-diaminopimelate (Dape), epimerasi diaminopimelate (DapF), meso deidrogenasi -diaminopimelate (DDH), meso decarbossilasi -diaminopimelate (Lysa), L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL), UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl- d-glutammato. ligasi meso -2,6-diaminopimelate (Mure) e lysyl-tRNA sintetasi (LysU) clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: percorsi anabolizzanti per la aminoacidi Tyrosine e fenilalanina. (A) Il batterica (E. coli) percorso attraverso il corismato intermedio e (B) il percorso pianta attraverso l'arogenate intermedio. Le abbreviazioni per gli enzimi sono i seguenti: Corismato Mutasi / prephenate deidratasi (PHEA), mutasi corismato, deidrogenasi prephenate (Tyra), e tirosina aminotransferasi (TyrB). Lo schema è stato adottato e modificato forma Prabhu e Hudson, 2010. 4 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La fase citoplasmatica della sintesi del peptidoglicano (A) Rappresentazione schematica della fase citoplasmatica della sintesi del peptidoglicano.. le abbreviazioni degli enzimi sono i seguenti: UDP N -acetylglucosamine enolpyruvyl transferasi (Mura), UDP N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP N -acetylmuramate-L-alanina ligasi (Murc), UDP N acetil-D-muramoylalanine ligasi -glutamate (Murd), UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-d-glutammato 2,6- meso ligasi -diaminopimelate (Mure), UDP N -acetylmuramoyl-tripeptide-d-alanil-d-alanina ligasi (MuRF ), ligasi D-alanina-D-alanina (DDL). (B) Rappresentazione schematica di una unità monomerica del peptidoglicano che mostrano il disaccaride N -acetylglucosamine (GlcNAc) e N -acetylmuramic (MurNAc) collegato tramite un legame glicosidico β-1,4. L'ammino acido in posizione 3 del peptide stelo è coinvolto in reticolazione indichiamo con meso -diaminopimelate (m -DAP) nella maggior parte dei batteri Gram-negativi e lys nella maggior parte dei batteri Gram-positivi._blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Rappresentazione Modello schematico della risposta stringente nei batteri L'esposizione a un ambiente povero di nutrienti induce Rsh (RelA o spot) per anabolize il alarmone (p) ppGpp (guanosina pentafosfato) con l'aggiunta di un gruppo fosfato di GTP (guanosina trifosfato). L'esposizione a un ambiente ricco di nutrienti induce l'espressione di Rsh di idrolizzare (p) ppGpp che è un inibitore della crescita. Lo schema è stato adottato e modificato da Raskin et al., 2007. 27 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Complementazione funzionale utilizzando DapL complementazione funzionale del AOH1 E. mutante coli con L L-aminotransferasi diaminopimelate gene, (dapL) dai batteri V. spinoso (Vs dapL), l'impianto A. thaliana (At dapL) e l'alga, C. reinhardtii (Cr dapL). Il mutante ospitare i plasmidi, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: Al dapL e pBAD33 :: Cr dapL sono stati replica-placcato su piastre di agar LB integrato con 0,2% (w / v) arabinosio con o senza 50 mg / ml L, L - diaminopimelate e sono stati cresciuti a 30 ° C per 24 ore. Lo schema è stato adottato e modificato da Nachar et al., 2012. 18 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6:. Complementazione funzionale utilizzando Mure complementazione funzionale del TKL-11 E. mutante coli con il -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico ligasi meso -2,6-diaminopimelate (Mure) gene UDP N da V. spinoso. Il mutante ospitare i plasmidi BAD33 o pBAD33 :: VsmurE sono state coltivate in terreno LB un OD 600 di 0,1 e sono stati diluiti a 10 -1, 10 -2 e 10 -3 con 0,85% (w / v) salina . 5 ml di varie diluizioni sono stati replica-piastrate su terreno LB addizionato con 0,2% (w / v) arabinosio e sono state coltivate valutato a 30 ° C e 42 ° C per 24 ore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: complementazione funzionale del DL39 E. coli con un gene tirosina aminotransferasi annotato dal tag locus At5g36160 da A. thaliana. Il mutante ospitare plasmidi pBAD33 o pBAD33 :: At5g36160 sono stati selezionati su piastre di LB agar addizionato con 50 pg / ml tirosina -1, 50 ug / ml fenilalanina -1, e 34 ug / ml cloramfenicolo -1. Il ceppo è stato coltivato in brodo LB ad un OD OD 600 di 1,0 e sono stati diluiti a 10 -1, 10 -2 e 10 -3 con 0,85% (w / v) salina. 