Summary
Valideringen av enzymatiske aktiviteter som er involvert i biokjemiske mekanismer kan belyses ved hjelp av funksjonell komplemente analyse (FCA). Er beskrevet i dette manuskriptet er den FCA-analysen viser den enzymatiske aktiviteten av enzymer involvert i metabolismen av aminosyrer, bakteriell strenge reaksjon og bakteriell peptidoglykan biosyntese.
Abstract
Funksjonell komplementering assay (FCA) er en in vivo-assay som er mye brukt for å belyse funksjonen / rollen til gener / enzymer. Denne teknikken er svært vanlig i biokjemi, genetikk og mange andre disipliner. En omfattende oversikt over teknikken for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer knyttet til aminosyrer, peptidoglykan og bakteriell strengere reaksjon er rapportert i dette manuskriptet. To cDNA fra modell anlegg organisme Arabidopsis thaliana som er involvert i metabolismen av lysin (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) og tyrosin aminotransferase (tyrB) som er involvert i metabolismen av tyrosin og fenylalanin er uthevet. I tillegg bakteriell peptidoglykan anabole veien er spesielt markert ved analyse av UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) genet fra bakterien Verrucomicrobium spinosum involvert i tver-linking av peptidoglykan. Bakterie strengere reaksjon er også rapportert gjennom analyse av rsh (r ELA / s POT h omolog) bifunksjonell genet er ansvarlig for en hyper-slimaktig fenotype i bakterien Novosphingobium sp. Fire eksempler på FCA presenteres. Videoen vil fokusere på tre av dem, nemlig lysin, peptidoglykan og strengere reaksjon.
Introduction
Funksjonell komplementering i sammenheng med å belyse funksjonen (e) / rolle (r) av et gen som er definert som evnen til en spesiell homologt eller ortologe gen for å gjenopprette en bestemt mutant med en fenotypen til villtype-tilstand når det homologe eller ortologe genet blir innført i cis eller trans til det mutante bakgrunnen. Denne teknikken har blitt mye brukt til å isolere og identifisere funksjonen (e) / rolle (r) av mange gener. Et spesielt eksempel er isolering og identifisering av orotidine-5-fosfat dekarboksylase fra Candida albicans ved hjelp av ura3-mutant av S. cerevisiae og pyrF mutant av E. coli. 1 Forfatterne har brukt denne teknikken for å belyse funksjon av gener som er involvert i metabolismen av aminosyrer, peptidoglykan og strengere reaksjon i sine forskningsprogrammer og har innarbeidet denne teknikken i sine undervisningsopplegg i Biotechnology og molekylær biovitenskap (BMB) program ved Rochester Institute of Technology (RIT).
Forfatterne lære grunnleggende av Plant biokjemi / patologi (FPBP) (Hudson) og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP) (Hudson / Savka), to øverste divisjon valgfag laboratoriebaserte kurs i BMB-programmet ved RIT. Siden noen av temaene som er omtalt i kursene er tilknyttet deres forskningsinteresser, har forfatterne tatt mange av de teknikker og eksperimentelle verktøy som brukes i sine respektive forskningsprogrammer i disse to laboratoriebaserte kurs. Et slikt eksempel er funksjonell komplementering som et laboratorium oppgave å forsterke kompen materialene knyttet til amino acid metabolism fra planter, peptidoglykan og den strenge responsen metabolismen fra bakterier.
Tre av aminosyre trasé fra planter som er omtalt i FPBB kurset er at av lysin (lys), tyrosin(Tyr) og fenylalanin (Phe). Den lys veien er markert i løpet på grunn av viktigheten av aminosyren som en essensiell aminosyre for alle dyr spesielt mennesker siden dyr mangler den genetiske maskineri for å syntetisere lys de novo. I tillegg ble det nylig oppdaget at planter anvender en vei for syntesen av lys som er vesentlig forskjellig fra det av bakterier. Dette funnet ble delvis tilrettelagt av funksjonell komplementering av E. coli diaminopimelate (DAP) mutanter ved hjelp av et gen som koder for enzymet L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) fra modellen planten Arabidopsis thaliana. 2 varianten veier for syntese av lys gjennom det mellomliggende diaminopimelate er vist i figur 1. I tillegg , syntesen av lys letter gjennom aspartat avledet familie av aminosyrer som er sterkt regulert. 3. i tillegg til deres viktighet i protein synthesis, trasé for Tyr og Phe er uthevet gitt deres betydning i å tjene som forløperforbindelser for anabolisme av styrene forbindelser involvert syntesen av planteforsvars forbindelser som:. alkaloider, lignins, flavonoider, isoflavonoids, hydroxycinnamic syre blant annet fire Tyr og Phe trasé er også uthevet for å vise forskjellen mellom anlegget og bakterie anabole veier. I bakterier, blir enzymet tyrosin aminotransferase (TyrB) som er involvert i den anabolisme av begge aminosyrer, mens det i planter, er enzymet primært involvert i nedbrytningen av Tyr og Phe, og er ikke involvert i den anabolisme av disse aminosyrer. (Figur 2). 4
Forskjellene mellom Gram positive og Gram negative bakterier om strukturen av peptidoglykan (PG) er uthevet i FPBP kurset. PG av Gram-negative bakterier er av interesse angående plantepatologi basert på det faktum at de flesteplantepatogener er Gram negative. En fersk vurdering av de 10 bakterie phyto-patogener avdekket at alle er Gram negative. Bakteriene var fra slektene:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya og Pectobacterium 5 En av de kjemiske forskjeller ved sammenligning av PG-stammen av Gram-negative og Gram-positive bakterier er differansen mellom tverrbindings amino- syrene med begge typer. Det første trinnet for den annen tverrbinding av PG forekommer i det cytoplasmatiske trinnet med PG anabolisme og lettes ved de enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) (Figur 3A). Mure katalyserer tilsetningen av en bestemt diaminforbindelse i tredje posisjon av peptidet stammen. 6 I de fleste Gram-negative bakterier, nest siste lys forløper, meso -diaminopimelate (
I Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Selvfølgelig er forskjellene mellom åpne og lukkede systemer for dyrking av bakterier og hvordan nærings nivåer vil endre seg betydelig i begge systemer på grunn av miljøendringer diskutert. Disse hendelsene er knyttet til regulatoriske endringer som kalles en "gire ned" eller "gire opp" utløst av sult eller en tilstrekkelig tilførsel av aminosyrer eller energi. Den "gire ned" respons kan oppstå når en bakteriekultur overføres fra en rik og kompleks medium til et kjemisk definert medium med en enkelt karbonkilde. Denne endringen i miljøet fører til rask cessasjon av tRNA og rRNA syntese. Dette opphøret resulterer i mangel på ribosomer, protein og DNA-syntese, selv om biosyntesen av aminosyrer blir oppregulert.
