Summary
biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.
Abstract
Fonksiyonel tamamlama deneyi (FCA), yaygın olarak genler / enzimlerin fonksiyonu / rolünü açıklamak için kullanılan bir in vivo deneydir. Bu teknik biyokimya, genetik ve diğer birçok bilim dallarında çok yaygındır. tekniğin kapsamlı bir bakış peptidoglikan ve bakteriyel sıkı yanıt Bu yazıda bildirilen asitleri, amino ilgili biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için. Lisin (D, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) ve tirosin ve fenilalanin metabolizmasına katılan tirosin aminotransferaz (tyrB) metabolizmasında rol oynayan modeli bitki organizma Arabidopsis thaliana iki cDNA'lar vurgulanır. Buna ek olarak, bakteriyel peptidoglikan anabolik yolu ortada yer alan bir bakteri Verrucomicrobium spinosum gelen UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geninin analizi ile vurgulanırpeptidoglikan -linking. Bakteriyel sıkı yanıt da. Rsh (r ela / s Pot h omolog) bakteri Novosphingobium sp bir hiper-sümüksü fenotip sorumlu çift işlevli gen analizi ile bildirilen FCA dört örnekleri sunulmaktadır. Video yani lisin, peptidoglikan ve sıkı tepki, üçü üzerinde durulacak.
Introduction
Bir genin işlev (ler) açıklık / rol (ler) bağlamında fonksiyonel tamamlama homolog doğal tipte durumuna gözlemlenebilir fenotip ile belirli bir mutant geri belirli bir homolog ya da ortolog genin yeteneği olarak tanımlanır veya orthologous gen mutant arka plana cis veya trans tanıtıldı. Bu teknik yaygın izole ve işlev (ler) birçok genin / rolü (ler) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bir özel örnek olarak S. URA3 kullanılarak Candida albicans arasından orotidin-5-fosfat dekarboksilaz izolasyon ve tanımlanmasıdır S. cerevisiae ve E. pyrF mutant E. coli. 1 Yazarlar amino asitler, peptidoglikan ve araştırma programlarına sıkı yanıtın metabolizmasında rol alır ve B öğretim programlarına bu tekniği dahil olan genlerin işlevini aydınlatmak için bu tekniği kullandıkiotechnology ve Moleküler Bioscience (BMB) Rochester Institute of Technology (RIT) program.
İlkeleri ve Uygulamaları (BPP) (Hudson / Savka), RIT BMB Programı iki üst bölümü seçmeli laboratuar tabanlı dersler: Yazarlar Bitki Biyokimyası / Patoloji (FPBP) (Hudson) ve Biyoseparasyonlara temelleri öğretmek. derslerde ele alınmaktadır konuların bazıları araştırma alanları ile bağlı olduğundan, yazarlar bu iki laboratuar tabanlı derslerin içine kendi araştırma programlarında kullanılan teknikler ve deneysel araçları birçok dahil etmişlerdir. Böyle bir örnek bitkiler, peptidoglikan ve bakterilerden sıkı yanıt metabolizma asit metabolizmasını amino ilgili ders materyallerini güçlendirmek için bir laboratuvar egzersiz fonksiyonel tamamlama olduğunu.
FPBB ders açıklanan bitkilerden amino asit yollarının üç olduğu lisin (Lys) arasında, tirosin(Tyr) ve fenilalanin (Phe). Hayvanlar lys de novo sentez genetik makine yoksun beri lys yolu nedeniyle tüm hayvanlar, özellikle insanlarda için temel bir amino asit gibi amino asitin önemi sırasında vurgulanır. Buna ek olarak, son zamanlarda bitkilerin bakteri önemli ölçüde farklı olan Lys sentezi için bir yol kullanılması olduğu keşfedilmiştir. Bu buluş, kısmen, E. fonksiyonel komplemantasyon ile kolaylaştırıldı E. coli diaminopimelat (DAP) model bitki Arabidopsis thaliana enzim L L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) kodlayan bir gen kullanılarak mutantlar. Ara madde 2 diaminopimelat, Lys sentezi için varyant yolları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Buna ek olarak , lys sentezi çok düzenlenir amino asitler aspartat türetilmiş ailesi aracılığıyla kolaylaştırır. 3 protein synt önemleri ek olaraknüklerde, Tyr ve Phe'den için yollar fenilpropanoid bileşiklerin anabolizmasında öncül bileşikler olarak hizmet veren önemlerini gibi bitki savunma bileşiklerin sentezi dahil verilen vurgulanmış almaktadır. alkaloidler, lignin, flavonoidler, isoflavonoitlerin, diğerleri arasında hidroksisinnamik asit 4 tyr ve phe yolları da bitki ve bakteriyel anabolik yollar arasındaki farkı göstermek için vurgulanır. Bitkilerde, enzim, Tyr ve Phe'den katabolizması esas olarak dahil olup, bu amino asitler anabolizma dahil değildir ise bakteriler, enzim tirosin aminotransferaz (TyrB), her iki amino asit anabolizma yer almaktadır. (Şekil 2). 4
Gram pozitif ve Gram peptidoglikan (PG) yapısına ilişkin negatif bakteriler arasındaki farklar FPBP ders vurgulanır. Gram negatif bakterilerin PG aslında dayalı bitki patolojisi ile ilgili ilgi çoğu obitki patojenleri Gram negatif bulunmaktadır. ilk 10 bakteriyel bitki patojenleri ile ilgili yeni bir yorum tüm Gram negatif olduğunu ortaya koymuştur. Bakteri cinslerden edildi. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ve Pectobacterium kimyasal farklılıkları 5 bir Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere PG kök karşılaştırırken çapraz bağlama amino arasındaki farktır Her iki tip asitlerdir. PG farklı çapraz-bağlanması için, ilk aşama PG anabolizma sitoplazmik aşamada gerçekleşir ve enzim UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz ile kolaylaştırılır (MURE) (Şekil 3A). MURE çok Gram negatif bakteriler peptit sapının üçüncü konum. 6 da, belirli bir diamin bileşiğinin eklenmesini katalize sondan bir önceki Lys (, mezo -diaminopimelate öncülü
Biyoseparasyonlara in: Principles and Practices (BPP) kursu nedeniyle çevresel değişikliklere bakteri ekimi ve nasıl besin düzeyleri her iki sistemde de önemli ölçüde değişecek açık ve kapalı sistemler arasındaki farklar tartışılır. Bu olaylar bir "aşağı kayması" veya "shift" olarak adlandırılan düzenleyici değişiklikler ile bağlantılı açlık ya da amino asitler ya da enerji yeterli kaynağı tarafından tetiklenen. Bir bakteri kültürü, tek bir karbon kaynağı ile kimyasal olarak tanımlanmış orta zengin ve karmaşık ortamından transfer edildiğinde "vites" yanıtı oluşabilir. ortamda bu değişiklik hızlı Cessa yol açartRNA ve rRNA sentezi yon. amino asit biyosentezi upregüle halde ribozomlar, protein ve DNA sentezinin eksikliği Bu bırakma sonuçları.
