Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Konstruktion af Modeller for destruktiv Forudsigelse af indholdsstof Indhold i Blåbær ved Near-infrarød spektroskopi Baseret på HPLC Målinger

Published: June 28, 2016 doi: 10.3791/53981
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3
1United Graduate School of Agricultural Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Institute of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology

Introduction

Nær-infrarød (NIR) spektroskopi er almindeligt anvendt som en destruktiv teknik til at analysere indholdet af frugt og grøntsager af forskellig art. 1,2 destruktiv analyser af NIR spektroskopi muliggøre forsendelse af kun lækre frugter og grøntsager med garanterede kvaliteter. NIR spektroskopi er allerede blevet anvendt til orange, æble, melon, kirsebær, kiwi, mango, papaya, fersken og så videre for at kende deres Brix, der svarer til det samlede sukkerindhold, syreindhold, TSC (i alt faststofindhold), og så videre . Vi har for nylig rapporteret anvendelsen af NIR-spektroskopi til kvalitetsvurdering af blåbær. 3 Vi målte ikke kun den samlede sukkerindhold og det totale indhold af organisk syre svarende til surhed, men også den samlede anthocyaninindhold. Anthocyanin er en bioaktiv komponent, som menes at forbedre menneskers sundhed. Det er bekvemt for forbrugerne, hvis de kan købe lækre blåbær med en garanti for deres indhold af sukker, acidity, og anthocyanin indhold.

I NIR absorptionsspektre af frugt og grøntsager, der kun brede absorptionsbånd observeret. De er først og fremmest de bands grundet fiber og fugt. Selv om mange svage bånd på grund af forskellige ingredienser i den ikke-destrueret mål observeres samtidigt, kan de observerede bånd ikke tildeles specifikke vibrations former for specifikke komponenter af målet i de fleste tilfælde. Derfor er den traditionelle teknik til at bestemme indholdet af en specifik komponent ved hjælp af Lambert-Beers lov ikke effektiv for NIR spektre. I stedet for at kalibreringsmodeller forudsige indholdet af målet komponenter fra de observerede spektre er konstrueret ved hjælp af kemometri ved at undersøge sammenhængen mellem den observerede spektre og ingrediens indhold svarende til spektre. 4,5 Her til en protokol konstruere og validere modellerne til forudsigelse af totale sukkerindhold, total organisk syre indhold svarende til ACIDIty, og alt anthocyanin indhold af blåbær fra NIR spektre præsenteres.

Figur 1 viser den generelle rutediagram til at konstruere pålidelige og robuste kalibreringsmodeller. Prøver af tilstrækkeligt antal opsamles. Nogle af dem er anvendt til konstruktion af modeller, mens de andre anvendes til validering af de konstruerede modeller. For hver af opsamlede prøver, er en NIR-spektrum målt, og derefter målet komponenter analyseres kvantitativt med traditionelle destruktive kemiske analysemetoder. Her er højtydende væskekromatografi (HPLC) anvendes til de kemiske analyser af sukkerarter, organiske syrer, og anthocyaniner. Delvis mindste kvadraters (PLS) regression anvendes til opførelse af kalibrering modeller, hvor sammenhængen mellem den observerede spektre og ingredienser indhold bestemt af kemiske analyser undersøges. For at konstruere robuste modeller med den bedste forudsigelse evne, de forbehandlinger af obseraba spektre og de bølgelængdeområder, der anvendes til forudsigelse er også undersøgt. Endelig er de konstruerede modeller valideret til at bekræfte deres tilstrækkelig forudsigelse evne. I valideringen, indholdet forudsagt fra det observerede spektrum af den beregnede model (forudsagte værdier) sammenlignes med indholdet bestemt af de kemiske analyser (observerede værdier). Hvis der ikke kan findes den tilstrækkelige sammenhæng mellem de forudsagte og observerede værdier, kalibreringen modellen skal være re-konstrueret, indtil der opnås den tilstrækkelige korrelation. Selv om det foretrækkes at anvende forskellige grupper af prøver til konstruktion og validering af en model, som vist i denne figur (ekstern validering), er prøver i en samme gruppe anvendes både til opførelse og validering (krydsvalidering), når antallet af prøver er ikke stort nok.

figur 1
Figur 1. Flow diagram for konstruktion og validering af kalibreringen model. De procedurer omgivet af blå og grønne linjer svarer henholdsvis til opførelse af en kalibrering model og dens validering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Indsamling af prøver

  1. Beslut hvilke sorter vil indgå i målet for kalibreringen model.
  2. Indsamle tilstrækkeligt antal og forskellige typer af prøve blåbær i målet sorter.
    1. Saml helst 100 blåbær til opførelse af kalibreringen model, og mindst 10 til validering af den beregnede model. For at konstruere robuste modeller, indsamle prøver af forskellige typer, dvs. med forskellige farver, størrelser og på forskellige modning betingelser.
  3. Vejes hver blåbær. Bemærk: Vægtene målte bruges senere til beregning af indholdet procent af ingredienser i hver blåbær.