Etter "gire ned" respons, er de eksisterende ribosomene som brukes til å fremstille nye enzymer for å syntetisere aminosyrene som ikke lenger er tilgjengelig i medium eller miljø. Etter en periode av tid, blir rRNA-syntesen og nye ribosomer montert og den populasjon av bakterieceller begynner å vokse selv om ved en redusert hastighet. Hendelsesforløpet er kalt "strenge reaksjon" eller "streng kontroll" og er et eksempel på global mobil forskriften, og kan betraktes som en mekanisme for å justere cellens biosyntetiske maskineri for å kompensere for tilgjengeligheten av de nødvendige underlag og energibehov . 8 strengere reaksjon gjør dermed bakterier å reagere raskt på fluks av næringsstoffer i miljøet og bidrar og ENHAnser evnen av bakterier for å konkurrere i miljøer som kan endre seg raskt med hensyn til næringsstoffer og eller substrat tilgjengelighet. 8-9
Den strenge responsen har en vesentlig rolle i genekspresjon når tilgjengeligheten av aminosyrer, karbon, nitrogen, fosfat og fettsyrer er begrenset. 8,10-14 Denne streng reaksjon er koordinert av to nukleotider, guanosin tetrafosfat (ppGpp) og guanosin pentaphosphate (pppGpp) ofte referert sammen som alarmone (p) ppGpp. Når for eksempel aminosyrer er begrenset, noe som kan føre til en flaskehals i proteinsyntese-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrofosfat (ppGpp), avledet fra anabolisme av guanosin 3-difosfat 5-trifosfat (pppGpp) akkumulerer i cellen. Endringen i (p) ppGpp nivå er involvert i ekspresjon av gener som regulerer responsen for å overvinne mangelen på substrater i miljøet som er direkte involvert i cellevekst og utvikling;t. To av gener som er involvert i denne prosessen kalles RELA og Spot. Rela er en ribosom-assosiert (p) ppGpp syntetase som er involvert i responsen til opphopning av uladede tRNA som er et resultat av aminosyren begrensning. Spot fungerer som en bifunksjonell (p) ppGpp syntetase og hydrolase. Den syntetase aktivitet av Spot er involvert i respons på mangel av karbon og fettsyre sult. 8 De RELA / sted homologer er utbredt i planter og bakterier og er referert til som Rsh for R ELA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 en fersk manuskript viste at det er en spesifikk Rsh protein som er involvert i syntesen av disse alarmones fra bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Her presenterer vi fire biokjemiske mekanismer tjoret til de funksjonelle komplemente analyser. Komplemente analyser som er skissert i dette manuskriptet gir en vei å eksplmalm under anvendelse av denne in vivo-analyse som et middel for å identifisere og karakterisere eller enzymer som er forutsagt å ha ukjent / antatte funksjon (er) eller som læreverktøy for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Forfatterne er villige til å gi bakteriestammer og rekombinante plasmider å lette inkorporering av funksjonell komplemente analyse for undervisningsformål for personer som er interessert. De plasmider som ble brukt for å lette funksjonelle komplemente eksperimenter er oppført i Tabell 1.
1. Bygging av plasmider for Funksjonell Komplemente
- Kloning av Diaminopimelate aminotransferase (dapL) for Funksjonell Komplemente.
- Forsterke dapL åpen leseramme (ORF) fra V. spinosum og cDNA fra A. thaliana og C. reinhardtii ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver av de 4 deoksynukleotidtrifosfatene, og 0,5 ng av templat-DNA og 1 enhet av pfxDNA-polymerase.
MERK: fullstendig beskrivelse knyttet til rekombinant kloning av tre dapL ortologer fra anlegget A. thaliana (At -dapL), bakterien Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) og algen Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) har tidligere blitt publisert. 2,18-20
MERK: Primerne anvendt for kloning av dapL ortologer er som følger:
Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
Vs dapL R 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
Ved dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
Ved dapL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
Cr dapL F-5'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 ' - Klone PCR-fragmenter inn i than plasmid pET30A for å produsere de rekombinante plasmider, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Ved dapL og pET30A :: Cr dapL ved hjelp av primere, restriksjonsenzymer og T4 DNA-ligase.
- Kort beskrevet inkuberes 50 ng av innsatsen og 20 ng av vektoren i 1x ligase-buffer og 1 enhet T4 DNA-ligase over natten ved 17 ° C. Transform ligation til E. coli-DH5a-celler og skjerm for kolonier på LB-plater supplert med 50 ug / ml kanamycin -1 ved inkubering ved 37 ° C i 24 timer. 18-20
- For å opprette plasmid for funksjonell komplemente, fordøye pET30A :: Vs dapL og pET30A :: På dapL plasmider med restriksjonsenzymene Xbal og Sali og Xbal og HindIII for pET30A :: Cr dapL. Ligere innsatsene i plasmidet pBAD33 ved hjelp av T4 DNA ligase for å produsere plasmidene pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: På dapL og pBAD33 :: Cr dapL.
- Inkuber 50 ng av innsatsen og 20 ngav vektoren i 1x ligase-buffer og 1 enhet T4 DNA-ligase over natten ved 17 ° C. Transform ligation til E. coli-DH5a-celler og skjerm for kolonier på LB-skåler supplementert med 34 pg / ml kanamycin -1 ved inkubering av 37 ° C i 24 timer. 20
- Forsterke dapL åpen leseramme (ORF) fra V. spinosum og cDNA fra A. thaliana og C. reinhardtii ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM hver av de 4 deoksynukleotidtrifosfatene, og 0,5 ng av templat-DNA og 1 enhet av pfxDNA-polymerase.
- Kloning av Tyrosin aminotransferase (tyrB) fra A. thaliana for Funksjonell Komplemente.
MERK: fullstendige opplysninger om kloning av cDNA fra A. thaliana anmerket av locus tags At5g36160 har blitt beskrevet tidligere. 4- Forsterke cDNA ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, og 0,5 ng av templat-DNA og 1 enhet av pfx DNA-polymerase.
MERK: Primere som brukes til cloning av At5g36160 er som følger:
Ved tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 ' - Klone fragmentet i plasmidet pET30A for å produsere de rekombinante plasmider pET30A :: At5g36160 ved spaltning av PCR-fragmentet med EcoR1 og Sal1; ligere i fragmentet i pET30A ved anvendelse av T4 DNA-ligase som beskrevet nedenfor. 4
- For å opprette den funksjonelle komplemente plasmidet, fordøye pET30A :: At5g36160 med restriksjonsenzymene Xbal og Hindlll, og ligate innsatsen i pBAD33 anvendelse av de samme restriksjonsenzymseter for å produsere det rekombinante plasmidet pBAD33 :: At5g3160 ved anvendelse av T4 DNA-ligase.
- Inkuber 50 ng av innsatsen og 20 ng av vektoren i 1x ligase-buffer og 1 enhet T4 DNA-ligase over natten ved 17 ° C. Transform ligation inn i E. coli-DH5a-celler og skjerm for kolonier på LB-skåler supplementert med 34 pg / ml -1 Chloramphenicol ved inkubering av 37 ° C i 24 timer. 4
- Forsterke cDNA ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, og 0,5 ng av templat-DNA og 1 enhet av pfx DNA-polymerase.
- Kloning av UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate Ligase (Mure) fra V. spinosum for Funksjonell Komplemente.
MERK: kloning av Mure ORF fra V. spinosum har blitt beskrevet tidligere. 18- Forsterke den åpne leseramme ved hjelp av PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, 0,5 ng templat-DNA og 1 enhet av pfx DNA-polymerase. Deretter klone i plasmidet pET100D for å fremstille plasmidet pET100D :: Vs Mure.
MERK: Primerne anvendt for kloning av Vs Mure er som følger:
Vs Mure F- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
vsMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 ' - For å produsere plasmid for funksjonell komplemente, fordøye pET100D :: Vs Mure
Med restriksjonsenzymene Xbal og Sal1 og ligere innsatsen i pBAD33 for å produsere det rekombinante plasmidet pBAD33 :: Vs Mure ved anvendelse av T4 DNA-ligase.- Inkuber 50 ng av innsatsen og 20 ng av vektoren i 1x ligasebuffer, sammen med en enhet T4 DNA-ligase over natten ved 17 ° C. Transform ligation til E. coli-DH5a-celler og skjerm for kolonier på LB-skåler supplementert med 34 pg / ml kloramfenikol -1 ved inkubering av 37 ° C i 24 timer. 8
- Forsterke den åpne leseramme ved hjelp av PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, 0,5 ng templat-DNA og 1 enhet av pfx DNA-polymerase. Deretter klone i plasmidet pET100D for å fremstille plasmidet pET100D :: Vs Mure.
- Kloning av Rela / s POT (rsh) fra Novosphingobium sp for Funksjonell Komplemente.
. MERK: kloning av rsh fra Novosphingobium sp har blitt beskrevet tidligere 17.- Forsterke rsh ORF i tillegg til 599 nukleotider upstris med initiering start området og 46 nukleotider nedstrøms ved oppsigelse nettstedet ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, 0,5 ng templat-DNA og 1 enhet Taq DNA-polymerase. Deretter klone inn i plasmid pCR2.1 for å produsere pCR2.1 :: Nsp rsh.
- Inkuber 1 mL av amplifiserte PCR-fragment, 1 ul av pCR2.1 vektor, 1 ul av saltoppløsning og 1 ul av vann. Inkuber ved 25 ° C i 5 minutter og 2 pl av ligering inn i E. coli-celler, og skjermen for å kolonier på LB-plater supplert med 50 ug / ml kanamycin -1 ved å inkubere 37 ° C i 24 timer.
MERK: Primerne anvendt for kloning av rsh er som følger:
rsh F- 5'GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 ' - For funksjonell komplementering, fordøye plasmid pCR2.1 :: Nsp RSH med EcoR1 og ligere innsatsen i det brede vertsområde pRK290 for å produsere det rekombinante plasmid pRK290 :: Nsp RSH ved anvendelse av T4 DNA-ligase.
- Inkuber 50 ng av innsatsen og 20 ng av vektoren i 1x ligase-buffer og 1 enhet T4 DNA-ligase over natten ved 17 ° C. Transform ligation til E. coli-DH5a-celler og skjerm for kolonier på LB-plater supplert med 10 ug / ml tetracyklin -1 ved å inkubere 37 ° C i 24 timer. 17
- Inkuber 1 mL av amplifiserte PCR-fragment, 1 ul av pCR2.1 vektor, 1 ul av saltoppløsning og 1 ul av vann. Inkuber ved 25 ° C i 5 minutter og 2 pl av ligering inn i E. coli-celler, og skjermen for å kolonier på LB-plater supplert med 50 ug / ml kanamycin -1 ved å inkubere 37 ° C i 24 timer.
- Forsterke rsh ORF i tillegg til 599 nukleotider upstris med initiering start området og 46 nukleotider nedstrøms ved oppsigelse nettstedet ved PCR. Bruke en syklus ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 min. Omfatte 12 pmol av hver primer, 1 mM MgSO4, 0,5 mM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater, 0,5 ng templat-DNA og 1 enhet Taq DNA-polymerase. Deretter klone inn i plasmid pCR2.1 for å produsere pCR2.1 :: Nsp rsh.
2. Utarbeidelse av Electro-kompetente bakterieceller for å lette Transformation
MERK: Utarbeidelse av elektro-kompetente celler er basert på protokoll 26 for 1,0 L av kultur som kan skaleres ned til et mindre volum (dvs. 250 ml). Vær oppmerksom på at denne protokollen kan be brukes til å gjøre alle de stammer kompetente som er beskrevet i dette manuskriptet til rette FCA. 22
- Vaksinere 50 ml flytende medium med en enkelt koloni i en kolbe og vokse over natten, og pass på å sjekke genotype av mutant før du begynner dette trinnet (tabell 2).
- På dag to, inokulere 1,0 l av det passende medium (LB for E. coli-mutanter og PD for Novosphingobium sp) med 50 ml av over natten-kulturen, og vokse til en OD 600 på 0,4 til 0,6 (log fase) ved 30 ° C.
- Høste cellene ved sentrifugering ved 5000 xg i 15 min ved 4 ° C, dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 500 ml steril iskald ren H 2 O.
- Sentrifuger cellene ved 5000 xg i 20 min ved 4 ° C, dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 250 ml steril iskald 10% glyserol.
- Sentrifuger cellene ved 5000 xg i 20 min ved 4 ° C, dekanter superliggende væske, og resuspender pelleten i 2,0 ml 10% glycerol.
- Alikvot av cellene ved å overføre 50 ul inn i mikro-sentrifugerør og umiddelbart fryses ved å plassere rørene i et tørris-etanol bad. Oppbevar kompetente celler ved -80 ° C for elektroporering.
3. Elektroporering av bakterieceller med komplemente Plasmider
- For elektroporering, tilsett 1,0 mL (10-50 ng) av rekombinant plasmid til en aliquot (50 ul) av kompetente celler og plassere på is i 5 min.
- Overfør blandingen via pipettering til en elektroporering kyvette og sett electroporation apparat til følgende innstilling: 25 uF kapasitans, 2,5 kV og 200 ohm motstand og levere en puls.
- Tilsett 1,0 ml av gjenopprettingsmedier (LB) til elektroporeringsmetoden kyvetten og overføring ved hjelp av en pipette til en 15 ml konisk tube. Gjenopprette med milde rotasjon i 60 min i en risteinkubator.
- Plate 100 pl av kulturen fra til gjenvinningveldig skritt bort på agarskåler å velge for transformanter ved pipettering og sprer seg ved hjelp av en steril sprederen.
MERK: Sørg for å sjekke tabell 1 og tabell 2 før du begynner dette trinnet for å sjekke antibiotika og genotyper for å gjøre de riktige agarskåler.
4. Transformasjon av AOH1 å lette Funksjonell Komplemente Bruke L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL)
- For complementation analyse, forvandle AOH1 med tom vektor (pBAD33), og med de DapL ekspresjonsvektorene i separate transformasjon hendelser ved hjelp elektroporeringsmetoden protokollen beskrevet i pkt 3.0.
- Velge transformanter ved utplating på LB-agar-medium supplert med 50 ug / ml -1 DAP og 34 ug / ml kloramfenikol -1 og 50 ug / ml kanamycin -1.
- Test for funksjonell komplemente av replika-plating kolonier ved å stryke på LB megdium med 0,2% (w / v) arabinose med og uten 50 ug / ml -1 DAP og 34 ug / ml kanamycin -1.
- Inkuber platene ved 30 ° C i 24 timer og observere resultatene.
MERK: Resultatet skulle vise at mutanten er bare i stand til å vokse på DAP fritt medium bare når dapL-genet blir uttrykt i det mutante bakgrunnen i forhold til vektoren eneste kontroll.
