Introduction
Nær-infrarød (NIR) spektroskopi er mye brukt som en ikke-destruktiv metode for å analysere innholdet i frukt og grønnsaker av ulike slag. 1,2 destruktiv analyser av NIR-spektroskopi aktivere frakt av bare deilig frukt og grønnsaker med garantert kvaliteter. NIR-spektroskopi har allerede blitt brukt på appelsin, eple, melon, kirsebær, kiwi, mango, papaya, fersken og så videre for å kjenne deres Brix som svarer til det totale sukkerinnhold, surhet, TSC (totalt faststoffinnhold), og så videre . Nylig har vi rapporterte anvendelse av NIR-spektroskopi til kvaliteten evalueringen av blåbær. 3 Vi målte ikke bare den totale sukkerinnholdet og det samlede innhold av organisk syre svarende til surhet, men også den totale anthocyanin innhold. Antocyaner er en bioaktiv komponent som antas å øke menneskers helse. Det er praktisk for forbrukerne hvis de kan kjøpe deilige blåbær med en garanti for deres sukkerinnhold, acidity, og anthocyanin innhold.
I NIR absorpsjon spektra av frukt og grønnsaker, er det bare brede absorpsjon band observert. De er hovedsakelig båndene på grunn av fiber og fuktighet. Selv om mange svake bånd på grunn av ulike ingredienser av ikke-destrueres målet er observert samtidig, kan de observerte band ikke skal tilordnes bestemte vibrasjonen moduser av bestemte komponenter i målet i de fleste tilfeller. Derfor er den tradisjonelle teknikken for å bestemme innholdet av en spesifikk komponent ved hjelp av Lambert-Beer 's lov er ikke effektiv for NIR-spektra. I stedet kalibreringsmodeller til å forutsi innholdet av målet komponenter fra de observerte spektra er konstruert ved å bruke kjemometriske ved å undersøke korrelasjonen mellom den observerte spektra og ingrediensinnhold som tilsvarer spektrene. 4,5 her, til en protokoll konstruere og validere modellene for forutsigelse av det totale sukkerinnhold, totalt organisk syreinnhold svarende til acidity, og total anthocyanin innhold av blåbær fra NIR-spektra er presentert.
Figur 1 viser den generelle flytdiagram for å konstruere pålitelige og robuste kalibreringsmodeller. Prøver av tilstrekkelig antall er samlet. Noen av dem er brukt til bygging av modeller, mens de andre blir brukt for validering av de konstruerte modeller. For hver av prøvene som er samlet, er en NIR-spektrum målt, og deretter målet komponentene analyseres kvantitativt med tradisjonelle ødeleggende kjemiske analysemetoder. Her er væskekromatografi (HPLC) som brukes for de kjemiske analysene av sukker, organiske syrer, og anthocyaniner. Partial Least Squares (PLS) regresjon benyttes for konstruksjon av kalibreringsmodeller hvor korrelasjonen mellom den observerte spektra og ingrediensinnholdet bestemt ved kjemiske analyser som er undersøkt. For å konstruere robuste modeller med den beste prediksjonsevne, de forbehandlinger av dialektikkenVed spektra og de bølgelengdeområdene som brukes for forutsigelsen er også undersøkt. Endelig er de konstruerte modeller validert for å bekrefte deres tilstrekkelig prediksjonsevne. I valideringen, innholdet forutsagt fra den observerte spektrum av den konstruerte modell (forutsagte verdier) blir sammenlignet med innholdet bestemmes av de kjemiske analyser (observerte verdier). Dersom tilstrekkelig korrelasjon ikke kan finnes mellom de forutsagte og observerte verdier, kalibreringsmodellen skal rekonstrueres inntil tilstrekkelig korrelasjon oppnås. Selv om det er foretrukket å bruke forskjellige grupper av prøver for konstruksjon og validering av en modell som er vist på denne figur (ekstern validerings) blir prøver i samme gruppe som brukes både for konstruksjon og validerings (kryss-validering) når antall prøvene er ikke stor nok.