2. Målinger af Spectra

  1. Warm-up spektrofotometeret tilstrækkeligt (mere end 1 time) før målingerne til at få pålidelig spektre.
  2. Indstil spektrofotometer. Sørg for, at betingelserne er konstante gennem hele målingerne. eneksempel på typiske betingelser for målinger er angivet nedenfor.
    1. Indstil række målinger til 12,500-3,600 cm-1.
    2. Indstil spektral opløsning til 16 cm-1.
    3. Indstil akkumulering til 32 gange.
  3. Vælg diffus reflektans som den tilstand af målingen.
  4. Sætte standard reflektor på vinduet af spektrofotometeret til diffus reflektans målinger. Ved at bruge kommandoen "baggrund enkelt kanal", måle baggrunden spektrum som automatisk bruges til beregning af relative reflektans spektre fra spektre af prøve blåbær målt senere.
  5. Løber blåbær prøve i midten af ​​vinduet af spektrofotometeret til diffus reflektans målinger. Ved at bruge kommandoen "prøve enkelt kanal", måle spektre af hver blåbær helst på flere punkter af frugten.
    Bemærk: Kubelka-Munk transformation 6,7 vil også udføres autotisk for den observerede spektre af prøve blåbær hvis betingelsen af ​​spektral erhvervelse er indstillet til det. Kubelka-Munk transformation ændrer spektre målt i diffus reflektans tilstand til spektrene svarer til dem målt i transmissionstilstand og der er behov for analyserne af spektre med høj nøjagtighed. Spectra i absorbans skala anvendes til analyser.
  6. Beregn den gennemsnitlige spektrum af spektre af hver prøve ved hjælp af et edb-program som MS Excel, hvis spektre af et blåbær prøve måles på flere punkter. Brug det gennemsnitlige frekvenser til analyser.

3. Forbehandling til HPLC Målinger af Sukker og organiske syrer 8

Bemærk: Uddrag sukkerarter og organiske syrer af hver blåbær, som er opløselige i vand, med ultrarent vand som følger. Hele hver blåbær anvendes til analyser.

  1. Hold blåbær i en fryser under -30 ° C klar for kemiske analyser, hvis de ikke analyseres umiddelbart efter de spektrale målinger.
  2. Skær en blåbær i flere stykker, så den let kan homogeniseres i de følgende trin. Skær blåbær uden afrimning, når det er frosset.
  3. Læg stykkerne i et 50 ml bægerglas.
  4. Tilføj ca. 10 ml ultrarent vand (destilleret vand, hvis elektriske ledningsevne er mindre end 0,1 uS / cm) til bægerglasset.
  5. Varm cut blåbær i ultrarent vand i en mikrobølgeovn i 20 sekunder for at deaktivere enzymerne, der kan spaltes sukkere under analyserne.
  6. Tilføj ca 10 ml ultrarent vand til bægerglasset.
  7. Homogenisere blandingen i 5 minutter ved 12.000 rpm med en homogenisator udstyret med en standard aksel og generator.
  8. Centrifugeres den homogeniserede blanding i 10 minutter ved 3.000 rpm (2.000 x g).
  9. Saml filtratet ved vakuumfiltrering af den centrifugerede prøve ved hjælp 5B papirfilter.
  10. Gentag trin 3,6-3,9 to gange på the filtrering rest at samle alle sukkerarter og organiske syrer, og kombinere alle filtrater.
  11. PH måles af filtratet og tilpasse det til 7 med fortyndet saltsyre (0,1 og 0,01 mol L-1) og fortyndede vandige opløsninger af natriumhydroxid (0,1 og 0,01 mol L-1).
  12. Fortynd filtratet til 50 ml med ultrarent vand.
  13. Opdel prøven i to; én til analyse af sukkerarter, og den anden til analyse af organiske syrer.
  14. Pass den første prøve løsning gennem søjler (to C18, CM og QMA) forbundet i serie for at udelukke pigmenter, kationer og anioner. Smid de første 1 ml af prøveopløsningen fra søjlerne. Brug derefter prøveopløsningen fra søjlerne til analyse af sukkerarter ved HPLC.
  15. Passerer det andet prøveopløsningen gennem søjler (to C18 og CM) forbundet i serie for at udelukke pigmenter og kationer. Smid de første 1 ml af prøveopløsningen fra søjlerne. Brug derefter prøveopløsningen fra columns til analyse af organiske syrer ved HPLC.
  16. Centrifuger hvert opløsning fra trin 3.14 og 3.15 ved 6.600 rpm (5.800 x g), i 10 minutter i et mikrorør udstyret med et 0,45 um filter med en mini-centrifuge før analysen ved HPLC.

4. HPLC Målinger af sukker

Bemærk: I denne undersøgelse er indholdet af saccharose, glucose og fructose af hver blåbær sum betragtes som det samlede indhold af sukker. Derfor er arbejdskurve for hver af tre sukkerarter fremstillet først, og derefter opnås indholdet af sukker i hver blåbær sum. Faste indhold er rapporteret som 0,3-0,4 vægt% (saccharose), 3,8 til 4,8 vægt% (glucose) og 4,2-5,3 vægt% (fructose). 9

  1. Mål omkring 200 mg saccharose præcist, og opløse den i 50 ml ultrarent vand til fremstilling af en standard løsning. Fortynd 5 ml af opløsningen til 50 ml med ultrarent vand til at forberede den anden standardløsninger. Forbered ligeledes den tredje standerard løsning fra den anden standardløsning.
  2. Fremstil opløsninger af glucose og fructose, på lignende måde.
  3. Arranger HPLC-systemet på følgende måde:
    1. Brug en gelpermeationssøjle i kolonnen ovn ved 40 ° C.
    2. Brug afgasset ultrarent vand med strømmen på 0,1 ml / min som eluatet.
    3. Brug en brydningsindeksdetektor.
  4. Mål HPLC spektrogrammerne af standardløsninger ved at indsprøjte en 20 pi portion for hver måling. Bemærk: Her PAC Solution bruges som software til måling.
  5. Få intensiteten område af båndet af sukker på kromatogrammet af hver standard løsning ved at klikke på 're-analyse "med den højre knap på musen.
  6. Plot intensiteterne område mod de tilsvarende koncentrationer for at få arbejdsmiljøet kurven for hver sukkerproducerende med den lineære regression, hvor ligningen repræsenterer forholdet mellem arealet intensitet og koncentration opnås for hver sukker.
  7. Mål HPLC spektrogrammerne af sample-løsninger ved at indsprøjte en 20 pi portion for hver måling.
  8. Få intensiteter område af bånd af sukker på kromatogrammet af hver prøveopløsning som tidligere beskrevet i trin 4.5.
  9. Opnå koncentrationerne af sukker i de løsninger ved hjælp af ligningerne svarende til de arbejdende kurver opnået i trin 4.6.
  10. Få størrelsen af ​​den enkelte sukker i hver blåbær fra koncentrationerne af prøveopløsningen opnået i det foregående trin, og det totale volumen af ​​prøveopløsningen (50 ml, se trin 3.12).
  11. Få de samlede sukker mængder af hver frugt som summen op indholdet af tre sukkerarter.
  12. Opnå indholdet procent af det samlede sukker af hver blåbær ved hjælp af vægten målt i trin 1.3.

5. HPLC Målinger af organiske syrer

Bemærk: I denne undersøgelse, indhold af citronsyre, quinasyre sum, æblesyresyre og ravsyre betragtes som det samlede syreindhold organisk. Derfor arbejder kurve for hver af fire organiske syrer fremstillet først, og derefter blev den organiske syre i hvert blåbær måles. Faste indhold er rapporteret som 0,42 til 0,62 vægt-% (citronsyre), 0-0,15 vægt-% (quinasyre), 0,08-0,23 vægt-% (æblesyre), og 0,06-0,25 vægt% (ravsyre). 9

  1. Mål ca. 5 mg citronsyre præcist, og opløse den i 50 ml ultrarent vand til fremstilling af en standard løsning. Fortynd 5 ml af opløsningen til 50 ml med ultrarent vand til at forberede den anden standardløsninger. Forbered tilsvarende den tredje standard løsning fra den anden standardløsning.
  2. Fremstil opløsninger af quinasyre, æblesyre og ravsyre, på lignende måde.
  3. Arranger HPLC-systemet på følgende måde:
    1. Brug to anion-bytningskolonner serieforbundet i kolonnen ovn ved 40 ° C.
    2. Brug afgasset 0,1% vandig opløsning af phosphorsyresyre med strømningshastigheden af ​​0,02 ml / min som eluatet.
    3. Brug en ultraviolet-synlig detektor sæt ved 210 nm.
  4. Mål HPLC spektrogrammerne af standardløsninger ved at indsprøjte en 20 pi alikvot af standard løsning for hver måling.
  5. Få intensiteten område af båndet af organisk syre på kromatogrammet af hver standard løsning ved at klikke på 're-analyse "med den højre knap på musen.
  6. Plot intensiteterne område mod de tilsvarende koncentrationer for at få arbejdsfluidet kurve for hver organisk syre ved den lineære regression, hvor ligningen repræsenterer forholdet mellem arealet intensitet og koncentrationen opnået for hver organisk syre.
  7. Mål HPLC spektrogrammerne af sample-løsninger ved at indsprøjte en 20 pi aliquot af prøven for hver måling.
  8. Få intensiteter område af bånd af organiske syrer på kromatogrammet af hver prøveopløsning som tidligere beskrevet i trin 5.5.
  9. Opnå koncentrationerne af de organiske syrer i opløsningerne ved hjælp af ligninger, der svarer til de arbejdende kurver opnået i trin 5.6.
  10. Opnå mængden af ​​hver organiske syre i hver blåbær af koncentrationen af ​​prøveopløsningen opnået i det foregående trin og det samlede volumen af ​​prøveopløsningen (50 ml, se trin 3.12).
  11. Opnå mængden af ​​total organisk syre i hvert blåbær ved at summere indholdet af de fire organiske syrer.
  12. Opnå indholdet procent af samlet organisk syre med hver blåbær ved hjælp af vægten målt i trin 1.3.