5. Transformasjon av TKL-11 for å lette Funksjonell Komplemente Bruke UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate Ligase (Mure)
- Transform mutanten med tom vektor (pBAD33) og med den Mure uttrykker vektoren (pBAD33 :: VsmurE) ved anvendelse av protokollen som er beskrevet i avsnitt 3.0.
- Plate og velge transformanter på LB-agar-medium supplert med 50 ug / ml -1 tymin og 34 ug / ml kloramfenikol -1 og inkuberes platene ved 30 ° C i 24 timer.
- Test for komplementering ved å stryke eller plettering kolonier fra både i kontrollen og de eksperimentelle transformasjoner på to LB-medium pluss 0,2% (vekt / volum) arabinose og 50 ug / ml -1 tymin.
- Inkuber en plate ved 30 ° C og den andre ved 42 ° C i 24 timer for visuelt å vurdere veksten fenotype.
MERK: Resultatene skulle vise at mutanten er i stand til å vokse ved 42 ° C bare når Mure-genet blir uttrykt i det mutante bakgrunnen i forhold til vektoren eneste kontroll.
6. Transformasjon av DL39 å lette Funksjonell Komplemente Bruke Tyrosin aminotransferase (tyrB)
- Transform DL39 med enten pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160, og velge transformanter på LB-agarplater supplert med 50 pg / ml -1 tyrosin, 50 ug / ml -1 fenylalanin, og 34 ug / ml kloramfenikol -1 ved anvendelse av protokollen som er beskrevet i seksjon 3,0.
- Replica-plate kolonier på minimalt (M9) media med 50 ug / ml -1 fenylalanin og 50 ug / ml -1-tyrosin, 50 ug / ml -1 aspartat, 50 pg / ml leucin -1, 50 ug / ml -1 valin, 50 ug / ml -1 isoleucin, 10 ug / ml uracil -1 0,5% (w / v) glyserol, 0,2% (w / v) arabinose. Også replika-plate kolonier på platene mangler fenylalanin og tyrosin ved å stryke den samme koloni av begge platene.
- Inkuber platene ved 30 ° C i 48 timer for å observere vekst fenotype.
MERK: Resultatet skulle vise at mutanten er bare i stand til å vokse på fenylalanin og tyrosin-fri-media, bare når tyrB-genet blir uttrykt i det mutante bakgrunnen i forhold til vektoren eneste kontroll.
7. Transformasjon av Hx699 å lette Funksjonell supplement til Hypomucoid Phenotype av Novosphingobium sp. Strain Hx699
MERK: Resultatet skulle vise at hypo-slimaktig fenotype kompletteres når rsh er uttrykt i mutante bakgrunnen i forhold til vektoren eneste kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakteriestammene som er ansatt i de ulike funksjonelle komplemente analyser er oppført i tabell 2.
Funksjonell komplemente analyse: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL)
E. coli dobbel mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) havner en mutasjon i dapE genet og en fullstendig sletting av DAPD genet (figur 1). Som sådan, er den mutante ute av stand til å vokse med mindre DAP er gitt. På grunn av disse mutasjonene blir AOH1 anses auxotrof. AOH1 er egnet for funksjonell komplementering analyse av L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) ortologer som DapL katalyserer syntesen av L, L-diaminopimelate direkte fra THDP å lette PG og lys-syntese (figur 1).
AOH1 mutante uttrykke DapLs er i stand til å vokse på L, L-DAP-frie medier som viser at rekombinante enzymer er i stand til å konvertere THDP til L, L-DAP omgå DAPD og DapE enzymatiske trinn i DAP / lys sti (figur 5).
Funksjonell komplementeAnalyse: UDP - N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure)
meso -diaminopimelate (m -DAP) er kryssbindings aminosyre i PG av Gram-negative bakterier. Enzymet UDP- N -acetylmuramoylalanyl- D -glutamyl-2,6- meso -diaminopimelate ligase (Mure) letter tillegg av m -DAP i denne prosessen (figur 3A - B). E. coli mutant TKL-11 havner en mutering i Mure-genet som resulterer i muligheten av mutanten til å vokse ved 42 ° C på grunn av det faktum at det muterte enzymet er ikke i stand til å kaste seg ordentlig ved denne temperatur.
Resultatene vil vise at det er vekst på givende temperatur på 30 ° C ved både kontrollen og eksperimentet. Imidlertid vil bare de celler som uttrykker Mure (eksperiment) kunne vokse på ikke-ettergivende temperatur på 42 ° C (figur 6).
Funksjonell komplemente analyse: Tyrosin aminotransferase (tyrB)
Arabidopsis thaliana koder for et tyrosin aminotransferase som er i stand til å interkonverteres tyrosin og 4-hydroksyfenylpyruvat, og fenylalanin og fenylpyruvat kommentert av At5g36160 (figur 2). 4 E. coli-mutant (DL39) havner en mutasjon i genet tyrB som gjør auxotrof for fenylalanin og tyrosin. 24-26 Det skal bemerkes at mutanten er auxotrof for aminosyrene tyrosin, fenylalanin, aspartat, leucin, isoleucin og valin, såvel på grunn av andre mutasjoner. Stammen er egnet til å vurdere funksjon av tyrB ortologer siden TyrB enzymet ortolog fra E. coli er direkte involvert i syntesen av tyrosin og fenylalanin til rette for proteinsyntese.