Figur 1. Flytskjema for konstruksjon og validering av kalibreringsmodellen. Prosedyrene omgitt av blå og grønne linjer tilsvarer henholdsvis til bygging av en kalibreringsmodell og dens validering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Innsamling av prøver
- Bestem hvilke sorter vil inngå i målet for kalibreringsmodellen.
- Samle tilstrekkelig antall og ulike typer prøve blåbær av målet sortar.
- Samle fortrinnsvis 100 blåbær for bygging av kalibreringsmodellen, og minst 10 for validering av den konstruerte modellen. For å konstruere robuste modeller, samle inn prøver av forskjellige typer, dvs. med ulike farger, størrelser, og i ulike modne forhold.
- Vei hver blåbær. Merk: Vektene målte brukes senere for beregning av innhold prosent av innholdsstoffene i hvert blåbær.
2. Målinger av Spectra
- Warm-up spektrofotometeret tilstrekkelig (mer enn 1 time) før målingene for å få pålitelig spektra.
- Sett spektrofotometer. Pass på at forholdene er konstant gjennom hele målingene. eneksempel på typiske betingelser for måling er gitt nedenfor.
- Sett rekke målinger for å 12,500-3,600 cm -1.
- Sett spektral oppløsning til 16 cm -1.
- Sett opphopning 32 ganger.
- Velge diffuse refleksjon som modus for måling.
- Sett standard reflektor på vinduet av spektrofotometer for diffuse refleksjonsmålinger. Ved å bruke "enkelt kanal bakgrunn" -kommandoen, måle bakgrunnen spektrum som brukes automatisk for beregning av relativ reflektansspektra fra spektra av prøven blåbær målt senere.
- Sett en blåbær prøven i midten av vinduet av spektrofotometer for diffuse refleksjonsmålinger. Ved å bruke "sample enkelt kanal" -kommandoen, måle spektra av hver blåbær helst på flere punkter av frukten.
Merk: Kubelka-Munk transformasjon 6,7 vil også bli utført automatisktisk for den observerte spektra av utvalgs blåbær hvis tilstanden spektral oppkjøpet er satt til å gjøre det. Kubelka-Munk-transformasjonen endrer spektra målt i den diffuse refleksjon modus til spektrene tilsvarer de som er målt i transmisjonsmodus og er nødvendig for analysen av spektra med høy nøyaktighet. Spektra i absorbansen målestokk benyttes for analyser. - Beregne gjennomsnittlig spektrum av spektrene til hver prøve ved å bruke et databehandlingsprogram som for eksempel Microsoft Excel om spektra av en blåbær prøve måles på flere punkter. Bruk gjennomsnitt spekteret for analyser.
3. Forbehandling for HPLC Målinger av sukker og organiske syrer 8
Merk: Pakk sukkerarter og organiske syrer for hver blåbær, som er oppløselige i vann, med ultrarent vann som følger. Hele blåbær hver benyttes for analyser.
- Hold blåbær i en fryser under -30 ° C klar for kjemiske analyser hvis de ikke blir analysert like etter de spektrale målinger.
- Skjær et blåbær i flere biter slik at den lett kan homogenisert i følgende trinn. Skjær blåbær uten avriming når det er frosset.
- Sett bitene i et 50 ml begerglass.
- Legg ca. 10 ml ultrarent vann (destillert vann hvis elektriske ledningsevne er mindre enn 0,1 uS / cm) til begerglasset.
- Varm opp snitt blåbær i ultrarent vann i en mikrobølgeovn i 20 sekunder for å deaktivere enzymer som kan spaltes sukker i løpet av analysen.
- Legg til ca. 10 ml ultrarent vann til begerglasset.
- Homogenisere blandingen i 5 min ved 12 000 rpm med en homogenisator utstyrt med en standard aksel og generatoren.
- Sentrifuger den homogeniserte blandingen i 10 minutter ved 3000 rpm (2000 x g).