6. Forbehandling til HPLC Målinger af anthocyaniner

  1. Hold blåbær i en fryser under -80 ° C klar til kemiske analyser, hvis de ikke analyseres umiddelbart efter de spektrale målinger.
  2. Tør hver frosne frugt med et vakuum frysetørrer for 12 timer.
  3. Uddrag anthocyanin fra den tørrede blåbær i 1% methanol løsning of trifluoreddikesyre [vægt af blåbær (g) / volumen af ​​opløsningen (ml) = 1/10] ved at efterlade blandingen i et køleskab ved 4 ° C i 12 timer.
  4. Centrifuger ekstrakten i 15 minutter i en 2 ml mikrorør ved anvendelse af en ultracentrifuge ved -8 ° C og 15.000 rpm (21.900 x g).
  5. Filtrer ekstrakten gennem et 0,45 um filter for at få prøven til HPLC-målingerne.

7. HPLC Målinger af anthocyaniner

Bemærk: Omkring 13 slags anthocyaniner er inkluderet i blåbær. Da det er vanskeligt at få arbejder kurver for alle anthocyaniner, en arbejdskurve for kun cyanidin-3-O-glucosid chlorid, en af de mest populære anthocyaniner i blåbær, opnås. Arbejdsgruppen kurve anvendes til omtrentlige kvantificering af andre anthocyaniner.

  1. Måler omkring 1,5 mg cyanidin-3-O-glucosid chlorid nøjagtigt og opløse den i 10 ml 1% methanol opløsning af trifluoreddikesyre til Prepare en standardløsning. Fortynd 5 ml af opløsningen til 10 ml med 1% methanol opløsning af trifluoreddikesyre for at forberede den anden standardopløsninger. Tilsvarende forberede den tredje og den fjerde standardopløsninger sekventielt.
  2. Arranger HPLC-systemet på følgende måde:
    1. Brug en C18 omvendt fase-søjle i en kolonne ovn ved 40 ° C.
    2. Påfør gradient metoden under anvendelse af eluater af 0,1% vandig trifluoreddikesyre (eluerer A) og 0,5% trifluoreddikesyre i acetonitril (eluat B) med strømningshastigheden af ​​0,1 ml / min, hvor forholdet mellem eluering B stiger fra 8% til 15% under 0-50 min efter injektionen, og fra 15% til 75% i løbet af 50-60 minutter efter injektionen.
    3. Brug en fotodiodearraydetektor overvågning ved 520 nm.
  3. Mål HPLC spektrogrammerne af standardløsninger ved at injicere en 10 pi portion for hver måling. "LC Løsning" bruges som softwaren til målingen.
  4. Få intensiteten område af båndet afcyanidin-3-O-glucosid chlorid på kromatogrammet af hver standard løsning ved at klikke 're-analyse "med den højre knap på musen.
  5. Plot intensiteterne område mod de tilsvarende koncentrationer for at få arbejdsmiljøet kurven for cyanidin-3-O-glucosid chlorid med den lineære regression, hvor ligningen repræsenterer forholdet mellem området intensitet og koncentration opnås for cyanidin-3-O-glucosid chlorid.
  6. Mål HPLC spektrogrammerne af sample-løsninger ved at injicere en 10 pi portion for hver måling.
  7. Få intensiteten område af båndet af hver anthocyanin på kromatogrammet af hver prøveopløsning som tidligere beskrevet i trin 7.4.
  8. Opnå koncentrationerne af anthocyaniner i løsninger ved hjælp af ligningen svarer til den arbejdstid kurve opnået i trin 7.5.
  9. Opnå større mængder af hver anthocyanin i hver blåbær fra koncentrationen opnået i det foregåendetrin og det totale volumen af ​​prøveopløsningen der anvendes i trin 6.3.
  10. Opnå den samlede mængde af anthocyanin i hvert blåbær som summen op indholdet af de tretten anthocyaniner.
  11. Opnå indholdet procent af det samlede anthocyanin af hver blåbær ved hjælp af vægten målt i trin 1.3.

8. Konstruktion af kalibrering modeller til forudsigelse af indholdsstof Indhold

Bemærk: PLS regression, 4,5, som er en slags multipel regression, hvor der anvendes latente varianter, anvendes til konstruktion af kalibreringsmodeller for hver enkelt bestanddel fra den observerede spektre og ingrediensernes indholdet bestemt ved kemiske analyser. PLS regression udføres enten med de kommercielle programmer eller med hjemmelavede programmer. Se referencer 5,10 for de detaljerede processer i konstruktionen af modeller.

