כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם.
להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z – u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) הוא אחד של הגן מכוונת RNA ההשתקה טכנולוגיות, אשר מנצל RNA מדריך קטן מלאכותית (sgRNA) להנחות endoribonuclease עיבוד 'tRNA 3, tRNase Z L , להכיר RNA היעד. sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי תאים ללא כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושיים. יש לנו הוקרנתי ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג להשפעה על כדאיות של תאי מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאתי כי 20 מהם יכולים לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות התאים הסרטניים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל כיצד לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד פוrther להעריך את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. כ -2,000 כניסות תהיינה צפויות להיות מושגת על ידי הקרנת ספריית sgRNA בהיקף מלא מורכבת 16,384 heptamers.
להשתקת גנים TRUE (כינה לאחר L TR Nase Z – u tilizing להשתקת גנים דואר fficacious) היא אחת הטכנולוגיות להשתקת גנים מכוונת RNA 1. טכנולוגיה זו פותחה על בסיס מאפיינים של tRNase Z L (או 3 'tRNase), tRNA 3' endoribonuclease עיבוד: זה יכול לבקע כל RNA יעד בכל אתר צפוי בניהולו של RNA מדריך הקטן מלאכותי (sgRNA) על ידי הכרה טרום tRNA דמוי או מבנה מיקרו-טרום tRNA דמוי שנוצר בין RNA היעד ואת sgRNA 2 – 9. sgRNA, שהיא בדרך כלל 7-31 NT אורך, הוא מסווג לארבע קבוצות, 5'-חצי-tRNA, RNA heptamer, RNA ליניארי 14-NT, ו- RNA וו.
אנחנו הוכחנו את היעילות של להשתקת גנים נכון על ידי החדרת sgRNAs המלאכותית מעוצב השונה לתוך תאי חי 10 – 15. גם הראינו כי sgRNAs יכול להיות נלקח על ידי Wi תאיםthout כל ריאגנטים transfection ויכול downregulate רמות RNA היעד שלהם ו / או לגרום אפופטוזיס בתאי סרטן אנושי 16 – 18. להשתקת גנים TRUE מופיע לעבוד על תאיים ומערכת רשת גנטית אינטר באמצעות tRNase Z L ו- sgRNAs טבעי 19 – 21.
בנינו ספריית sgRNA המכילה 156 sgRNAs heptamer מהסוג לחפש sgRNAs heptamer מהסוג טיפולי פוטנציאל סרטני דם 22. יש לנו הוקרן אותה ההשפעה על יכולת הקיום של תאים מיאלומה ולוקמיה אדם, ומצאו כי 20 מהם יכול לגרום ביעילות אפופטוזיס לפחות אחד שורות תאים סרטניים. ו -4 מהם הוכחו להפחית את שיעורי צמיחת גידולים בניסויים xenograft העכבר.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקרנה של ספריית sgRNA heptamer מסוג עבור תרופות טיפוליות פוטנציאל נגד סרטן הדם. הפרוטוקול כולל איךכדי לבנות את הספרייה sgRNA, איך להעריך את ההשפעה של כל sgRNA על כדאיות התא, וכיצד להעריך עוד יותר את sgRNAs יעיל על ידי cytometry הזרימה. ניתוח עבור RNAs היעד הסלולרי של sgRNA והערכת sgRNAs יעיל במודלים xenograft העכבר יכול להתבצע על פי שיטות קונבנציונליות 17,22, אם כי אלה אינם נכללים בפרוטוקול זה.
In most cases, fully 2′-O-methylated, 5′- and 3′-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 µM) appear to be stable at below -20 °C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5′- or 3′-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית העברת יכולת הסתגלות חלקה וטכנולוגיה בראי R מונחה יעד & D, יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות, הקרן לקידום מחקר מדעי מעזר קידום הדדי Corporation עבור בתי ספר פרטיים של יפן, ואת מספרי JSPs KAKENHI גרנט 24300342 ו 15H04313 .
Custom heptamer RNA | Nippon Bioservice | ||
OligoSep Prep HC Cartridge | Transgenomic | 99-3860 | |
Water-for-injection-grade Water | Otsuka Pharmaceutical | 7131400A2129 | |
RPMI-1640 medium | Wako | 189-02025 | |
Fetal Bovine Serum | SIGMA-ALDRICH | 172012-500ML | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
96 Well Plate | Greiner Bio-one | 655 180 | |
Cell Counting Kit-8 | DOJINDO | 343-07623 | WST-8 solution |
Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R | TEKAN | 510-82851 | |
FACS Round-Bottom Tube | BD Falcon | 60819-820 | |
Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | P7059-1L | |
PE Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 51-66121E | |
PE Annexin V | BD Biosciences | 51-65875X | |
7AAD | SIGMA-ALDRICH | A9400-1MG | |
Flow Cytometer, FACSCalibur | BD Biosciences | 342973 |