- Samle filtratet ved vakuumfiltrering av den sentrifugerte prøven ved bruk av en 5B papirfilter.
- Gjenta trinn 3,6-3,9 to ganger på the filtrering rest å samle alle sukker og organiske syrer, og kombinere alle filtratene.
- Måling av pH på filtratet og justere den til 7 med fortynnet saltsyre (0,1 og 0,01 mol L-1), og fortynnede vandige oppløsninger av natriumhydroksyd (0,1 og 0,01 mol L-1).
- Fortynn filtratet til 50 ml med ultrarent vann.
- Del prøven i to; en for analyse av sukker og den annen for analyse av organiske syrer.
- Passere den første prøveoppløsningen gjennom kolonner (to C18, CM og QMA) som er koblet i serie for å utelukke pigmenter, kationer og anioner. Kast de første 1 ml av prøveoppløsningen fra kolonnene. Deretter bruker prøveløsningen fra kolonnene for analyse av sukker ved hjelp av HPLC.
- Passere den andre prøveoppløsningen gjennom kolonner (to C18 og CM) som er koblet i serie for å utelukke pigmenter og kationer. Kast de første 1 ml av prøveoppløsningen fra kolonnene. Deretter bruker prøveløsningen fra columns for analyse av organiske syrer ved hjelp av HPLC.
- Sentrifuger hver oppløsning fra trinn 3,14 og 3,15 ved 6600 rpm (5800 x g), i 10 minutter i en microtube er utstyrt med et 0,45 um filter med en mini-sentrifuge før analyse ved HPLC.
4. HPLC Målinger av Sugars
Merk: I denne studien, er summen innhold av sukrose, glukose og fruktose i hver blåbær betraktes som det totale sukkerinnhold. Derfor er arbeidskurven for hver av de tre sukkere oppnås først, og deretter summen innhold av sukkerarter i hvert blåbær oppnås. Standard-innhold er angitt som 0,3-0,4 vekt% (sukrose), 3,8 til 4,8 vekt% (glukose), og 4,2 til 5,3 vekt% (fruktose). 9
- Måle ca 200 mg sukrose nøyaktig, og oppløse den i 50 ml ultrarent vann for å fremstille en standardløsning. Fortynn 5 ml av oppløsningen til 50 ml med ultrarent vann for å fremstille de andre standardløsninger. Forbered tilsvarende den tredje standenard oppløsning fra den andre standardløsningen.
- Fremstille standardoppløsninger av glukose og fruktose, på samme måte.
- Ordne HPLC-systemet som følger:
- Bruke en gelpermeabilitetskolonne i kolonne ovnen den ved 40 ° C.
- Bruk avgasset ultrarent vann med strømningshastighet på 0,1 ml / min som eluatet.
- Bruke en brytningsindeksdetektor.
- Måle HPLC-spektrogrammene av standardløsninger ved å injisere en 20 ul alikvot for hver måling. Merk: Her blir PAC Solution brukes som programvare for målingen.
- Få området intensiteten av bandet av sukker på kromatogrammet av hver standardløsning ved å klikke "re-analyse" med høyre museknapp.
- Plotte området intensitetene mot de tilsvarende konsentrasjoner for å få arbeidskurven for hvert sukker ved lineær regresjon, hvor ligningen som representerer forholdet mellom området intensitet og konsentrasjonen blir oppnådd for hver sukker.
- Måle HPLC-spektrogrammene av prøveoppløsninger ved å injisere en 20 ul alikvot for hver måling.
- Få området intensiteter av band av sukkere på kromatogrammet av hver prøveoppløsning som tidligere er beskrevet i trinn 4,5.
- Oppnå de konsentrasjoner av sukker i oppløsningene ved hjelp av de likninger som svarer til de arbeidskurver oppnådd i trinn 4.6.
- Oppnå mengden av hvert sukker i hver blåbær fra konsentrasjonene av prøveoppløsningen oppnådd i det foregående trinn, og det totale volum av prøveoppløsning (50 ml, se trinn 3.12).