"Vites" yanıtın ardından, mevcut ribozomlar orta ya da çevrede artık mevcut amino asitleri sentezlemek için yeni enzimler üretmek için kullanılır. Bir süre sonra, rRNA sentezi ve yeni ribozom monte edilir ve bakteriyel hücre popülasyonu daha az bir oranda olmakla birlikte büyümeye başlar. Olayların ders "sıkı tepki" ya da "sıkı denetim" olarak adlandırılan ve küresel hücresel düzenlemenin bir örneğidir ve gerekli yüzeylerde ve enerji ihtiyacının durumu telafi etmek için hücrenin biyosentetik makine ayarlamak için bir mekanizma olarak düşünülebilir edilir . 8 sıkı tepkisi dolayısıyla çevrede besin akıları hızla yanıt bakteri sağlayan ve katkıda bulunur ve enhbesin ve veya substrat kullanılabilirliği açısından hızla değiştirebilirsiniz ortamlarda rekabet bakterilerin yeteneğini MANOTOP'la. 8-9
Katı yanıtı amino asitler, karbon, azot, fosfat ve yağlı asitlerin mevcudiyeti sınırlıdır gen ekspresyonunda bir rol vardır. 8,10-14 Bu katı tepkisi iki nükleotid guanosin tetrafosfat (ppGpp) ve guanosin tarafından koordine edilir pentafosfat (pppGpp) genellikle alarmone (p) ppGpp olarak birlikte anılacaktır. Örneğin, amino asitler sınırlı olan zaman, guanosin 3-difosfat 5-trifosfatın anabolizma türetilen guanosin 3,5- (bis) pirofosfat (ppGpp), (pppGpp) biriken protein sentezini-alarmone bir darboğaz yol açabilir hücresinde. (P) ppGpp seviyesindeki değişiklik, doğrudan hücre büyümesi ve developmen katılan ortamında alt-tabakaların eksikliğinin üstesinden gelmek üzere yanıt düzenleyen genlerin ifadesi ile ilgilidirt. Bu süreçte yer alan genlerin ikisi rela ve spoT denir. RelA amino asit sınırlama sonucudur yüksüz tRNA'ların birikimine cevap olarak dahil olan bir ribozom ile ilişkili (p) ppGpp sentetaz olup. bir iki fonksiyonlu (p) ppGpp sentetaz ve hidrolaz spot çalışır. Spot sentetaz aktivitesi karbon ve yağ asidi açlık eksikliği yanıt yer almaktadır. RelA / Spot homologları bitkilerde ve bakterilerde yaygın ve R ELA / S Pot h omologs için RSH olarak adlandırılır 8. 8,10 -12,16 yeni bir el yazması bir bakteri Novosphingobium sp Rr 2-17 bu alarmones sentezinde yer alan belirli bir Rsh proteini olduğunu göstermiştir. 17
Burada fonksiyonel tamamlama deneyleri gergin dört biyokimyasal yollar sunuyoruz. Bu yazıda belirtilen tamamlama deneyleri expl bir yol sağlarcevher bilinmeyen / varsayılan işlev (ler) ya da eğitim araçları biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için sahip olduğu tahmin edilir enzimleri belirlenmesi ve ya karakterize bir araç olarak bu in vivo deney istihdam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Yazarlar ilgilenen bireyler için öğretim amaçlı fonksiyonel tamamlama analizi birleşmesini kolaylaştırmak için bakteri suşları ve rekombinant plazmidler sağlamak için hazırız. Fonksiyonel tamamlama deneyleri kolaylaştırmak için kullanılmıştır plasmidler Tablo 1 'de listelenmiştir.
Fonksiyonel tamamlama için Plazmidler 1. İnşaat
- Fonksiyonel olarak tamamlanması diaminopimelat Aminotransferaz (dapL) klonlanması.