Resultatet skal viser at mens den DL39 mutanten er i stand til å vokse på M9 bare når tyrosin og fenylalanin er gitt. Imidlertid stammen som uttrykker A. thaliana (At5g36160) er i stand til å vokse på M9 mediet mangler tyrosin og fenylalanin som viser at enzymet er i stand til å syntetisere tyrosin fra 4-hydroksyfenylpyruvat og fenylalanin fra fenylpyruvat t (Figur 7). 4
Funksjonell komplemente analyse: Rsh (Rela og S POT homolog)
RSH protein fra Novosphingobium sp. (Rr2-17) inneholder både den N-terminale phosphohydrolase og (p) ppGpp syntase-domener, og således har den foreslåtte rolle som bifunksjonelle flekk av E. coli. Dette er blitt bekreftet ved hjelp av komplemente analyse av en E. coli dobbel mutant, CF1693 som havner mutasjon i RELA og spot bruke rsh genet fra Novosphingobium sp. Fenotype av Rr2-17 rsh mutant, oppkalt Hx699 (rsh :: EZ-Tn5, Kan R), resulterer i en hypo-slimaktig og dette er på grunn av en ikke-fungerende rsh. Den hypo-slimaktig fenotype av Hx699 ble bedømt ved complementation tilrettelagt av innfødte rsh Nsp gen som ble klonetinn i de brede vertsområde vektor pRK290. I samsvar med den hypo-slimaktig fenotype, det Hx699 husing tomme vektor pRK290 vise mindre løselig polysakkarid av det som produseres av den trans-suppleres Hx699 (pRK290 :: rsh Nsp) og Rr2-17 inneholder pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp (figur 8) .
Figur 1:. De ulike variantene av lysin anabole trasé fra aspartat som fortsetter gjennom mellom diaminopimelate (DAP) Trasé er kommentert av (A) acyl trasé, (B) diaminopimelate dehydrogenase (DDH) sti og (C) L , L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) veien. Forkortelsen definisjoner for enzymene er som følger: aspartat kinase (Lyse), aspartatsemialdehyd dehydrogenase (asd), tetrahydrodipicolinate syntase (DAPA), tetrahydrodipicolinate reduktase (dapB), tetrahydrodipicolinate acylase (DAPD), N-acyl-2-amino-6-ketopimelate aminotransferase (DAPC), N-acyl-L, L-2, 6-diaminopimelate deacylase (DapE), diaminopimelate epimerase (DapF), meso -diaminopimelate dehydrogenase (DDH), meso -diaminopimelate decarboxylase (Lysa), L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl- d-glutamat. meso -2,6-diaminopimelate ligase (Mure) og lysyl-tRNA syntetase (LysU) klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Anabole trasé for aminosyrer Tyrosinus og fenylalanin. (A) Bakterie (E. coli) svei gjennom det mellomliggende chorismate og (B) i anlegget vei gjennom den mellomliggende arogenate. Forkortelsene for enzymene er som følger: chorismate mutase / prephenate dehydratase (Phea), chorismate mutase, prephenate dehydrogenase (TYRA), og tyrosin aminotransferase (TyrB). Diagrammet ble vedtatt og modifisert form Prabhu og Hudson, 2010. 4 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Den cytoplasmatiske trinnet med peptidoglykansyntesen (A) Skjematisk representasjon av det cytoplasmatiske trinnet med peptidoglykansyntesen.. forkortelsene av enzymene er som følger: UDP- N -acetylglucosamine enolpyruvyl transferase (mura), UDP- N -acetylenolpyruvoylglucosaminereductase (MurB), UDP- N -acetylmuramate-L-alanin-ligase (MurC), UDP- N-acetyl-D-muramoylalanine -glutamat ligase (Murd), UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat 2,6-meso -diaminopimelate ligase (Mure), UDP- N -acetylmuramoyl-tripeptid-D-alanyl-D-alanin-ligase (Murf ), D-alanin-D-alanin-ligase (DDL). (B) Skjematisk fremstilling av en monomer enhet av peptidoglycan viser disakkaridet N -acetylglucosamine (GlcNAc) og N -acetylmuramic (MurNAc) tilknyttet via et β-1,4 glykosidbinding. Aminosyren i posisjon 3 av spindelen peptidet er involvert i tverrbindings betegner ved meso -diaminopimelate (m -DAP) i de fleste Gram-negative bakterier og lys i de fleste Gram-positive bakterier._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Skjematisk modell representasjon av strengere reaksjon i bakterier Eksponering for en næringsfattige miljø induserer Rsh (RELA eller spot) til anabolize den alarmone (p) ppGpp (guanosine pentaphosphate) ved å legge til en fosfatgruppe til GTP (guanosin trifosfat). Eksponering for en næringsrikt miljø induserer ekspresjon av Rsh å hydrolysere (p) ppGpp som er en vekstinhibitor. Diagrammet ble vedtatt og modifisert fra Raskin et al., 2007. 27 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Funksjonell komplemente hjelp DapL Funksjonell supplement til AOH1 E. coli mutant med L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) gen fra bakterien V. spinosum (Vs dapL), anlegget A. thaliana (At dapL) og algen, C. reinhardtii (Cr dapL). Mutanten husing plasmidene, pBAD33, pBAD33 :: Vs DapL, pBAD33 :: Ved dapL og pBAD33 :: Cr dapL ble replika-platet på LB-agarplater supplert med 0,2% (w / v) arabinose, med eller uten 50 ug / ml L, L - diaminopimelate og ble dyrket ved 30 ° C i 24 timer. Diagrammet ble vedtatt og modifisert fra Nachar et al., 2012. 18 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Funksjonell komplemente hjelp Mure Funksjonell complementation av TKL-11 E. coli mutant med den UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) genet fra V. spinosum. Det mutante husing plasmidene BAD33 eller pBAD33 :: VsmurE ble dyrket i LB-medium til en OD 600 på 0,1 og ble serielt fortynnet til 10 -1, 10 -2, -3 og 10 ved bruk av 0,85% (vekt / volum) saltvann . 5 ul av forskjellige fortynninger ble replika-platet på LB medium supplert med 0,2% (vekt / volum) arabinose og ble dyrket vurdert ved 30 ° C og 42 ° C i 24 timer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Funksjonell komplementering av den DL39 E. coli med en tyrosin aminotransferase gen kommentert av locus tag At5g36160 fra A. thaliana. Det mutante plasmider husing pBAD33 eller pBAD33 :: At5g36160 ble selektert på LB-agarskåler supplementert med 50 ug / ml -1 tyrosin, 50 ug / ml -1 fenylalanin, og 34 ug / ml kloramfenikol -1. Stammen ble dyrket i LB-medium til en OD OD 600 på 1,0 og ble serielt fortynnet til 10 -1, 10 -2, -3 og 10 ved bruk av 0,85% (vekt / volum) saltvann. 5 ul av de forskjellige fortynninger ble deretter replika-platet på M9-agarplater supplert med 50 pg / ml -1 -fenylalanin og 50 ug / ml -1 tyrosin, 0,5% (w / v) glyserol, 0,2% (vekt / volum) arabinose, 50 ug / ml -1 aspartat, 50 pg / ml leucin -1, 50 ug / ml -1 valin, 50 ug / ml -1 isoleucin, 10 ug / ml uracil -1, og også på plater mangler fenylalanin og tyrosin og ble inkubert ved 30 ° C i 48 timer. Diagrammet ble vedtatt og modifisert form Prabhu og Hudson, 2010. 4 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Funksjonell komplementering av den hypomucoid fenotypen til Novosphingobium sp. mutant belastning Hx699. Than villtypestamme Novosphingobium sp. (Rr2-17) og mutantstammen Hx699 ble transformert med pRK290 eller pRK290 :: rsh Nsp. Stammene ble strøket ut på en "X" og ble ytterligere dyrket på PD-agar ved 30 ° C i minst 4 dager å observere fenotyper. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| komplemente plasmider | Antibiotikaresistens markører | Sitering |
| pBAD33 | cm r | 21 |
| pBAD33 :: På dapL | cm r | 2 |
| pBAD33 :: Cr dapL | cm r | 20 |
| pBAD33 :: Vs dapL | cmr | 18 |
| pBAD33 :: At5g36160 | cm r | 4 |
| pBAD33 :: Vs Mure | cm r | 18 |
| pRK290 | Tet r | 28 |
| pRK290 :: rsh Nsp | Tet r | 17 |
Tabell 1: Funksjonell komplemente plasmid anvendt i denne studien Liste av plasmider som brukes for funksjonell komplementering analyse.. Cm R og Tet R betegner kloramfenikol og tetracyklin resistens hhv.
| Strain navn | organisme | genotype | phenotype | Kilde |
| AOH1 | E coli | Δ DAPD :: Kan2, dapE6 | Auxotrofe for diaminopimelate | Hudson Laboratory |
| TKL-11 * | E coli | thr-en, leuB6 (Am), murE1, fhuA21, codA1, lacY1, TSX-95, glnV44 (AS), λ -, pyrF101, hans-108, thyA6, argG66, ilvA634, thi-en, deoC1 | Vekst følsom fenotype var det muterte vokser ved 30 ° C, men ikke en 42 ° C | CGSC (# 5989) |
| DL39 * | E coli | LAM-, aspC13, fnr-25, RPH-en ilvE12, tyrB507 | Auxotrof for aminosyrene; tyrosin, fenylalanin, leucin, isoleucin og valin | CGSC (# 6913) |
| Rr2-17 | Novosphingobium sp. (Vill-type) - | Hyper-mucoid | Savka Laboratory | |
| Hx699 | Novosphingobium sp. | rsh :: EZ-Tn5, Kan R | Hypo-mucoid | Savka Laboratory |
Tabell 2:. Bakteriestammer brukt i denne studien Liste over bakteriestammer sammen med respektive genotyper og fenotyper brukt i denne studien. Vær oppmerksom på at stammer (TKL-11 og DL39) merket med stjerne kan fås direkte fra Coli Genetic Stock Senter (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange av kursene som er en integrert del av bioteknologi og molekylær biovitenskap pensum ved Rochester Institute of Technology har et laboratorium komponent i tillegg til foredrag del av kurset. Læreplanen for studieåret 2014-2015 inneholder totalt 48 kurs, 29 av dem inneholder et laboratorium komponent som representerer ca 60%. Et slikt kurs er Fundamentals of Plant biokjemi og patologi (FPBP), en blandet forelesning / laboratoriekurset og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP), et laboratorium basert kurs.
Laboratoriet komponent av hvert kurs er utviklet for å forsterke forelesningsmateriale. For eksempel er biokjemiske mekanismer og metabolisme sterkt understreket i FPBP og BPP. Noen av temaene inkluderer aminosyre metabolisme, peptidoglykan biosyntese, anlegg sekundær metabolisme, bakteriell respons på miljø nisjer, blant andre. Forfatterne har integrert funksjonell complementering som laboratorieøvelser i både kurs for å forsterke forståelsen av metabolske veier som er omtalt i foredraget og eller pre-laboratorie presentasjoner. Fire eksempler på bruk av funksjonell komplementering eksperiment for å analysere funksjonen av gener som er involvert i biokjemiske mekanismer av lys, PG, Tyr, Phe og den strenge responsen av bakterier blir diskutert.
Det er flere grunner til at forfatterne har integrert denne eksperimentelle modulen inn sine kurs. For det første eksponering for funksjonell komplemente analyser er et utmerket verktøy for å forsterke eller introdusere temaer som er relatert til genetikk, evolusjon, genomikk, bioinformatikk og biokjemi. For det andre er det eksperiment lettvinte og kan utføres på en kurs laboratoriemiljø. Alle de reagenser som benyttes er trygge og bakteriene som benyttes er betegnet som en biosikkerhetsnivå og er ikke patogene. Som sådan, forfatterne er villige til å gjøre reagenser som plasmider og bacterial stammer tilgjengelig for alle som er i interessert i å innlemme funksjonell komplemente som en del av deres undervisningserfaring. Det skal bemerkes at to av de bakterielle stammer (TKL-11 og DL39) ble oppnådd direkte fra Coli Genetic Stock senter (CGSC) (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Det er viktig å merke seg at det er flere viktige trinn til den funksjonelle komplemente protokollen. Det første trinnet er å sørge for at mutant (e) er i stand til å dyrkes før du begynner noen eksperimenter. Årsaken er at i henhold til Tabell 2, er det flere genotyper forbundet med hver mutant. For å dyrke mutant å fremstille kompetente celler før forsøket, prøve voksende mutant med eller uten de nødvendige kjemikalier og eller temperatur krav med hensyn til PG Mure mutant. Dette er også en pedagogisk øyeblikk fordi det vil vise seg at mutant er autentisk før noen eksperimenter.
Denbør også bemerkes at selv om dette er et utmerket verktøy for å teste funksjonen (e) av gener, er det ikke alltid fungerer på grunn av flere faktorer slik som kodonbruk hvor gen (er) av interesse ikke kan bli skikkelig settes på grunn av manglende de aktuelle tRNAs i mutant organismen. Men dette kan omgås ved kodon optimalisering av den åpne leseramme eller cDNA under kloningstrinnet som normalt utføres ved å syntetisere genet av interesse ved å endre nukleotidene for å samsvare med kodonbruken for den mutante (e). Et annet problem er at noen eukaryote proteiner krever posttranslasjonelle modifikasjoner for funksjon. Posttranslasjonell modifikasjon er ikke en funksjon av bakterier og som sådan kan man ikke være i stand til å bruke denne teknikk for å teste funksjonen (e) av gener ved bruk av bakterie- mutanter.
Betydningen av den teknikken som vi vektlegger i kursene er at FCA er en utmerket måte å teste til funksjon av gener in vivo. Karakterisering av enzymer er for det meste basert på in vitro-studier hvor enzymet renses og tradisjonelle enzymatiske analysene blir utført. 29 Også tradisjonelle enzymatiske analyser er stor for å måle eller detektere enzymatisk aktivitet, kan man ofte "tvangsfore" enzymet med kommersielt tilgjengelige substrater som ikke er ren eller naturlig for enzymet. 30 en in vivo system som FCA gir et mer autentisk bevis med hensyn til funksjon av gener gitt det faktum at det er i drift under fysiologiske betingelser som appose til in vitro som er normalt ikke under fysiologiske betingelser. 2 gitt mangel på informasjon om funksjonene til mange gener og det faktum at de fleste kommentarene er basert på prediksjon, 31 beherske denne teknikken vil lette eksperimenter for å belyse funksjonene til mange gener som fortsatt tåkete eller de som i dag anses å ha mulige funksjoner i ulike offentlige databaser.
jove_content "> Et av problemene når det gjelder teknikk som ofte oppleves er i utarbeidelsen av kompetente celler. En bør sørge for at cellene er forberedt på riktig måte for å sikre at det er nok celler til å bli forvandlet, i tillegg til å sørge for at cellene vaskes godt med vann og glycerol for å forhindre overordnede under electroporation prosessen. Man skal også være oppmerksom på fenotypen av mutanten ved å sørge for at cellene dyrkes med det passende kjemisk eller ved den riktige temperatur for å lette både den opprinnelige vekst av mutanten og også for den funksjonelle komplemente analyse.Når denne teknikken er mestret, kan forskere bruker funksjonell komplementering assay for å bedømme funksjon av gener så lenge det er et egnet mutasjon i en organisme som måtte finnes for denne analysen. Vær oppmerksom på at protokollen i dette manuskriptet beskriver bruken av bakterier. Men andre organismer som for eksempelplanter og pattedyrceller, blant andre, kan brukes til å vurdere funksjon av gener. 32-33 En ville bare må sørge for at de riktige vektorer brukes i tillegg til å optimalisere den transformerende og eller transfeksjon av cellene for å lette eksperimentet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
AOH og MAS erkjenner College of Science og Thomas H. Gosnell School of Life Sciences ved Rochester Institute of Technology for støtte. Dette arbeidet ble støttet delvis av United States National Science Foundation (NSF) award til AOH MCB-1120541.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | ||
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 | |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 | |
| Temperature controlled incubator | Generic | ||
| Microcentrifuge | Generic | ||
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 | |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 | |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 | |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 | |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 | |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 | |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 | |
| E. coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 | |
| E. coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 | |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 | |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
