تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
يبدأ الهيكل العظمي محطة العضلات التمايز مع التزام خلايا السلائف أرومية متوسطة المحفزة لmyoblasts. هذه الخلايا لديها لا تزال القدرة على التكاثر أو أنها يمكن أن تفرق والصمامات في myotubes متعددة النوى، الذي ينضج أيضا على تشكيل myofibers. ومدبرة الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات من خلال العمل المنسق لعوامل النسخ المختلفة، ولا سيما أعضاء العوامل التنظيمية العضلات أو MRFs (MyoD، Myogenin، Myf5، وMRF4)، وتسمى أيضا bHLH عضلي عوامل النسخ الأسرة. هذه العوامل تتعاون مع المجمعات إعادة عرض لونين داخل الشبكة التنظيمية النسخي مفصلة لتحقيق تكون العضل والهيكل العظمي. وفي هذا الصدد، يعتبر MyoD سيد عامل النسخ عضلي في إحداث محطة العضلات التمايز. ويعزز هذه الفكرة عن طريق قدرة MyoD لتحويل الخلايا غير العضلات في خلايا العضلات والهيكل العظمي. نحن هنا وصف والنهج المتبع لتحديد MyoDشركاء البروتين بطريقة شاملة من أجل إلقاء الضوء على العوامل المختلفة المشاركة في الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات. والهدف على المدى الطويل هو فهم الآليات الجينية تشارك في تنظيم الجينات العضلات والهيكل العظمي، أي، أهداف MyoD. يتم تحديد شركاء MyoD باستخدام جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات الوسم) من نظام مغاير بالإضافة إلى الشامل التوصيف الطيفي (MS)، تليها المصادقة على دور الشركاء المعنيين خلال الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات. أشكال شاذة من العوامل عضلي، أو تنظيمها الشاذة، وترتبط مع عدد من اضطرابات العضلات: الوهن العضلي الخلقي، الحثل العضلي، العضلية المخططة والعيوب في تجديد العضلات. على هذا النحو، توفر عوامل عضلي مجموعة من الأهداف العلاجية المحتملة في اضطرابات العضلات، سواء فيما يتعلق بالآليات التي تسبب المرض في حد ذاته وآليات التجدد التي يمكن أن تحسن معالجة المرض. وهكذا، فإن فهمه تفصيلادينغ من التفاعلات بين الجزيئات وبرامج الوراثية التي تسيطر عليها عوامل عضلي غير ضروري لتصميم الرشيد للعلاجات فعالة.
Introduction
وتتكون الكائنات الحية متعددة الخلايا حقيقية النواة من الأعضاء والأنسجة المختلفة. كل الأنسجة وظيفية لديها التعبير نمط جين معين، والتي يتم تحديدها في كل خطوة التمايز. ويشمل تمايز الخلايا تفعيل جينات معينة، والحفاظ على التعبير عنها، وبشكل عام، إسكات مجموعة من الجينات مثل المتورطين في تكاثر الخلايا. الهيكل العظمي التمايز العضلات، أو تكون العضل، وبالتالي فإن عملية متعددة الخطوات، التي تبدأ مع تقرير من الخلايا الجذعية أرومية متوسطة إلى myoblasts، ومن ثم يؤدي إلى التمايز النهائي من هذه myoblasts في أول أحادية منوى، ثم متعددة منوى، myotubes . وهكذا، myoblasts هي "تحديد" الخلايا، التي لا تزال قادرة على التكاثر، ولكنهم ملتزمون نسب الهيكل العظمي والعضلات، وبالتالي يمكن أن تفرق فقط في خلايا العضلات والهيكل العظمي سواء أثناء التطور الجنيني أو في تجديد العضلات الكبار. عملية محطة العضلات والهيكل العظمي تختلفومدبرة entiation باستخدام برنامج جيني محدد يبدأ مع خروج دائم من دورة الخلية من خلايا السلائف بالخلايا العضلية الجذعية التي تؤدي إلى إسكات نهائي من الجينات انتشار المرتبطة بها، مثل الجينات المستهدفة E2F 1. في الواقع، خلال عملية التمايز النهائي والاعتقال بالخلايا العضلية الجذعية انتشار خطوة الحاسمة التي تسبق التعبير عن العضلات والهيكل العظمي جينات معينة ودمج myoblasts إلى myotubes 2. يسمح هذا البرنامج الخلايا الجذعية العضلية الكبار، وتسمى أيضا الخلايا الأقمار الصناعية، للتمييز خلال عملية تجديد بعد اصابة في العضلات والهيكل العظمي.