- V arasında dapL açık okuma çerçevesi (ORF) büyütmek A. spinosum ve cDNA'ların thaliana ve C PCR ile reinhardtiiye. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol dahil, 1 mM MgSO 4, 0.5 ila 4 mm deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX 1 üniteDNA polimerazı.
NOT: Bitki A. üç dapL ortologlarda rekombinant klonlama ile ilgili tam açıklaması thaliana (-dapL 'de), bakteri Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) ve deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) daha önce yayınlanmıştır. 2,18-20
NOT: aşağıda dapL ortologlar klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
DapL F vs 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
DapL R vs 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
DapL F 'de 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3'
En dapL R-5'-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5' CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - t içine PCR fragmanlarını klonlamakO pET30a yeniden birleştirici plazmidleri üretilmesi için plazmid, pET30a :: Vs dapL, pET30a :: dapL ve primerler, kısıtlama enzimleri ve T4 DNA ligaz kullanılarak pET30a :: Cr dapL 'de.
- Kısaca, ucun 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1. 18-20
- Kısıtlama pET30a :: Cr dapL için Xbal ve SalI ve Xbal ve HindIII enzimleri ile fonksiyonel tamamlama için plazmid oluşturmak için, dapL plazmidler At pET30a :: Vs dapL ve pET30a :: sindiremez. Plazmidleri pBAD33 :: Vs dapL üretmek üzere T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid pBAD33 halinde eklentilerini bağlamak; pBAD33 :: dapL ve pBAD33 :: Cr dapL At.
- geçmenin 50 ng ve 20 ng inkübe1x ligaz tamponu vektörün ve gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı, 1 birim. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1. 20
- V arasında dapL açık okuma çerçevesi (ORF) büyütmek A. spinosum ve cDNA'ların thaliana ve C PCR ile reinhardtiiye. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol dahil, 1 mM MgSO 4, 0.5 ila 4 mm deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX 1 üniteDNA polimerazı.
- A. tirosin aminotransferaz (tyrB) klonlanması fonksiyonel tamamlama için thaliana.
NOT: A. cDNA klonlama ile ilgili tam ayrıntılar At5g36160 daha önce tarif edilmiştir lokus etiketlerinin açıklamalı thaliana. 4- PCR ile cDNA yükseltmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü.
Not: cl için kullanılan primerlerşöyle At5g36160 bölgesinin oning gibidir:
TyrB F 'de 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
AttyrB R 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - EcoR1 ve Sal1 PCR fragmanının sindirilmesi ile yeniden birleştirici plazmidleri pET30a :: At5g36160 üretilmesi için plazmid pET30a içine parçası, klon; Aşağıda tarif edildiği gibi T4 DNA ligazı kullanılarak pET30a içine fragmanı ligate. 4
- Fonksiyonel tamamlama plazmid yaratmak restriksiyon Xbal ve Hindin enzimleri ile pET30a :: At5g36160 sindirmek, T4 DNA ligazı kullanılarak, rekombinant plazmid pBAD33 :: At5g3160 üretmek için aynı kısıtlayıcı enzim sitelerinin kullanılması ile pBAD33 içine ekleme ligate etmek.
- geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB plakaları üzerinde koloniler için coli Dh5α hücreleri ve ekran 34 ug / ml -1 Chlo ile desteklenmiş24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek ramphenicol. 4
- PCR ile cDNA yükseltmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü.
- Klonlanması UDP- K V den -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat Ligaz (MURE) fonksiyonel tamamlama için spinosum.
Not: V. gelen MURE ORF klonlanması spinosum daha önce tarif edilmiştir. 18- PCR ile açık okuma çerçevesi yükseltin. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü. Daha sonra plazmid pET100D :: Vs MURE üretilmesi için plazmid pET100D klonlanması.
NOT: aşağıda Vs MURE klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
MURE f- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT vs -3 '
VsMURE R 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - Fonksiyonel olarak tamamlanması plazmid üretmek pET100D sindirimi için :: Vs MURE
Sınırlama ile Xbal ve Sal1 enzimler ve bunların rekombinant plazmid pBAD33 :: Vs MURE T4 DNA ligazı kullanılarak üretilmesi için pBAD33 içine ekleme ligate.- gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim ile birlikte ekin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si, inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 ug / ml kloramfenikol -1 ile desteklenmiş LB plakaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran. 8
- PCR ile açık okuma çerçevesi yükseltin. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü. Daha sonra plazmid pET100D :: Vs MURE üretilmesi için plazmid pET100D klonlanması.
- Fonksiyonel tamamlama için Novosphingobium sp Relà / s Pot (rsh) klonlanması.
Not:. Novosphingobium sp rsh klonlanması daha önce tarif edilmiş 17.- 599 nükleotid upst ilave olarak rsh ORF yükseltinPCR ile sonlandırma yerinde aşağı başlatma başlangıç site ve 46 nükleotidin delmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve Taq DNA polimerazın 1 ölçü. Daha sonra pCR2.1 :: Nsp rsh üretilmesi için plazmid pCR2.1 klonlamak.
- amplifiye edilen PCR fragmanı 1 ul, pCR2.1 vektörü 1 ul, tuz çözeltisi 1 ul su 1 ul inkübe edin. 5 dakika ve ligasyon 2 ul E. içine 25 ° C de inkübe LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli hücreleri, ve ekran 37 inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1 24 saat ° C.
NOT: aşağıda rsh klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
rsh F 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC 3 '
rsh R 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT 3 ' - Fonksiyonel tamamlama için plazmid pCR2.1 :: Nsp EcoR1 ile rsh sindirmek ve T4 DNA ligaz kullanılarak rsh rekombinant plazmid pRK290 :: Nsp üretmek için geniş konakçı aralığına pRK290 içine insert Arter.
- geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 37 inkübe edilerek 10 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen -1 24 saat ° C. 17
- amplifiye edilen PCR fragmanı 1 ul, pCR2.1 vektörü 1 ul, tuz çözeltisi 1 ul su 1 ul inkübe edin. 5 dakika ve ligasyon 2 ul E. içine 25 ° C de inkübe LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli hücreleri, ve ekran 37 inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1 24 saat ° C.
- 599 nükleotid upst ilave olarak rsh ORF yükseltinPCR ile sonlandırma yerinde aşağı başlatma başlangıç site ve 46 nükleotidin delmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO 4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve Taq DNA polimerazın 1 ölçü. Daha sonra pCR2.1 :: Nsp rsh üretilmesi için plazmid pCR2.1 klonlamak.
Dönüşüm kolaylaştırılması için Elektro-yetkili Bakteriyel Hücre 2. Hazırlık
Not: elektro-kompetan hücrelerin hazırlanması daha küçük bir hacimde (örneğin, 250 mi) aşağı ölçeklendirilebilir kültür 1.0 L için protokol 26 dayanır. Bu protokol b unutmayıne FCA kolaylaştırmak için bu yazıda anlatılan yetkili tüm suşları yapmak için kullanılır. 22
- Bir şişe içine tek bir koloni ile sıvı ortam 50 ml inoküle ve bu adımı (Tablo 2) başlamadan önce mutant genotipini kontrol emin, gece boyunca büyümektedir.
- Günde iki, gece boyunca kültürün 50 ml'si ile uygun bir ortamda (LB, E. coli mutantlarının ve PD Novosphingobium sp) 1.0 L inoküle ve 30 ° 'de (log fazına) 0.4-0.6 bir OD 600 büyüyebilir C.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreler supernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk saf H2O 500 ml pelet
- Santrifüj hücreler, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'de, süpernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk% 10 gliserol, 250 ml pelet.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj hücreleri ° C, süper süzünyüzen, ve% 10 gliserol, 2.0 ml pelet tekrar süspansiyon.
- Bir kuru buz-etanol banyosu içinde tüpler koyarak dondurularak hemen mikro santrifüj tüplerine 50 ul transfer hücreleri eş-payı ve. Elektroporasyon için -80 ° C 'de, yetkili hücreleri saklayın.
Tamamlama plazmid ile bakteriyel hücrelerin 3. elektroporasyonu
- Elektroporasyon için, yetkili hücrelerin bir tümböleni (50 ul) rekombinant plazmidin 1.0 ul (10-50 ng) ekleyin ve 5 dakika buz üzerine yerleştirin.
- Bir elektroporasyon küvetine pipetleme yoluyla karışımı aktarın ve aşağıdaki ayarı elektroporasyon aparatı ayarlayın: 25 jxF kapasitansı, 2.5 kV ve 200 Ohm direnci ve darbe teslim.
- 15 ml konik tüp bir pipet kullanarak kurtarma elektroporasyon küvetine medya (LB) ve transfer 1,0 ml ekleyin. bir çalkalama inkübatöründe 60 dakika boyunca hafif bir döndürme ile yeniden elde.
- reco kültür 100 ul Plateagar plakaları üzerine çok adım pipetleme transformantların ve steril bir dağıtıcısı kullanarak yaymak için seçin.
NOT: Uygun agar plakaları yapmak için antibiyotik ve genotipleri kontrol etmek için bu adımı başlamadan önce Tablo 1 ve Tablo 2 kontrol ettiğinizden emin olun.
AOH1 4. Dönüşüm kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması L, L-diaminopimelat Aminotransferaz (dapL)
- Tamamlama analizi için, boş vektör (pBAD33) ile AOH1 dönüşümü ve bölüm 3.0 özetlenen elektroporasyon protokolü kullanılarak ayrı dönüşüm olaylarda DapL ifade vektörleri ile.
- 50 ug / ml -1 DAP ve 34 ug / ml kloramfenikol -1 ve 50 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş -1 LB agar ortamı üzerinde kaplama ile transformantların seçin.
- LB beni üzerine çizgiler ile çoğaltma kaplama koloniler fonksiyonel tamamlama için test% 0.2 ile 50 ug / ml -1 DAP ve 34 ug / ml kanamisin -1 olmayan (ağırlık / hacim) arabinoz ile dium.
- 24 saat 30 ° C'de inkübe ve sonuçları gözlemleyin.
NOT: Sonuç vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant sadece dapL gen mutant arka planda ifade edilir sadece DAP serbest medyada büyümek mümkün olduğunu göstermek gerekir.
TKL-11 5. Dönüşüm UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6-mezo kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için -diaminopimelate Ligaz (MURE)
- Boş vektör (pBAD33) ve bölüm 3.0 özetlenen protokolü kullanılarak MURE ifade vektörü (pBAD33 :: VsmurE) ile mutant Transform.
- LB agar ortamı üzerinde plaka seçin transformantlar / ml -1 kloramfenikol 50 ug / ml -1 timin ve 34 ug ile takviye edilmiş ve 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
- Kontrol ve iki LB ortamı artı% 0.2 (ağ / hac) arabinoz ve 50 ug / ml -1 timin üzerine deney dönüşümler hem koloniler, çizgi ya da kaplama ile tamamlanması için test.