5 ml delle varie diluizioni sono stati poi replica-placcati su piastre di agar M9 integrato con 50 mg / ml fenil -1alanina e 50 ug / ml tirosina -1, 0,5% (w / v) glicerolo, 0,2% (w / v) arabinosio, 50 ug / ml -1 aspartato, 50 ug / ml leucina -1, 50 ug / ml -1 valina, 50 ug / ml isoleucina -1, 10 ug / ml uracile -1, e anche su piastre prive fenilalanina e tirosina e sono state incubate a 30 ° C per 48 ore. Lo schema è stato adottato e modificato forma Prabhu e Hudson, 2010. 4 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: complementazione funzionale del fenotipo hypomucoid della sp Novosphingobium. ceppo mutante Hx699. Tegli ceppo selvatico Novosphingobium sp. (Rr2-17) e il ceppo mutante Hx699 sono stati trasformati con pRK290 o pRK290 :: rsh Nsp. I ceppi erano striati in una "X" e sono stati ulteriormente coltivate su PD agar a 30 ° C per almeno 4 giorni per osservare i fenotipi. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| plasmidi complementazione | marcatori di resistenza agli antibiotici | Citazione |
| pBAD33 | cm R | 21 |
| pBAD33 :: A dapL | cm R | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | cm R | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | CentimetroR | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | cm R | 4 |
| pBAD33 :: Vs Mure | cm R | 18 |
| pRK290 | tet R | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | tet R | 17 |
Tabella 1: plasmide complementazione funzionale utilizzato in questo studio Elenco dei plasmidi utilizzati per l'analisi complementazione funzionale.. Cm R e R Tet denotano cloramfenicolo e resistenza alla tetraciclina rispettivamente.
| nome Strain | Organismo | Genotipo | fenotipo | fonte |
| AOH1 | E. coli | Δ DAPD :: Kan2, dapE6 | Auxotrophic per diaminopimelate | Laboratorio Hudson |
| TKL-11 * | E. coli | THR-1, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, il suo-108, thyA6, argG66, ilvA634, Thi-1, deoC1 | Crescita fenotipo sensibile fosse il mutante cresce a 30 ° C ma non un 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E. coli | Lam, aspC13, FNR-25, RPH-1 ilvE12, tyrB507 | Auxotrophic per gli amminoacidi; tirosina, fenilalanina, leucina, isoleucina e valina | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Wild-type) - | Hyper-mucoid | Laboratorio Savka | |
| Hx699 | Sp Novosphingobium. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-mucoid | Laboratorio Savka |
Tabella 2:. Ceppi batterici utilizzati in questo studio Elenco dei ceppi batterici insieme con rispettivi genotipi e fenotipi utilizzati in questo studio. Si prega di notare che i ceppi (TKL-11 e DL39) indicate con l'asterisco possono essere ottenute direttamente dal Coli genetica Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
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Discussion
Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l'anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: principi e le pratiche (BPP), un corso di base di laboratorio.
La componente di laboratorio di ogni corso è stato progettato per rinforzare i materiali lezione. Ad esempio, vie biochimiche e il metabolismo sono fortemente stressati in FPBP e BPP. Alcuni degli argomenti includono il metabolismo aminoacido, biosintesi peptidoglicano, impianto metabolismo secondario, la risposta batterica a nicchie ambientali, tra gli altri. Gli autori hanno integrato complem funzionalesentazione come esercitazioni di laboratorio in entrambi i corsi per rafforzare la comprensione delle vie metaboliche che sono discussi nella conferenza e le presentazioni o pre-laboratorio. Quattro esempi di utilizzo di esperimento complementazione funzionale per analizzare la funzione dei geni coinvolti nella vie biochimiche del Lys, PG, Tyr, phe e la risposta rigorosa dei batteri sono discussi.