تكون العضل الثدييات تعتمد بشكل كبير على عائلة مكونة من عضلي الأساسي الحلزون حلقة حلزون (bHLH) النسخ عوامل MyoD، Myf5، MRF4 وMyogenin، وكثيرا ما يشار إليها باسم الأسرة من العوامل الهيكلية تقرير العضلات أو MRFs (العضلات العوامل التنظيمية) 3. كل واحد منهم يلعب دورا أساسيا في مواصفات وDIFferentiation من خلايا العضلات والهيكل العظمي لديه نمط التعبير محددة 05-07 أبريل. تفعيل Myf5 وMyoD يشكل خطوة حاسمة من أن يرتكب الخلايا إلى النسب عضلي، والتعبير لاحق من Myogenin يطلق تكون العضل مع تفعيل جينات معينة العضلات والهيكل العظمي، مثل MCK (العضلات الكرياتين كيناز). عضلي عوامل النسخ bHLH تتعاون مع أفراد الأسرة MEF2 في تفعيل الجينات العضلات من مواضع الصمت سابقا 8. كما أنها تحفز الهيكل العظمي النسخ الجيني العضلات وheterodimers مع البروتينات bHLH في كل مكان، E12 و E47، والمعروفة باسم البروتينات E، التي تربط ما يسمى صناديق البريد في مختلف المناطق الجينات التنظيمية 8. تطور، رقم (المانع من التمايز) وعوامل أخرى تنظم سلبا على هذه العملية، من خلال التنافس مع MyoD للبروتينات E ملزمة 8.
يعتبر MyoD كلاعب رئيسي في التسبب في العضلات محطة التمايز 9 </sتصل> لأنه لديه القدرة على إحداث برنامج تحديد عضلي / التمايز (العابرة للتمايز) في كثير من النظم غير العضلات متباينة تماما 10-13. في الواقع، والتعبير القسري للMyoD الحث على تمايز العابر للأنواع الخلوية المختلفة حتى تلك المستمدة من أصل embryologic آخر 12. على سبيل المثال، يمكن MyoD تحويل خلايا الكبد، الخلايا الليفية، الخلايا الصباغية، neuroblasts، والخلايا الشحمية إلى خلايا تشبه العضلات. العمل العابر للdifferentiative من MyoD ينطوي على تنشيط غير طبيعي للبرنامج جيني عضلي (وخاصة الجينات المستهدف) في بيئة غير العضلات، يصاحب ذلك إلى إسكات البرنامج الوراثي الأصلي (لا سيما الجينات انتشار).
في المتكاثرة myoblasts، وأعرب عن MyoD كنه غير قادر على تنشيط الجينات هدفه حتى عندما يفرض على المروجين 14-16. ولذلك، فإن الحاجة إلى MyoD أن يتم التعبير عنها بشكل مستمر في myoblasts غير متمايزة يبقى ELU تماماالجديد إنجازا هاما. MyoD يمكن قمع الجينات هدفه بسبب توظيف إنزيمات تعديل الكروماتين القمعية في المتكاثرة myoblasts قبل التحميل تفعيل الكروماتين إعادة الانزيمات 14،17. على سبيل المثال، في المتكاثرة myoblasts، ويرتبط MyoD مع النسخي شارك في كاظمة KAP-1، deacetylases هيستون (HDACs) وميثيل يسين القمعي (KMTs)، بما في ذلك هيستون H3 يسين 9 أو H3K9 وH3K27 KMTs، وقمع بنشاط التعبير الجينات المستهدف عن طريق إنشاء هيكل لونين القمعية محليا 14،17. الأهم من ذلك، أشار تقرير صدر مؤخرا أن MyoD هو في حد ذاته ميثليته مباشرة من قبل H3K9 حزب الكومينتانغ G9a مما أدى إلى تثبيط النشاط transactivating لها (16).
الآليات الجينية تشارك في هذا التمايز عبر الخلايا غير العضلات التي MyoD غير معروفة إلى حد كبير. والجدير بالذكر أن بعض خطوط الخلايا مقاومة لالناجم عن MyoD العابرة للتمايز. وهكذا، في خلايا هيلا، MyoD إما غير نشطة أوبل قد تكون بمثابة كاظمة بدلا من منشط النسخ نظرا لعدم وجود تعبير عن الوحيدات BAF60C من لونين إعادة عرض معقدة السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية 18. وبالتالي يمكن لهذا النموذج أن يكون الاختيار لوصف أفضل لآليات القمع الجينات التي يسببها MyoD. وهي مناسبة أيضا لفحص قدرة MyoD للحث على البيئة لونين القمعية في مواضع هدفه مع الشركاء المرتبطين بها، وبالتالي الكشف عن الآليات القمعية التي تعتمد على MyoD في المتكاثرة myoblasts لضبط محطة التمايز.
نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد الشركاء MyoD باستخدام جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات الوسم) بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي (MS) التوصيف. استخدام خلايا هيلا-S3 التعبير عن مستقر العلم-HA-MyoD يسمح للحصول على ما يكفي من المواد لتنقية المجمعات MyoD من مقتطفات النووية مجزأ. وأعقب تحديد الشركاء MyoD في نظام مغاير من قبل validatiعلى في النظام ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح الطريقة المعروضة تحديد شاملة من شركاء عامل النسخ، MyoD. وكشفت شركاء MyoD في نظام مغاير مقاومة للالتمايز الناجم عن MyoD، وهي خلايا هيلا-S3. وبالتالي، بحكم التعريف، يتم التعبير عن بتواجد مطلق شركاء MyoD التي تم تحديدها. وتشمل هذه العوامل العامة وتسلسل معين النسخ، والإنزيم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it’s time to exchange!. Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