- görsel olarak büyüme fenotipi değerlendirmek için tek bir 30 ° C 'de plaka ve 24 saat boyunca 42 ° C'de, diğer inkübe edin.
NOT: Bu sonuçlar, mutant MURE gen vektörü sadece kontrole kıyasla mutant arka ifade yalnızca 42 ° C'de büyüyebilir göstermelidir.
DL39 6. Dönüşüm tirosin aminotransferaz kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için (tyrB)
- LB agar plakaları üzerinde pBAD33 ya pBAD33 :: At5g36160 ile ya DL39 Transform ve Seçenek transformantlar bölümünde belirtilen 50 ug / ml -1 tirosin, 50 ug / ml -1 fenilalanin ve protokol kullanılarak 34 ug / ml kloramfenikol ile takviye -1 3.0.
- kopya50 ug / ml -1 fenilalanin ve 50 | ig / ml -1 tirosin, 50 ug / ml -1, aspartat, 50 ug / ml -1 leusin, 50 ug / ml -1 valin ile minimum (M9) ortama -plate koloni / ml -1 izolösin 50 ug, 10 ug / ml -1 urasil% 0.5 gliserol (ağ / hac),% 0.2 (ağırlık / hacim) arabinoz. Her iki plakaların aynı koloni çizgiler ile fenilalanin ve tirozin eksik plakalar üzerinde de çoğaltma plaka koloniler.
- büyüme fenotipi gözlemlemek için 48 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
Not: Sonuç vektörü, yalnızca kontrol ile karşılaştırıldığında, mutant yalnızca mutant arka tyrB geninin ifade yalnızca, fenilalanin ve tirosin serbest bir ortam üzerinde yetişebilir mümkün olduğunu göstermesi gerekir.
Hx699 7. Dönüşüm Hypomucoid Fenotip Novosphingobium ve sp fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için. Gerilme Hx699
NOT: Sonuç rsh vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant arka planda ifade edildiğinde hipo-sümüksü fenotip tamamlanmaktadır olduğunu göstermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli fonksiyonel tamamlama analizlerde kullanılan bakteriyel suşlar, Tablo 2'de sıralanmıştır.
Fonksiyonel tamamlama analizi: L, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL)
E. E. coli çift mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) Dape geninde bir mutasyon ve DAPD geninin tam silme (Şekil 1) barındırır. Bu nedenle, mutan DAP sağlanmadıkça büyümeye yapamaz. Bu mutasyonlar nedeniyle, AOH1 oksotrofik kabul edilir. AOH1 L fonksiyonel tamamlama analizi için uygun olan, DapL L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) ortologlar, THDP PG ve lys sentezini kolaylaştırmak için, doğrudan L-diaminopimelat (Şekil L sentezini katalize 1).
AOH1 mutantı ifade DapLs L büyümek için mümkün olduğu göstermelidir DAP / lys yolunda dapd ve Dape enzimatik adımları engellemeyi L-DAP (Şekil 5).
Fonksiyonel tamamlama analizi: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE)
mezo -diaminopimelate (m -DAP), Gram-negatif bakterilerin PG çapraz bağlama bir amino asittir. Enzim -acetylmuramoylalanyl- D-glutamil-2,6-mezo -diaminopimelate ligaz UDP- N (MURE) Bu proseste m -DAP eklenmesini (- B Şekil 3A) kolaylaştırır. E. E. coli mutant TKL-11 mu limanlar42 ° C'de büyümeye mutantın özelliği ile sonuçlanır MURE genindeki lama Mutasyona uğramış enzim bu sıcaklıkta düzgün katlamak mümkün olmadığı gerçeği nedeniyle ° C.
Sonuçlar kontrol ve deney hem de 30 ° C permisif sıcaklığında artış olduğunu gösterecektir. Ancak, MURE (deneme) ifade sadece hücreleri 42 permisif olmayan sıcaklığında büyümesi mümkün olacak ° C (Şekil 6).
Fonksiyonel tamamlama analizi: tirosin aminotransferaz (tyrB)
Arabidopsis thaliana At5g36160 (Şekil 2) tarafından açıklanmış tirosin ve 4-hidroksifenilpiruvat ve fenilalanin ve fenilpürivat le birbirlerine mümkün olan bir tirosin aminotransferaz kodlar. 4 E. colI (DL39) fenilalanin ve tirozin için oksotropik hale tyrB geninde bir mutasyon barındırır mutant. 24-26 Mutant, hem de amino asit tirozin, fenilalanin, aspartat, lösin, izolösin ve valin için oksotropik olduğu unutulmamalıdır diğer mutasyonlar nedeniyle. Suşu E. TyrB enzim ortologunun beri tyrB ortologlarda işlevini değerlendirmek için uygundur E. coli protein sentezini kolaylaştırmak için tirosin ve fenilalanin sentezi doğrudan katılır.