  1. Undersøg hvilke forbehandlinger for observerede spektre er mest effektive til præcis ogrobust forudsigelse.
    1. Konstruér kalibrering modeller ved anvendelse af en eller to af følgende forbehandlinger: MSC (Multiplicative Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisering), COE (Constant Offset Elimination ), og den første eller den anden afledede beregning af SG (Savitzky-Golay) metode. 1,2,5 Forudsige ingrediens indholdet i valideringen sæt fra deres spektre med de konstruerede modeller.
      Bemærk: I MMN, et spektrum er normaliseret, således at minimum og maksimum værdier bliver 0 og 1 hhv. I COE, er ordinaten af ​​et spektrum forskudt således, at den mindste værdi bliver nul.
    2. Beregn determinationskoefficienten, R2, og resterende prædiktiv afvigelse, RPD, mellem den observerede og forudsagte værdier af valideringen indstillet til at undersøge, hvilke forbehandlinger observerede spektre er mest effektive. Vælg kombinationen af ​​forbehandlinger giver størreR2 og RPD.
  2. Undersøg hvilke bølgetalsområdet regioner er effektive til nøjagtig og robust forudsigelse ved at anvende for eksempel bevægelige-vinduer PLS teknik 11 at søge de effektive regioner.
    Bemærk: Proceduren svarer til at fjerne bølgetalsområdet regioner, hvor spektre indeholder nogen effektiv information til forudsigelser eller indeholder oplysninger, der forstyrrer forudsigelser.

9. Validering af den beregnede Kalibrering Modeller

Bemærk: Se referencer 5,10 for de detaljerede processer i validering af konstruerede modeller.

  1. Forudsige ingrediens indhold valideringen sæt fra deres spektre med de konstruerede kalibrering modeller med den bedste kombination af forbehandlinger og for bølgetalsområdet regioner effektive til forudsigelse. 5,10
  2. Beregn R2 og RPD mellem den observerede og forudsagteværdier af valideringen sæt. 5,10
  3. Undersøg, om de generelle kriterier for den praktiske udførelse af kalibrering modeller, 12,13 R2> 0,85 og RPD> 2.5, er opfyldt. Overvej genopbygningen af ​​modellen, hvis kriterierne ikke er opfyldt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser som eksempel et sæt af NIR absorptionsspektre af blåbær hvor spektre af 70 blåbær er vist samtidigt. Da båndene absolut assignes til sukkerarter, organiske syrer, eller anthocyaniner ikke overholdes i NIR spektre, traditionelle Lambert-Beers lov gælder ikke for kvantificere ingrediens indhold. Derfor er konstruktionen af ​​modeller til forudsigelse af ingredienser indhold er nødvendig.

Figur 3 viser typiske kromatogrammer for kvantitativ analyse af sukker i blåbær. Tre paneler fra toppen er henholdsvis de kromatogrammer af standardløsninger af saccharose, glucose og fruktose. Det nederste panel viser et kromatogram af en prøveopløsning, dvs. ekstrakt af en blåbær. Den slags og koncentrationer af sukker i prøveopløsningen kendes fra retentionstiderne ennd intensiteten området af de observerede toppe. Totale sukkerindhold opnås som summen af ​​saccharose, glucose, fructose og indhold.

Figur 4 viser et eksempel på kromatogrammet til analyse af organiske syrer i en blåbær. Ved at henvise til kromatogrammerne af standardopløsningen (ikke vist her), er arten og koncentrationen af ​​organiske syrer i prøveopløsningen kendt. For tildelinger af de observerede toppe vist i figuren legenden, er to toppe observeres for quinasyre i kromatogrammer af standard og prøve løsninger. De kan være overdrages til isomerer af quinasyre. Samlet organisk syreindhold opnås som summen af ​​citronsyre, quinasyre, æblesyre og ravsyre syreindholdet.

Figur 5 viser et eksempel på kromatogrammet til analyse af anthocyaniner i et blåbær. Mange toppe svarende til Forskelnt slags anthocyaniner overholdes. Da rækkefølgen af elusion for disse anthocyaniner blev rapporteret 14,15 som vist i tabel 1, kan de observerede toppe tildeles individuelle anthocyaniner. Totalt anthocyaninindhold opnås som summen af ​​indholdet af 13 typer af anthocyaniner.

Kalibreringsmodeller er konstrueret af den observerede spektre og de ​​kemisk bestemt ingrediens indhold. Tabel 2 viser et eksempel på behandlingen af forbehandlinger. Seks typen forbehandlinger, herunder "ingen (uden forbehandling)" blev undersøgt for opførelsen af kalibreringen model af det samlede sukkerindhold hjælp spektre til en fast bølgetal region 12,500-3,600 cm-1. Forskellige forbehandlinger resultere i forskellige forudsigelse forestillinger. Forestillinger af modellerne blev evalueret med R2 og RPD. Den type forbehandlinger, der giver den bedste Prediktion ydeevne er valgt. I tabel 2 "Anden derivat + MSC", hvilket betyder MSC efter den anden afledede beregning, giver de bedste resultater. Så bølgetalsområdet regioner, der anvendes til model byggeri undersøges ved at variere regionerne med de faste forbehandlinger.

Figur 6 viser som et eksempel et resultat af cross validering af kalibreringen model for totale sukkerindhold, hvor sammenhængen mellem de forventede værdier NIR spektroskopi, og dem, bestemt ved HPLC vises. Modellen blev konstrueret med "den anden afledede + MSC" som forbehandlinger og under anvendelse af de 8,539-7,775 cm-1 regionen af spektre. Forudsigelsen ydeevne i modellen er R2 = 0,85 og RPD = 2,6, lige over for den praktiske anvendelse. I dette eksempel er antallet af prøver, der anvendes til model konstruktion var 30, som er for lille til construct højtydende modeller.

Figur 7 viser som et eksempel et resultat af korset validering af kalibreringen model for total syre indhold af organisk, hvor sammenhængen mellem de forventede værdier NIR spektroskopi, og dem, bestemt ved HPLC vises. Modellen blev konstrueret med "den første afledede + MSC" som forbehandlinger og bruge 7,505-5,446 og 4,605-4,242 cm-1 regioner af spektrene. Den forudsigelse ydeevne i modellen er R2 = 0,92 og RPD = 3,6, som er tilstrækkelige til den praktiske anvendelse.

Figur 8 viser som et eksempel på grund af den eksterne validering af kalibreringen model for total anthocyanin indhold, med sammenhængen mellem de forventede værdier NIR spektroskopi, og dem, bestemt ved HPLC. Modellen blev konstrueret med "den første derivative "som forbehandling og bruge 12,489-6,094 og 4,605-4,242 cm -1 regioner spektre. Den forudsigelse udførelsen af modellen er R2 = 0,95 og RPD = 4,4, hvilket viser forholdsvis gode resultater af den beregnede model. Da anthocyanin eksisterer hovedsageligt i skaller af blåbær, er det let observeret med diffus reflektans målinger selv om dens indhold i en blåbær er ikke høj. den gode resultater er vist i figur 8 ville være også forårsaget af det store antal prøver (70), der anvendes til model byggeri .

Figur 2
Figur 2. NIR absorptionsspektre af blåbær. Spectra 70 blåbær vises samtidigt. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3. kromatogrammer for kvantitativ analyse af sukker i blåbær. Kromatogrammer af standardopløsninger af (A) saccharose, (B) glukose, (C) fruktose, og (D) et kromatogram af en prøveopløsning. Klik her for et større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4. kromatogram til kvantitativ analyse af organiske syrer i en blåbær. Observerede toppe svarer til citronsyre (1), æblesyre (2), quininsyre (0 og 3), og ravsyre (4). Please klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Kromatogram til kvantitativ analyse af anthocyaniner i et blåbær. De observerede toppe tildeles individuelle anthocyaniner anført i tabel 1, hvor standard opholdstid for hver anthocyanin er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Et resultat af grænseoverskridende validering af modellen for totale sukkerindhold. De forventede værdier NIR spektroskopi plottes mod dem bestemt ved HPLC. R 2 = 0,85 og RPD = opnås 2,6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Et resultat af grænseoverskridende validering af modellen for total syre indhold af organisk. De forventede værdier NIR spektroskopi plottes mod dem bestemt ved HPLC. R 2 = 0,92 og RPD = 3,6 opnås. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Et resultat af ekstern validering af modellen for total anthocyanin indhold. De forventede værdier NIR spektroskopi plottes mod dem determined ved HPLC. R 2 = 0,95 og RPD = 4,4 opnås. Klik her for at se en større version af dette tal.

Formel anthocyanin Repræsentative Retentionstid (min)
C 21 H 21 O 12 Delphinidin-3-O -galactoside 17.3
C 21 H 21 O 12 Delphinidin-3-O-glucosid 19.7
C 21 H 21 O 11 Cyanidin-3-O -galactoside 22.8
C 20 H 19 O 11 Delphinidin-3- 23,6
C 21 H 21 O 11 Cyanidin-3-O-glucosid 24.5
C 22 H 23 O 12 Petunidin-3-O -galactoside 28,7
C 20 H 19 O 10 Cyanidin-3-O -arabinoside 31,3
C 22 H 23 O 12 Petunidin-3-O-glucosid 36,0
C 22 H 23 O 11 Peonidin-3-O -galactoside 37,0
C 21 H 21 O 11 Petunidin-3-O -arabinoside 40.8
C 22 H 23 O 11 Peonidin-3-O-glucosid 43,7
C23 H 25 O 12 Malvidin-3-O -galactoside 45,0
C 23 H 25 O 12 Malvidin-3-O-glucosid 49,6

Tabel 1. Større anthocyaniner indeholdt i blåbær. De repræsentative retentionstider i HPLC-analysen under de nuværende eksperimentelle betingelser er også angivet.

forbehandling Bølgetal region anvendes til analyse (cm-1) RPD R2
Ingen 12,500-3,600 1.7 0,69
anden afledede 12,500-3,600 2.6
første afledede 12,500-3,600 2.5 0,84
MSC 12,500-3,600 2.3 0,81
Anden afledede + MSC 12,500-3,600 2.8 0,88
Første afledede + MSC 12,500-3,600 2.7 0,87

Tabel 2. En undersøgelse af afhængigheden af forudsigelse præstationer på forbehandlinger af den observerede spektre. R2 og RPD til forudsigelse af totale sukkerindhold er angivet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nogle yderligere bemærkninger til protokollen er beskrevet her. For det første i trin 1.1, nævnes det at beslutte de sorter, der indgår i målet. Selv om det er muligt at konstruere modeller, der dækker blåbær fra mange sorter eller uden at angive sorter, de forudsigelse nøjagtighed med modellerne er nogle gange meget lavere end dem med de modeller for en enkelt sort og for begrænsede sorter. Det skal også bemærkes, at de kalibreringsmodeller skal konstrueres for blåbær fra hvert produktionssted for at få høj forudsigelse resultater, fordi blåbær høstet på forskellige produktionssteder har forskellige egenskaber, som påvirker forudsigelse ydeevne. 1

For det andet i trin 2.3, nævnes det at vælge den diffuse reflektans mode for målingerne af spektre. Transmissionen mode er også forberedt til målinger på spektrofotometer. Selvom spektre målt i transmissionen tilstand er enLSO rådighed til opførelse af kalibreringsmodeller, kan mere nøjagtige og mere robuste modeller konstrueres med spektrene målt i diffus reflektans tilstand i de fleste tilfælde. De samlede organiske syreindholdet ikke kan forudsiges med spektrene målt i transmittansen tilstand. 3

For det tredje, for målingerne af spektre af blåbær, er det ikke anbefales at måle spektre ved bægeret siden overfladebeskaffenhed og indholdet omkring bæger er forskellige fra dem i andre positioner. Alligevel er det muligt at konstruere kalibreringsmodeller ved anvendelse af en rigelig antal spektre målt ved både Bægeret og andre positioner. Imidlertid nøjagtighed af modellerne er i de fleste tilfælde lavere end de modeller konstrueret med spektrene kun måles på andre steder end blomsterbægeret positioner.

For det fjerde et NIR-spektrum af blåbær afhænger af temperaturen. Derfor, for præcis forudsigelse enten det er imtigt at altid måle spektre på samme omgivelsestemperatur eller at konstruere kalibrering modeller med kompensation for temperaturudsving. 1

For det femte, selv om kun R2 og RPD bruges til at vælge de forbehandlinger og vurdere effektiviteten af konstruerede modeller her, nogle andre værdier som SEC (Standard Error of Calibration) SEP (Standard Error of Prediction), SECV (Standard Error of Cross Validering), er RMSEP (Root Mean Square error af forudsigelse), og RMSECV (Root Mean Square fejl Cross-validering) normalt bruges til nærmere undersøgelse. I vores tidligere papir, 3 for eksempel RMSEP og RMSECV blev brugt til at vælge forbehandlinger og vurdere effektiviteten af konstruerede modeller.

Destruktiv forudsigelse af total sukker, total organisk syre, og den samlede anthocyanin indholdet i en blåbær var found at være muligt, hvis de modeller for forudsigelser er konstrueret korrekt. Denne teknik kan anvendes til udvælgelse af kun lækre blåbær fra alle høstede dem, som ikke kan opnås med andre traditionelle analytiske teknikker. 8,9 Selv om procedurerne for de kemiske analyser kan virke komplicerede, er de medtaget i populære analytiske teknikker og er ikke ledsaget af store vanskeligheder. Det er vigtigt at få nøjagtige resultater for de kemiske analyser, fordi resultaterne er grundlaget for den beregnede model. I denne undersøgelse RSD (relativ standardafvigelse) af de HPLC-målingerne var omkring 1%. Det er også nødvendigt at følge den grundlæggende procedure, fx som vist i figur 1, til opførelse af praktisk anvendelige modeller.

kan anvendes Simple og hurtige metoder i stedet for HPLC for de kemiske analyser. Samlet sukker og syre kan måles henholdsvis med et refraktometer(Brix meter) og et pH-meter. PH differensmetoden 16,17 anvendes til måling af den samlede anthocyanin indhold. Anvendelse af de simple metoder gør konstruktionen af ​​modeller meget lettere selv nøjagtigheden af ​​forventede værdier modellerne kan være lavere end forudsagt af modellerne beregnet på grundlag af de HPLC-målingerne er vist her. Ikke desto mindre kan nøjagtigheden af ​​de modeller bygget på basis af simple kemiske analyser være praktisk anvendelig på produktionssteder og cirkulation processer fordi høje nøjagtigheder ikke altid behov for der. Metoderne til de kemiske analyser, derfor bør vælges efter de nøjagtigheder er nødvendige for de modeller, der skal bygges.