Ci sono diversi motivi per cui gli autori hanno integrato questo modulo sperimentale nei loro corsi. In primo luogo, l'esposizione a complementazione funzionale analisi è un ottimo strumento per rafforzare o introdurre argomenti che sono legati alla genetica, l'evoluzione, la genomica, la bioinformatica e biochimica. In secondo luogo, l'esperimento è facile e può essere eseguita in un ambiente di laboratorio corso. Tutti i reagenti che vengono utilizzati sono sicuri e batteri che vengono utilizzati sono indicati come livello di biosicurezza 1 e non sono patogeni. Come tale, gli autori sono disposti a fare i reagenti, quali plasmidi e baceppi cterial disponibili a chiunque sia interessato a incorporare in complementazione funzionale come parte della loro esperienza di insegnamento. Va notato che due dei ceppi batterici (TKL-11 e DL39) sono stati ottenuti direttamente dalla Coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
È importante notare che ci sono diversi passaggi critici al protocollo complementazione funzionale. Il primo passo è di assicurarsi che il mutante (s) sono in grado di essere coltivate prima di iniziare qualsiasi esperimenti. La ragione è che, come da Tabella 2, ci sono diversi genotipi associati a ciascun mutante. Al fine di far crescere il mutante per preparare cellule competenti prima dell'esperimento, provare a crescere il mutante con o senza le sostanze chimiche necessarie e requisiti di temperatura o per quanto riguarda il mutante PG Mure. Questo è anche un momento di insegnamento perché si dimostrerà che il mutante è autentico prima di qualsiasi esperimenti.
essoVa anche detto che anche se questo è un ottimo strumento per testare la funzione (s) di geni, non sempre funziona a causa di diversi fattori quali codon usage dove gene (s) di interesse non può essere adeguatamente tradotto a causa della mancanza di tRNA appropriate nell'organismo mutante. Tuttavia, questo può essere aggirato ottimizzazione codone della cornice di lettura aperta o cDNA durante la fase di clonazione che viene normalmente ottenuto sintetizzando il gene di interesse cambiando i nucleotidi per abbinare il codon usage del mutante (s). Un altro problema è che alcune proteine eucariotiche richiedono modificazioni post-traslazionali per la funzione. Post traduzionali non è una caratteristica di batteri e come tale si potrebbe non essere possibile utilizzare questa tecnica per verificare la funzione (s) di geni utilizzando mutanti batterici.
L'importanza della tecnica che si sottolinea nei corsi è che FCA è un ottimo modo per testare per la funzione dei geni in vivo. Caratterizzazione di enzimi sono per lo più basate su studi in vitro in cui l'enzima viene vengono eseguiti saggi enzimatici purificati e tradizionali. 29 saggi anche tradizionali enzimatici sono grandi per misurare o rilevare l'attività enzimatica, si può spesso "mangime forza" l'enzima con i substrati disponibili in commercio che non sono puro o naturale per l'enzima. 30 un sistema in vivo come FCA fornisce una prova più autentica sulla funzione dei geni dato che opera in condizioni fisiologiche come appose a in vitro che non è normalmente in condizioni fisiologiche. 2 dato mancanza di informazioni per quanto riguarda le funzioni di molti geni e il fatto che la maggior parte delle annotazioni si basano sulla previsione, 31 padroneggiare questa tecnica faciliterà esperimenti per chiarire le funzioni di molti geni che rimangono nebulosa o quelli che sono attualmente considerate avere funzioni putative nei vari banche dati pubbliche.
jove_content "> Uno dei problemi riguardanti la tecnica che viene spesso vissuto è nella preparazione delle cellule competenti. Si dovrebbe fare in modo che le cellule sono preparati correttamente per assicurare che vi sia abbastanza cellule da trasformare oltre a rendere che le celle vengono lavati correttamente con acqua e glicerolo per evitare inarcamento durante il processo di elettroporazione. si dovrebbe anche essere consapevoli del fenotipo mutante facendo in modo che le cellule sono coltivate con la sostanza chimica appropriata o alla temperatura adeguata per facilitare sia la crescita iniziale di il mutante e anche per l'analisi complementazione funzionale.Una volta che questa tecnica è padroneggiata, i ricercatori possono utilizzare dosaggio complementazione funzionale per valutare la funzione dei geni finché c'è una mutazione appropriato in un organismo disponibili per facilitare questa analisi. Si noti che il protocollo in questo manoscritto descrive l'uso di batteri. Tuttavia, altri organismi comepiante e cellule di mammifero, tra gli altri, possono essere utilizzati per valutare la funzione dei geni. 32-33 Si dovrebbe solo fare in modo che i vettori appropriati vengono utilizzati in aggiunta ad ottimizzare la trasformazione e o trasfezione delle cellule per facilitare l'esperimento .
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