Sonuç DL39 Değişen M9 ilgili tirosin ve fenilalanin sağlandığı takdirde büyümesini mümkün iken göstermelidir. Bununla birlikte, A thaliana (At5g36160) ifade suşu (F enzimi fenilpiruvat t 4-hidroksifenilpiruvat ve fenilalaninden tirosin sentezlemiştir olduğunu gösteren tirosin ve fenilalanin yoksun M9 ortam üzerinde büyümeye edebilmektedirŞEKIL 7). 4
Fonksiyonel tamamlama analizi: Rsh (RelA ve S Pot homolog)
Novosphingobium sp Rsh proteini. (Rr2-17) N-terminal fosfohidrolaz ve (p) ppGpp sentaz etki hem de içerir ve bu nedenle E. nokta gibi önerilen çift fonksiyonlu bir role sahiptir E. coli. Bu E. tamamlama analizi kullanılarak teyit edilmiştir Novosphingobium sp rsh geni kullanılarak rela ve spot mutasyonu barındıran E. coli çift mutant, CF1693. Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R) adlı Rr2-17 rsh mutant fenotip, hipo-sümüksü sonuçları ve bu işlevsel olmayan rsh kaynaklanmaktadır. Hx699 hipo-sümüksü fenotip ile değerlendirildi klonlanmıştır nativ rsh Nsp geni tarafından kolaylaştırılmış tamamlamageniş konak aralığı vektör pRK290 içine. Hipo-mukoid fenotipi ile uyumlu olarak, boş vektör pRK290 barındıran Hx699 pRK290 ya pRK290 :: rsh NSP ihtiva eden daha az çözünür, trans-komplented Hx699 tarafından üretilen polisakarit (pRK290 :: rsh Nsp) ve Rr2-17 gösterir (Şekil 8) .
Şekil 1:. Aramadde diaminopimelat (DAP) ile devam aspartattan lisin anabolik yollarda varyantları yolları (A) asil yolları, (B), diaminopimelat dehidrojenaz (GKD) yolunun ve (C) L ile açıklamalı L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) yolunun. aşağıdaki gibi enzimler için kısaltma tanımları vardır: aspartat kinaz (lysC), aspartatdehidrogenaz (ASD), tetrahydrodipicolinate sintaz (dapA) tetrahydrodipicolinate redüktaz (DapB) tetrahydrodipicolinate asilaz (DAPD), N -asil-2-amino-6-ketopimelate aminotransferaz (DAPC), N -asil-L L-2, 6-diaminopimelat Deaçılaz (Dape) diaminopimelat epimeraz (DapF), mezo -diaminopimelate dehidrojenaz (GKD), mezo -diaminopimelate dekarboksilaz (Lysá), L, L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl- D-glutamat. mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) ve lisil-tRNA sentetaz (LysU) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: amino asitler tyro için Anabolik yollarsinüs ve fenilalanin. (A) ara korismat ve (B) ara arogenate yoluyla bitki yolu ile bakteriyel (E. coli) yolu. , Korismat mutaz / Prefenat dehidrataz (PHEA) korismat mutaz, Prefenat dehidrojenaz (Tyra'ya) ve tirosin aminotransferaz (TyrB) enzimler için kısaltmalar aşağıdaki gibidir. Diyagram kabul ve form Prabhu'yu ve Hudson, 2010. 4 güncellenmiştir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: peptidoglikan sentezinin sitoplazmik aşama (A) 'peptidoglikan sentezinin sitoplazmik aşamasının şematik temsili.. kısaltmalar aşağıdaki gibi enzimlerin gibidir: UDP- K -acetylglucosamine enolpiruvil transferaz (Mura) UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (mürb) UDP- N -acetylmuramate-L-alanin ligaz (murç) UDP- N-asetil-muramoylalanine-D -glutamat ligaz (MuRD) UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat 2,6-mezo -diaminopimelate ligaz Murf (MURE) UDP- N -acetylmuramoyl-tripeptit-D-alanil-D-alanin ligaz ( ), D-alanin-D-alanin ligaz (DDL). (B) disakarid N -acetylglucosamine (GIcNAc) gösteren peptidoglikan monomerik birimin şematik gösterimi ve N -acetylmuramic (MurNAc), bir β-1,4 glikosidik bağ ile bağlanmış. Kök peptidin 3 konumundaki amino asidi çoğu Gram-pozitif bakteriler çoğu Gram-negatif bakteri ve Lys mezo -diaminopimelate (m -DAP) ile ifade çapraz bağlama bölgesindeki katılır."_blank> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Besin fakir bir ortamda bakteri sıkı tepki şematik model temsili Pozlama Rsh (RelA veya Spot) GTP (guanozin trifosfat) bir fosfat grubu ekleyerek alarmone (p) ppGpp (guanozin pentafosfat) anabolize için neden olur. bir besleyici açısından zengin bir ortamda maruz büyüme inhibitörüdür (p) ppGpp hidrolize etmek RSH ekspresyonunu indükler. Diyagram kabul ve Raskin ve ark. Modifiye edilmiş, 2007. 27 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. AOH1 E. DapL kullanarak Fonksiyonel tamamlama Fonksiyonel tamamlama V. bakteri L L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) geni ile E. coli mutantı spinozum (Vs dapL), bitki A. thaliana (dapL At) ve alg, C. reinhardtiiye (Cr dapL). Plazmidler, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: dapL 'de ve pBAD33 :: Cr dapL barındıran mutant% 0.2 ile desteklenmiş LB agar plakaları üzerinde çoğaltma ekildi ya da 50 ug / ml olmayan arabinoz (w / v) L, L - diaminopimelat ve 30 ° C'de büyütülmüştür 24 saat ° C. Diyagram kabul ve gelen Nachar ve ark. Güncellenmiştir, 2012. 