TRUE silenciamiento génico: Proyección de un tipo heptámero Guía Pequeño ARN Biblioteca de agentes terapéuticos potenciales del cáncer
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre.
Abstract
Silenciamiento génico TRUE (denominado después tR Nase Z L – u tilizing e fficacious silenciamiento génico) es uno del gen dirigida por ARN silenciar tecnologías, que utiliza una guía de pequeño artificial ARN (sgRNA) para guiar endoribonuclease procesamiento de tRNA 3 ', tRNase Z L , para reconocer un ARN diana. sgRNAs pueden ser absorbidos por las células sin reactivos de transfección y se pueden regular a la baja los niveles de ARN diana y / o inducir la apoptosis en células de cáncer humano. Hemos proyectado una biblioteca sgRNA que contiene 156 sgRNAs de tipo heptámero para el efecto sobre la viabilidad de células de mieloma y leucemia humana, y se encontró que 20 de ellos puede inducir eficazmente la apoptosis en al menos una de las líneas celulares de cáncer. Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre. El protocolo incluye la forma de construir la biblioteca sgRNA, la forma de evaluar el efecto de cada sgRNA sobre la viabilidad celular, y cómo further evaluar los sgRNAs eficaces por citometría de flujo. Se esperaría que alrededor de 2.000 accesos a ser obtenido mediante el cribado de la biblioteca sgRNA a gran escala compuesta de 16.384 heptamers.
Introduction
Silenciamiento génico TRUE (denominado después tR Nase Z L – u tilizing e fficacious silenciamiento génico) es una de las tecnologías de silenciamiento génico dirigidas por ARN 1. Esta tecnología ha sido desarrollada en base a las propiedades de tRNase Z L (o 3 'tRNase), tRNA 3' endorribonucleasa procesamiento: se puede escindir cualquier ARN diana en cualquier sitio de espera bajo la dirección de un guía pequeña artificial ARN (sgRNA) mediante el reconocimiento de una pre-tRNA-como o micro-pre-tRNA-como estructura formada entre el ARN diana y la sgRNA 2-9. sgRNA, que es por lo general 7-31 nt de longitud, se clasifica en cuatro grupos, 5'-media-tRNA, ARN heptámero, ARN lineal 14-nt, y ARN gancho.
Hemos demostrado la eficacia del silenciamiento génico TRUE mediante la introducción de diversos sgRNAs diseñados artificialmente en las células vivas 10-15. También hemos demostrado que sgRNAs pueden ser absorbidos por las células wiThout cualquier reactivo de transfección y se puede regular a la baja los niveles de ARN diana y / o inducir la apoptosis en células de cáncer humano 16 – 18. TRUE silenciamiento génico parece funcionar en el intracelular y el sistema de red de regulación de genes intercelular a través de tRNase Z L y sgRNAs naturales 19 – 21.
Hemos construido una biblioteca que contiene 156 sgRNA sgRNAs de tipo heptámero para buscar potenciales sgRNAs de tipo heptámero terapéuticas para el cáncer de la sangre 22. Hemos proyectado que para el efecto sobre la viabilidad de células de mieloma y leucemia humana, y se encontró que 20 de ellos puede inducir eficazmente la apoptosis en al menos una de las líneas celulares de cáncer. Y 4 de ellos se han demostrado reducir las tasas de crecimiento de tumores en experimentos de xenoinjertos de ratón.
Aquí se presenta un protocolo para la detección de una biblioteca de tipo sgRNA heptámero para posibles fármacos terapéuticos contra cánceres de la sangre. El protocolo incluye la formapara construir la biblioteca sgRNA, la forma de evaluar el efecto de cada sgRNA sobre la viabilidad celular, y la forma de evaluar más a fondo las sgRNAs eficaces mediante citometría de flujo. Análisis de los ARN diana celular de sgRNA y evaluación de sgRNAs eficaces en modelos de xenoinjertos de ratón se pueden realizar de acuerdo con métodos convencionales 17,22, aunque éstos no están incluidos en este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Transferencia Adaptable y Tecnología sin fisuras a través de la I + D, la Agencia de Tecnología Japonesa de Ciencia y el Fondo de Promoción de la Investigación en Ciencias de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para las escuelas privadas de Japón, impulsado por el destino, y los números JSP KAKENHI Grant 24300342 y 15H04313 .
Materials
| Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
| OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
| Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
| RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| 96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
| Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
| Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
| FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
| PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
| PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
| 7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
| Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |
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