Selv om nogle frugter som æble og appelsin sælges generelt med garanteret sukkerindhold og syrer, har blåbær ikke er blevet solgt med garanti kvaliteter. Som et resultat, at kvaliteten af ​​de kommercielle blåbær gørikke synes stabil i det mindste i Japan; undertiden blåbær lav kvalitet sælges på markeder. forventes De destruktive analysemetoder ved NIR-spektroskopi vist her for at aktivere, i princippet, forsendelsen og salg af blåbær med garanteret kvaliteter.

Endelig er der begrænsninger for denne metode. For det første, som nævnt ovenfor, opførelsen af ​​modeller er temmelig besværlig. Desuden bør forudsigelse model konstrueres for hvert sted og hvert dyrkningsår fordi forskellen i mængderne af sameksisterende komponenter (som afhænger af stedet og dyrkningsår) påvirker præcisionen af ​​forudsigelsen. Derfor er der behov en vis indsats for vedligeholdelse af prognosemodeller. For det andet, selv om vi har vist, at nær infrarød spektroskopi er i princippet gælder for kvalitetskontrol af blåbær, det udstyr og teknikker her viste kun anvendes i laboratoriet og ikke gældende på produktionssteder væreforårsage en hurtig kontrol af de store mængder af bær på produktionssteder er umuligt. Praktisk udvikling af egnet udstyr og udvikling af robuste kalibrering modeller er egnede til brug i produktionssteder og cirkulation processer er fremtidige retninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FT-NIR spectrophotometer Bruker Optics GmbH MPA 
High-Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 For sugar analysis
223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 Refractive Index Detector
High-Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 For organic acid analysis
228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 Ultraviolet-Visible Detector
High-Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 For anthocyanin analysis
228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 Photodiode Array Detector
228-45009-31
pH meter Mettler-Toledo 30019028 S220, Automatic temperature compensation
Ultra-pure water treatment equipment ORGANO Corporation ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 PURELAB ultra; PURELITE
Biomedical Freezers  SANYO 2-6780-01 MDF-U338
Ultra-Low Temperature Freezer Panasonic healthcare Co.,Ltd. KM-DU73Y1 -80 °C
Vacuum lyophilizer IWAKI GLASS Co.,Ltd 119770 DRC-3L; FRD-82M
Homoginizer Microtec Co., Ltd.  Physcotron
Ultracentrifuge Hitachi Koki Co.,Ltd S204567 CF15RXII
Mini-centrifuge LMS CO.,LTD. KN3136572 MCF-2360
Centrifuge Kokusan Co.,Ltd 2-5534-01 H-103N
Filter Paper  Advantec 1521070 5B, Eqivalent to Whatman 40
Sep-Pak C18 column Waters Corporation Milford WAT020515
Sep-Pak CM column Waters Corporation Milford WAT020550
Sep-Pak QMA column Waters Corporation Milford WAT020545
Centrifugal Filter Unit Merck Millipore Corporation R2SA18503 PVDF, 0.45 μm
Microtube As One Corporation 1-1600-02 PP, 2 ml
Syringe Filter GE Healthcare CO.,LTD. 6788-1304 PP, 0.45 μm
Sucrose Wako Pure Chemical Industries,Ltd 194-00011 Reagent-grade
Glucose Wako Pure Chemical Industries,Ltd 049-31165 Reagent-grade
Fructose Wako Pure Chemical Industries,Ltd 123-02762 Reagent-grade
Citric acid Wako Pure Chemical Industries,Ltd 036-05522 Reagent-grade
Malic acid Wako Pure Chemical Industries,Ltd 355-17971 Reagent-grade
Succinic acid  Wako Pure Chemical Industries,Ltd 190-04332 Reagent-grade
Quinic acid Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company 10176328 Reagent-grade
Phosphoric acid Wako Pure Chemical Industries,Ltd 162-20492 HPLC-grade
Trifluoroacetic acid Wako Pure Chemical Industries,Ltd 208-02746 Reagent-grade
Methanol Wako Pure Chemical Industries,Ltd 131-01826 Reagent-grade
Acetonitrile Wako Pure Chemical Industries,Ltd 015-08633 HPLC-grade
Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride Wako Pure Chemical Industries,Ltd 306-37661 HPLC-grade
Software for analyses Bruker Optics GmbH OPUS ver. 6.5
Softoware for preprocessing Microsoft Excel powered by Visual Basic for Applications
Software for construction of models Freemat 4.0 http://freemat.sourceforge.net/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
  2. Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
  3. Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
  4. Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
  5. Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
  6. Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
  7. Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
  8. Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
  9. Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
  10. Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
  11. Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
  12. Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
  13. Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
  14. Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
  15. Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
  16. Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
  17. Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).

Tags

Kemi Analytical Chemistry Blueberry Nær-infrarød spektroskopi sukker Organic Acid Antocyanin Kemometri Partial Least Squares (PLS) Regression HPLC
Konstruktion af Modeller for destruktiv Forudsigelse af indholdsstof Indhold i Blåbær ved Near-infrarød spektroskopi Baseret på HPLC Målinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi,… More

Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M., Che, J., Horiuchi, N., Ogiwara, I. Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements. J. Vis. Exp. (112), e53981, doi:10.3791/53981 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter