Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft.
TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z L – u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af RNA-rettede gen silencing teknologier, som anvender en kunstig lille guide RNA (sgRNA) til at guide tRNA 3'forarbejdning endoribonuclease, tRNase Z L at anerkende et mål RNA. sgRNAs kan optages af celler uden transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller. Vi har screenet en sgRNA bibliotek indeholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkningen på levedygtigheden af humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af de cancercellelinjer. Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordan at konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Omkring 2.000 hits ville forventes at opnås ved screening i fuld skala sgRNA bibliotek bestående af 16.384 heptamerer.
TRUE gendæmpning (betegnet efter tR Nase Z L – u tilizing e fficacious gendæmpning) er en af de RNA-dirigerede gene silencing teknologier 1. Denne teknologi er blevet udviklet på baggrund af egenskaber tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3 »behandling endoribonuclease: det kan kløve enhver target RNA ved enhver forventet sted under ledelse af en kunstig lille guide RNA (sgRNA) ved at anerkende en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellem mål-RNA og sgRNA 2 – 9. sgRNA, som normalt er 7-31 nt i længde, er kategoriseret i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA, og krog RNA.
Vi har påvist effektiviteten af TRUE gendæmpning ved at indføre forskellige kunstigt designede sgRNAs i levende celler 10 – 15. Vi har også vist, at der kan optages sgRNAs af celler without eventuelle transfektionsreagenser og kan nedregulere deres mål-RNA-niveauer og / eller inducere apoptose i humane cancerceller 16 – 18. TRUE gendæmpning synes at arbejde på den intracellulære og intercellulære gen regulatoriske netværk system via tRNase Z L og naturlige sgRNAs 19 – 21.
Vi har konstrueret en sgRNA bibliotek, der indeholder 156 heptamer-type sgRNAs at søge efter potentielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blodkræft 22. Vi har screenet det for virkningen på levedygtigheden af humane myelom og leukæmiceller, og fandt, at 20 af dem effektivt kan inducere apoptose i mindst en af de cancercellelinjer. Og 4 af dem har vist sig at reducere tumor vækst i mus xenograft eksperimenter.
Her præsenterer vi en protokol til screening af en heptamer-typen sgRNA bibliotek for potentielle terapeutiske lægemidler mod blodkræft. Protokollen indeholder hvordanat konstruere sgRNA biblioteket, hvordan at vurdere effekten af hver sgRNA på celle levedygtighed, og hvordan man yderligere at evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål-RNA'er og evaluering af effektive sgRNAs i muse xenograftmodeller kan udføres ifølge traditionelle fremgangsmåder 17,22, skønt disse ikke er inkluderet i denne protokol.
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilpasses og Seamless Technology Transfer Program via Target-drevet R & D, Japan Science and Technology Agency, Fonden Science Research Promotion fra Corporation for private skoler Japan Fremme og Mutual Aid, og JSP'er KAKENHI Grant Numbers 24300342 og 15H04313 .
Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |