Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft.
TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L – u tilizing e fficacious genet Slå) er en av RNA-rettet genet stanse teknologier, som benytter en kunstig liten guide RNA (sgRNA) til å veilede tRNA 3 'behandling endoribonuclease, tRNase Z L , for å gjenkjenne et target RNA. sgRNAs kan tas opp av cellene uten transfeksjon reagenser, og kan nedregulere sitt target-RNA-nivå og / eller induserer apoptose i humane kreftceller. Vi har vist en sgRNA bibliotek inneholdende 156 heptamer-type sgRNAs for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordan å konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan du kan further evaluere de effektive sgRNAs ved flowcytometri. Rundt 2000 treff forventes å oppnås ved screening fullskala sgRNA bibliotek består av 16,384 heptamers.
TRUE genet Slå (kalt etter tR nase Z L – u tilizing e fficacious genet Slå) er en av de RNA-rettet genet Slå teknologier 1. Denne teknologien har blitt utviklet basert på egenskapene til tRNase Z L (eller 3 'tRNase), tRNA 3' behandling endoribonuclease: det kan holde seg noen mål RNA når som forventet stedet i regi av en kunstig liten guide RNA (sgRNA) ved å anerkjenne en pre-tRNA-lignende eller mikro-pre-tRNA-lignende struktur dannet mellom target RNA og sgRNA 2 – 9. sgRNA, som vanligvis er 7-31 nt i lengde, er inndelt i fire grupper, 5'-halv-tRNA, heptamer RNA, 14-nt lineær RNA og RNA-krok.
Vi har vist effekt av TRUE genet Slå ved å innføre ulike kunstig designede sgRNAs i levende celler 10-15. Vi har også vist at sgRNAs kan tas opp av celler without noen transfeksjon reagenser og kan nedregulere sine mål RNA nivåer og / eller indusere apoptose i humane kreftceller 16 – 18. TRUE genet Slå ser ut til å fungere på den intracellulære og inter gennettverk system via tRNase Z L og naturlige sgRNAs 19 – 21.
Vi har konstruert en sgRNA bibliotek som inneholder 156 heptamer-type sgRNAs å søke etter potensielle terapeutiske heptamer-type sgRNAs for blod kreft 22. Vi har undersøkt den for virkning på levedyktigheten til human myelom og leukemi celler, og fant at 20 av dem kan effektivt indusere apoptose i minst en av de kreftcellelinjer. Og fire av dem har vist seg å redusere svulstvekstrater i mus xenograft eksperimenter.
Her presenterer vi en protokoll for screening av en heptamer-type sgRNA bibliotek for potensielle terapeutiske legemidler mot blodkreft. Protokollen inkluderer hvordanå konstruere sgRNA biblioteket, hvordan å vurdere effekten av hver sgRNA på celle levedyktighet, og hvordan man skal videre vurdere effektive sgRNAs av flowcytometri. Analyse for sgRNA cellulære mål RNA og evaluering av effektive sgRNAs i mus xenograft-modeller kan bli utført ifølge konvensjonelle fremgangsmåter 17,22, selv om disse ikke er inkludert i denne protokollen.
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Tilpasningsdyktig og sømløs Technology Transfer Program gjennom Target-drevet R & D, Japan Science and Technology Agency, Science Research Promotion Fund fra Kampanjen og Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan, og JSP KAKENHI Grant Tall 24300342 og 15H04313 .
Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |