タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
骨格筋分化は、筋芽細胞への多能性中胚葉前駆細胞のコミットメントから始まります。これらの細胞はまだ増殖する能力を持っているか、彼らは筋線維を形成するために、さらに成熟さ多核筋管に分化するとヒューズができます。骨格筋分化は、様々な転写因子の協調作用によって編成され、特に筋肉調節因子またはMRFは（のMyoD、ミオゲニン、Myf5の、およびMRF4）のメンバーは、また、筋原性のbHLH転写因子ファミリーと呼ばれます。これらの要因は、骨格筋形成を達成するために精巧な転写制御ネットワーク内のクロマチンリモデリング複合体と協力しています。この中で、MyoDのは、筋分化を誘発におけるマスター筋原性転写因子であると考えられます。この概念は、骨格筋細胞への非筋細胞に変換するのMyoDの能力によって強化されます。ここでは、MyoDのを識別するために使用される方法を説明します骨格筋分化に関与するさまざまな要因を解明するために、徹底的な方法でタンパク質パートナー。長期的な目的は、骨格筋遺伝子の制御、 すなわち 。、MyoDの標的に関与するエピジェネティックなメカニズムを理解することです。 MyoDのパートナーは骨格筋分化の間に、関連するパートナーの役割の検証に続いて、質量分析（MS）特性評価、に結合された異種システムからタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用して識別されます。筋再生における先天性筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、横紋筋肉腫および欠陥：筋原性因子、またはそれらの異常調節の異常な形態は、筋障害の数と関連しています。このように、筋原性の要因は、両方の病気自体を引き起こすメカニズムおよび疾患の治療を改善することができ、回生機構に関しては、筋疾患における潜在的な治療標的のプールを提供しています。したがって、詳細なunderstan筋原性の要因によって制御分子間相互作用や遺伝的プログラムの鼎は、効率的な治療法の合理的な設計のために不可欠です。
Introduction
真核生物の多細胞生物は、異なる器官及び組織で構成されています。それぞれの機能的な組織は、各分化段階で決定される特定の遺伝子パターンの発現を有します。細胞分化は、特定の遺伝子の活性化、一般的にそれらの発現の維持、遺伝子、細胞増殖に関与するものなどの組のサイレンシングを含みます。骨格筋分化、または筋形成、すなわち筋芽細胞に中胚葉幹細胞の決意から始まり、従って、多段階のプロセスであり、最初の単核、その後多核、筋管へのこれらの筋芽細胞の分化をもたらします。このように、筋芽細胞はまだ増殖することが可能である細胞を、「決定」されているが、それらは、骨格筋系統にコミットしている、したがって、胚発生中または成体の筋再生のいずれかで、骨格筋細胞にのみ分化することができます。骨格筋端末の処理が異なりますentiationは、E2F標的遺伝子1のような増殖関連遺伝子の明確なサイレンシングを導く筋芽細胞前駆細胞の細胞周期から永久出口から始まる特定の遺伝的プログラムによって調整されます。実際、最終分化のプロセスの間に、筋芽細胞の増殖停止は、骨格筋特異的遺伝子の発現と筋管2への筋芽細胞の融合の前に重要なステップです。このようなプログラムは、衛星細胞と呼ばれる成体筋幹細胞は、骨格筋損傷後の再生処理中に分化することが可能になります。
哺乳動物の筋形成は、筋原性塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスの家族に決定的に依存している（のbHLH）転写があるMyoD、Myf5の、MRF4とミオゲニン因子、頻繁に骨格筋決意因子またはのMRFの家族と呼ばれる（筋肉の調節因子）3。それらの各々は、本明細書及びDIFにおいて重要な役割を果たしています骨格筋細胞のferentiationと特異的発現パターン4 5-7ました。 Myf5のとのMyoDの活性化は、筋原系統に細胞をコミットする決定的なステップを構成し、ミオゲニンのその後の発現は、MCK（筋クレアチンキナーゼ）などの骨格筋特異的遺伝子の活性化と筋形成を誘発します。筋原性のbHLH転写因子は、以前にサイレント遺伝子座8から筋遺伝子の活性化におけるMEF2ファミリーのメンバーと協力します。彼らはまた、様々な遺伝子調節領域8に、いわゆるE-ボックスに結合するEタンパク質として知られているユビキタスのbHLHタンパク質とヘテロダイマー、E12とE47、などの骨格筋遺伝子の転写を刺激します。ねじれは、ID（分化の阻害剤）、および他の要因は、負8結合 Eタンパク質についてのMyoDと競合することによって、このプロセスを調節します。
MyoDのは、筋肉分化を誘発するの主要なプレーヤーとして考えられている9 </sそれは、多くの完全に分化した非筋肉系10-13に筋原決意/分化（トランス分化）プログラムを誘導する能力を有しているので>アップ。確かに、のMyoDの強制発現は、異なる細胞型のトランス分化を誘導する別の発生学的起源12から誘導されるものです。例えば、MyoDのは、筋様細胞に肝細胞、線維芽細胞、メラノサイト、神経芽細胞、および脂肪細胞に変換することができます。 MyoDのトランス分化作用は、元の遺伝的プログラム（特に、増殖遺伝子）のサイレンシングに付随する非筋肉環境での筋原性遺伝的プログラム（特にその標的遺伝子）の異常な活性化を伴います。
筋芽細胞の増殖では、MyoDのは発現するが、それはそれらのプロモーター14-16に結合する場合でも、その標的遺伝子を活性化することができませんされています。したがって、連続的に未分化の筋芽細胞で発現されるのMyoDの要件は非常にELUままSIVE。 MyoDのは、酵素14,17を改造クロマチンを活性化のロード前に増殖する筋芽細胞における抑圧的なクロマチン修飾酵素の補充のためにその標的遺伝子を抑制することができます。例えば、筋芽細胞増殖に、MyoDのは、ヒストンH3のリジン9またはH3K9とH3K27 KMTsなどの転写コリプレッサーKAP-1、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）と抑圧的なリジンメチルトランスフェラーゼ（KMTs）、関連付けられている、と積極的にその標的遺伝子の発現を抑制され、局所的に抑圧的なクロマチン構造14,17を確立することもできます。重要なことは、最近の報告では、MyoDのは、直接そのトランス活性16の阻害をもたらすH3K9 KMT G9Aによってメチル化自体であることが示されました。
MyoDによる非筋細胞のこのトランス分化に関与するエピジェネティックなメカニズムは不明な点が多いです。特に、いくつかの細胞株は、MyoDの誘導性のトランス分化に耐性です。このように、HeLa細胞では、MyoDのは、非アクティブかのいずれかでありますでもによる複雑なSWI / SNF 18クロマチン再構築のBAF60Cサブユニットの発現の欠如にリプレッサーではなく、転写活性化因子として機能する可能性があります。このモデルは、より良好MyoDの誘導性の遺伝子抑制機構を特徴づけるために選択されることができます。それに関連するパートナーとその標的遺伝子座で抑圧的なクロマチン環境を誘導し、したがって、最終分化を微調整する筋芽細胞の増殖でのMyoD依存抑圧的なメカニズムを明らかにするのMyoDの能力を検定することも好適です。
ここでは、質量分析（MS）特性評価に結合されたタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用してのMyoDパートナーを識別するためのプロトコルについて説明します。安定フラグ-HA-のMyoDを発現するHeLa-S3細胞の使用は、分別核抽出物からのMyoD複合体を精製するために十分な材料を入手することを許可しました。異種システムでのMyoDパートナーの同定はvalidatiが続きました関連するシステムで上。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法は、転写因子、のMyoDのパートナーの網羅的同定を可能にします。これは、MyoDの誘導性の分化、すなわちのHeLa-S3細胞に耐性異種システムでのMyoDパートナーを明らかにしました。したがって、定義により、識別されたのMyoDのパートナーは、遍在的に発現されています。これらは一般的かつ配列特異的な転写因子、クロマチン修飾酵素、RNA処理タンパク質キナーゼ（ 表1</st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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