18 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6:. TKL-11 E. MURE kullanarak Fonksiyonel tamamlama Fonksiyonel tamamlama V. adlı UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geni ile E. coli mutantı spinosum. plazmidler BAD33 ve pBAD33 :: VsmurE barındıran mutant% 0.85 ile 10, -2 ve 10 -3 OD 0.1 ila 600 LB ortamında büyütüldü ve seri olarak, 10 -1 seyreltilmiştir tuz (ağırlık / hacim) . 5 çeşitli seyreltilerde ul% 0.2 (ağırlık / hacim) arabinoz ile takviye edilmiş LB ortamı üzerinde çoğaltma ile kaplandı ve 30 ° C ve 42 ° değerlendirildi konfluent olarak büyütülmüştür ° C 24 saat. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: DL39 E. Fonksiyonel tamamlama A. odağı etiketi At5g36160 tarafından açıklamalı bir tirozin aminotransferaz geni ile E. coli thaliana. plazmidler pBAD33 ya pBAD33 :: At5g36160 barındıran mutant 50 ug / ml -1 tirosin, 50 ug / ml -1 fenilalanin ile desteklenmiş LB agar levhaları üzerinde seçilmiştir ve 34 ug / ml kloramfenikol -1 edildi. Suşu tuz (ağırlık / hacim)% 0.85 ile 10, -2 ve 10 -3 OD OD 1.0 600 LB etsuyu içinde büyütülmüştür ve seri olarak, 10 -1 seyreltilmiştir. Çeşitli seyreltilerde 5 ul daha sonra 50 ug / ml -1 fenil ile desteklenmiş M9 agar plakaları üzerine suretli plakalanmıştıralanin ve 50 ug / ml -1 tirosin,% 0.5 (ağ / h) gliserol,% 0.2 (ağ / hac) arabinoz, 50 ug / ml -1, aspartat, 50 ug / ml -1 leusin, 50 ug / ml -1 valin, 50 ug / ml -1 izolösin, 10 ug, ve fenilalanin ve tirosin yoksun ve 48 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edildi tabakalarına / ml -1 urasil. Diyagram kabul ve form Prabhu'yu ve Hudson, 2010. 4 güncellenmiştir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: Novosphingobium sp hypomucoid fenotip fonksiyonel tamamlama. mutant suş Hx699. TO, vahşi tip suşu Novosphingobium sp. (Rr2-17) ve mutant suşu Hx699 pRK290 ya pRK290 :: rsh NSP ile dönüştürülmüştür. suşlar, bir "X" çizgili ve daha 30 ° C'de Pd ağarı üzerinde büyütülmüştür fenotipleri gözlemlemek için en az 4 gün. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| tamamlama plazmidler | Antibiyotik direnci belirteçleri | alıntı |
| pBAD33 | cm r | 21 |
| pBAD33 :: dapL 'de | cm r | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | cm r | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | Santimetrer | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | cm r | 4 |
| pBAD33 :: Vs MURE | cm r | 18 |
| pRK290 | tet r | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | tet r | 17 |
Tablo 1:. Bu çalışmada fonksiyonel tamamlama analizi için kullanılan plazmid Listesi kullanılan Fonksiyonel tamamlama plazmid. Cm R ve Tet R sırasıyla kloramfenikol ve tetrasiklin direnci belirtir.
| Gerilme adı | organizma | Genotip | Fenotip | Kaynak |
| AOH1 | E.coli | Δ dapd :: Kan2, dapE6 | diaminopimelat için oksotropik | Hudson Laboratuvarı |
| TKL-11 * | E.coli | Thr-1, leuB6 (AM), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, tsx-95, glnV44 (AS), λ - pyrF101, His-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-1, deoC1 | Büyüme duyarlı fenotipi mutant 42 ° C, 30 ° C 'de büyümektedir değil idi | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E.coli | LAM-, aspC13, FNR-25, Rph-1 ilvE12, tyrB507 | amino asitler için oksotropik; tirosin, fenilalanin, lösin, izolösin ve valin | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Vahşi tip) - | Hyper-sümüksü | Savka Laboratuar | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-sümüksü | Savka Laboratuar |
Tablo 2:. Bu çalışmada kullanılan ilgili genotipler ve fenotip ile birlikte bakteri suşlarının, bu çalışmada kullanılan bakteri suşlarının listesi. Yıldız işareti ile gösterilen suşlar (TKL-11 ve DL39) Coli Genetik Stok Merkezinden (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) doğrudan elde edilebilir unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Biyoteknoloji ve Moleküler Bioscience müfredat ayrılmaz bir parçası olan derslerin çoğu dersin ders kısmına ek olarak laboratuvar bileşeni var. akademik yıl 2014-2015 için müfredat yaklaşık% 60'ını temsil eden bir laboratuvar bileşeni içeren 29 olan 48 ders, toplam içerir. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP), bir laboratuvar bazlı ders: Böyle bir ders Bitki Biyokimya ve Patoloji (FPBP), bir harmanlanmış ders / laboratuvar ders ve Biyoseparasyonlara temelleri olduğunu.
Her dersin laboratuvar bileşeni ders materyalleri güçlendirmek için tasarlanmıştır. Örneğin, biyokimyasal yollar ve metabolizma ağır FPBP ve BPP içinde vurguladı. konulardan bazıları amino asit metabolizması, peptidoglikan biyosentezini, bitki sekonder metabolizma, diğerleri arasında çevresel nişler, bakteriyel tepki içerir. Yazarlar, fonksiyonel complem entegreHer iki derslerde laboratuvar çalışmaları olarak entation ders ve veya ön laboratuvar sunumları tartışılmıştır metabolik yolların anlaşılmasını güçlendirmek için. Lys, PG, tyr, phe ve bakteri katı tepkisinin biyokimyasal yollar yer alan genlerin fonksiyonunu analiz etmek için fonksiyonel tamamlama denemesi kullanarak dört örnek ele alınmaktadır.
Yazarlar ders içine bu deneysel modül entegre etmiş çeşitli nedenleri vardır. Birincisi, fonksiyonel tamamlama maruz kalma analizleri güçlendirmek veya genetik, evrim, genomik, biyoinformatik ve biyokimya ile ilgili konuları tanıtmak için mükemmel bir araçtır. İkinci olarak, deney basit ve ders laboratuvar ortamında gerçekleştirilebilir. kullanılan tüm reaktiflerin güvenli ve kullanılan bakteri biyo-güvenlik seviyesi 1 olarak belirtilen ve patojenik değildir. Bu nedenle, yazarlar bu plazmidler ve ba gibi belirteçler yapmaya hazırızöğretim deneyiminin bir parçası olarak fonksiyonel tamamlanmasını içeren de ilgilenen herkes için kullanılabilir cterial suşlar. Bakteri türleri (TKL-11 ve DL39) iki coli Genetic Stock Center (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/) şirketinden elde edilmiş olduğu not edilmelidir.
Fonksiyonel tamamlama protokolü birkaç kritik adımlar olduğuna dikkat etmek önemlidir. İlk adım mutant (lar) herhangi bir deney başlamadan önce kültüre edilmesi mümkün olduğundan emin olmaktır. Nedeni, Tablo 2'deki gibi, her bir mutant ile ilişkili çeşitli genotipler olmasıdır. deneyden önce yetkili hücreleri hazırlamak için mutant büyümek için, ya da PG MURE mutant ilişkin gerekli kimyasallar ve veya sıcaklık gereksinimleri olmadan mutant büyüyen deneyin. mutant herhangi deneyler önce otantik olduğunu ispat edecektir, çünkü bu aynı zamanda bir öğretim andır.
Obu genlerin işlev (ler) test etmek için mükemmel bir araç da, her zaman nedeniyle ilgi gen (ler) doğru olmaması nedeniyle çevrilemez bu kodon kullanımı gibi çeşitli faktörlere çalışmaz unutulmamalıdır mutant organizmada uygun tRNA. Bununla birlikte, bu, normal olarak, mutant (lar) kodon kullanımını eşleşecek şekilde nükleotidleri değiştirerek ilgi konusu geni sentezlenmesi yapılır klonlama aşaması esnasında açık okuma çerçevesinin ve cDNA kodon optimizasyonu ile atlatılabilir. Bir diğer konu, bazı ökaryotik proteinler işlevi için post-translasyonel modifikasyonlar ihtiyaç olmasıdır. Post-translasyonel modifikasyonlar bakteri özelliği değildir ve böyle biri gibi bakteriyel mutantlar kullanarak genlerin işlev (ler) test etmek için bu tekniği kullanmak mümkün olmayabilir.
Biz derslerde vurgulamak tekniğin önemi FCA in vivo gen işlevine test etmek için mükemmel bir yoldur olmasıdır. Karakterizasyonu enzimler çoğunlukla enzim saflaştırılmış ve geleneksel enzimatik deneyler gerçekleştirilir, gerek in vitro çalışmalara dayanmaktadır. 29, geleneksel enzimatik ölçümlerde, veya enzimatik aktivitesi tespit etmek için büyük bir olabilir, genellikle "kuvvet beslemesi" olmayan ticari olarak temin edilebilen alt-tabakalar ile, enzim enzim saf ya da doğal. 30 FCA fizyolojik koşullar altında normal olarak bir in vitro appose fizyolojik koşullar altında operasyon göz önüne alındığında genlerin işlevini ilgili daha gerçekçi bir kanıt temin etmektedir bir in vivo sistemi. 2 göz önüne alındığında, birçok genin fonksiyonları ve aslında ilgili bilgi eksikliği en açıklamalar tahmini, 31 göre olması belirsiz kalır veya şu anda kabul olanlar çeşitli in farazi fonksiyonları için çok sayıda genin fonksiyonları aydınlatmak için deneyler kolaylaştıracak bu teknik hakim kamu veritabanları.
jove_content "> genellikle yetkin hücre preparasyonunda olduğu deneyimli tekniği ile ilgili sorunlardan biri. Bir hücreler sağlamaya ek olarak transforme edilecek kadar hücreler olduğundan emin olmak için doğru bir şekilde hazırlanır emin olmalıdır elektroporasyon işlemi sırasında gerilmeye önlemek için su ve gliserol ile düzgün yıkanır. bir de hücrelerin ilk büyümesini kolaylaştırmak için uygun kimyasal veya uygun sıcaklıkta yetiştirilen emin yaparak mutant fenotip farkında olmalıdır fonksiyonel tamamlama analizi için mutant ve.Bu teknik, hakim sonra, araştırmacılar sürece bu analizi kolaylaştırmak için uygun bir organizmadan uygun bir mutasyon olduğu genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için fonksiyonel tamamlama analizi kullanılabilir. Bu yazıda protokol bakterilerin kullanımını tarif unutmayın. Bu Ancak, diğer organizmalarbitki ve memeli hücreleri, diğerleri arasında, genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. 32-33 Birtanesi deney kolaylaştırmak için hücrelerin dönüştürülmesi ve ya transfeksiyon optimize uygun vektörler ek olarak kullanıldığından emin olmak gerekir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
AOH ve MAS Bilim Koleji ve destek için Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Yaşam Bilimleri Thomas H. Gosnell Okulu kabul eder. Bu çalışma Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilim Vakfı (NSF) AOH MCB-1120541 için ödül tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S.
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y.
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