- Skaff den totale sukker mengder av hver frukt ved å summere opp innholdet i tre sukker.
- Innhente innholdet prosent av den totale sukker for hver blåbær ved hjelp av vekt målt i trinn 1,3.
5. HPLC Målinger av organiske syrer
Merk: I denne studie, sum innhold av sitronsyre, kininsyre, eplesyre og ravsyre anses som det totale innhold av organisk syre. Derfor arbeider kurve for hver av de fire organiske syrer oppnås først, og deretter ble det organiske syreinnhold i hver blåbær blir målt. Standard-innhold er angitt som 0,42 til 0,62 vekt% (sitronsyre), 0 til 0,15 vekt% (kininsyre), 0,08 til 0,23 vekt% (eplesyre), og 0,06 til 0,25 vekt% (succinsyre). 9
- Måler omtrent 5 mg sitronsyre nøyaktig, og oppløse det i 50 ml ultrarent vann for å fremstille en standardløsning. Fortynn 5 ml av oppløsningen til 50 ml med ultrarent vann for å fremstille de andre standardløsninger. Fremstille på samme måte den tredje standardoppløsning fra det andre standardløsningen.
- Fremstille de vanlige oppløsninger av kininsyre, eplesyre og ravsyre, på samme måte.
- Ordne HPLC-systemet som følger:
- Bruk to anion-utvekslingskolonner koblet i serie i kolonne ovnen den ved 40 ° C.
- Bruk avgasset 0,1% vandig oppløsning av fosforsyre med den strømningshastighet på 0,02 ml / min som eluatet.
- Bruk en ultrafiolett-synlig detektor innstilt på 210 nm.
- Måle HPLC-spektrogrammene av standardløsninger ved å injisere en 20 ul alikvot av standardløsning for hver måling.
- Få området intensiteten av bandet av organisk syre på kromatogrammet av hver standardløsning ved å klikke "re-analyse" med høyre museknapp.
- Plotte området intensitetene mot de tilsvarende konsentrasjoner for å få arbeidskurven for hver enkelt organisk syre ved lineær regresjon, hvor ligningen som representerer forholdet mellom området intensitet og konsentrasjonen er oppnådd for hver organisk syre.
- Måle HPLC-spektrogrammene av prøveoppløsninger ved å injisere en 20 ul alikvot av prøven for hver måling.
- Få området intensiteter av båndene av organiske syrer på kromatogrammet av hver prøveoppløsning som beskrevet tidligere i trinn 5.5.
- Oppnå konsentrasjonene av de organiske syrer i oppløsningene ved hjelp av ligninger som svarer til de arbeidskurver oppnådd i trinn 5.6.
- Oppnå mengden av hver organisk syre i hvert blåbær fra konsentrasjonene av prøveoppløsningen oppnådd i det foregående trinn, og det totale volum av prøveoppløsning (50 ml, se trinn 3.12).
- Oppnå den mengde av total organisk syre i hvert blåbær ved å summere opp innholdet i de fire organiske syrer.
- Skaff innholdet prosent av total organisk syre av hver blåbær ved hjelp av vekt målt i trinn 1.3.
6. Forbehandling for HPLC Målinger av Antocyaner
- Hold blåbær i en fryser under -80 ° C klar for kjemiske analyser hvis de ikke blir analysert like etter de spektrale målinger.
- Tørk hver frossen frukt med en vakuum lyofiliseringsanordning i 12 timer.
- Ekstraher antocyaner fra den tørkede blåbær i 1% metanoloppløsning of trifluoreddiksyre [vekt av blåbær (g) / volum av oppløsningen (ml) = 1/10] ved å la blandingen i et kjøleskap ved 4 ° C i 12 timer.
- Sentrifuger ekstrakt i 15 minutter i en 2 ml mikrorør ved bruk av en ultrasentrifuge ved -8 ° C og 15 000 rpm (21900 x g).
- Filtrer ekstrakten gjennom et 0,45 um filter for å få prøven til HPLC-måling.
7. HPLC Målinger av Antocyaner
Merk: Om 13 slag antocyaniner er inkludert i blåbær. Siden det er vanskelig å få arbeidskurver for alle antocyaniner, en arbeidskurve for bare cyanidin-3-O -glucoside klorid, en av de mest populære antocyaniner i blåbær, oppnås. Arbeidskurven er søkt om omtrent quantifications av andre antocyaniner.
- Måler omtrent 1,5 mg cyanidin-3-O -glucoside klorid nøyaktig, og oppløse den i 10 ml av 1% metanol løsning av trifluoreddiksyre i Prepare en standardløsning. Fortynn 5 ml av oppløsningen til 10 ml med 1% metanol-løsning av trifluoreddiksyre for fremstilling av de andre standardløsninger. Tilsvarende forberede den tredje og den fjerde standardløsninger sekvensielt.
- Ordne HPLC-systemet som følger:
- Bruke en C18 reversfasekolonne i en kolonne ovn ved 40 ° C.
- Anvende gradient-metoden ved hjelp av eluatene av 0,1% vandig trifluoreddiksyre (elute A) og 0,5% trifluoreddiksyre i acetonitril (elute B) med strømningshastighet på 0,1 ml / min, hvor forholdet mellom eluere B øker fra 8% til 15% i løpet av 0-50 minutter etter injeksjonen, og fra 15% til 75% i løpet av 50-60 minutter etter injeksjonen.
- Bruk en fotodiode detektor overvåking ved 520 nm.
- Måle HPLC-spektrogrammene av standardløsninger ved å injisere en 10 ul alikvot for hver måling. "LC Solution" brukes som programvaren for målingen.
- Få området intensiteten av båndet avcyanidin-3- O -glucoside klorid på kromatogrammet av hver standardløsning ved å klikke på 're-analyse "med høyre museknapp.
- Plotte området intensitetene mot de tilsvarende konsentrasjoner for å få arbeidskurven for cyanidin-3-O -glucoside kloridet av den lineære regresjon, hvor ligningen som representerer forholdet mellom området intensitet og konsentrasjon er oppnådd for cyanidin-3-O -glucoside klorid.
- Måle HPLC-spektrogrammene av prøveoppløsninger ved å injisere en 10 ul alikvot for hver måling.
- Få området intensiteten av båndet på hver antocyanin på kromatogrammet av hver prøveoppløsning som tidligere er beskrevet i trinn 7,4.
- Oppnå de konsentrasjoner av antocyaniner i oppløsningene ved hjelp av likningen svarer til den arbeidskurve oppnådd i trinn 7.5.
- Oppnå mengdene av hver anthocyanin i hver blåbær fra konsentrasjonen oppnådd i det foregåtrinn, og det totale volum av prøveoppløsningen anvendt i trinn 6.3.
- Skaff den totale mengden av Antocyanin i hvert blåbær ved å summere opp innholdet i de tretten antocyaniner.
- Innhente innholdet prosent av den totale antocyanin av hver blåbær ved hjelp av vekt målt i trinn 1,3.
8. Bygging av kalibreringsmodeller for Prediksjon av bestanddeler Innhold
Merk: PLS regresjon, 4,5 som er en form for multippel regresjon teknikk med latente varianter, brukes til bygging av kalibreringsmodeller for hver ingrediens fra den observerte spektra og ingrediens innholdet bestemmes av kjemiske analyser. PLS regresjon utføres enten med de kommersielle programmer eller med hjemmelagde programmer. Se referanser 5,10 for de detaljerte fremgangsmåter for bygging av modeller.
- Undersøk som forbehandlinger for observerte spektrene er mest effektive for nøyaktig ogrobust prediksjon.
- Konstruer kalibreringsmodeller ved å bruke en eller to av følgende forbehandling: MSC (Multiplikativ Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisering), COE (Constant Offset Elimination ), og den første eller den andre deriverte beregning av SG (Savitzky-Golay) -metoden. 1,2,5 Forutsi ingrediens innholdet i valideringssettet fra sine spektra med de konstruerte modeller.
Merk: I MMN, er et spektrum normalisert slik at minimums- og maksimumsverdier blir 0 og 1, respektivt. I COE, er ordinaten av et spektrum forskjøvet, slik at minimumsverdien blir null. - Beregn koeffisienten, R2, og rest prediktiv avvik, RPD, mellom de observerte og forutsagte verdier for valideringssettet for å undersøke som forbehandlinger for observerte spektra er mest effektive. Velg kombinasjonen av forbehandlinger som gir størreR2 og RPD.
- Konstruer kalibreringsmodeller ved å bruke en eller to av følgende forbehandling: MSC (Multiplikativ Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisering), COE (Constant Offset Elimination ), og den første eller den andre deriverte beregning av SG (Savitzky-Golay) -metoden. 1,2,5 Forutsi ingrediens innholdet i valideringssettet fra sine spektra med de konstruerte modeller.
- Undersøk hvilke bølgetallet regioner er effektive for nøyaktig og robust prediksjon ved å bruke for eksempel bevegelige vinduer av PLS teknikk 11 for å søke effektive regioner.
Merk: Fremgangsmåten tilsvarer fjerning av bølgetallet regioner der spektra inneholder ingen effektiv informasjon for spådommer eller inneholder informasjon som forstyrrer spådommer.
9. Validering av den konstruerte kalibreringsmodeller
Merk: Se referanser 5,10 for de detaljerte prosesser for validering av konstruerte modeller.
- Forutsi ingrediens innholdet i valideringssettet fra sine spektra med de konstruerte kalibreringsmodeller med den beste kombinasjon av forbehandling og for bølgetallet regionene effektive for prediksjon. 5,10
- Beregn R2 og RPD mellom observert og predikertverdier for valideringssettet. 5,10
- Undersøke om de generelle kriteriene for den praktiske utførelsen av kalibreringsmodeller, 12,13 R2> 0,85 og RPD> 2,5, er oppfylt. Tenk gjenoppbyggingen av modellen dersom kriteriene ikke er fornøyd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser som et eksempel et sett av NIR-absorpsjonsspektra av blåbær hvor spektra av 70 blåbær vises samtidig. Siden bandene definitivt overdras til sukker, organiske syrer, eller antocyaniner ikke er observert i NIR spektra, er tradisjonell Lambert-Beers lov ikke aktuelt å kvantifisere ingrediens innholdet. Derfor er nødvendig for bygging av modeller for prediksjon av ingrediensinnhold.
Figur 3 viser typiske kromatogram for kvantitativ analyse av sukkerarter i blåbær. Tre paneler fra toppen er henholdsvis kromatogrammer av standard oppløsninger av sukrose, glukose og fruktose. Det nederste panel viser et kromatogram av en prøve-løsning, dvs. ekstrakt av en blåbær. De typer og konsentrasjoner av sukker i prøveoppløsningen er kjent fra retensjonstidene ennd området intensiteter av de observerte toppene. Totalt sukkerinnhold blir oppnådd som summen av sukrose, glukose, fruktose og innhold.
Figur 4 viser et eksempel på kromatogrammet for analyse av organiske syrer i en blåbær. Ved å henvise til de kromatogrammer av standardløsning (ikke vist her), blir de typer og konsentrasjoner av organiske syrer i prøveløsningen kjent. For oppdrag av de observerte topper vist i figuren legenden er to topper observert for quinic syre i kromatogrammene av standarde og prøveløsninger. De kan være overdras til isomerer av quinic syre. Totalt innhold av organisk syre er oppnådd som summen av sitronsyre, kininsyre, eplesyre, ravsyre og syreinnholdet.
Figur 5 viser et eksempel på kromatogrammet for analyse av antocyaniner i en blåbær. Mange topper tilsvarende different slags anthocyaniner er observert. Ettersom rekkefølgen av elusion for disse antocyaniner ble rapportert 14,15 som vist i tabell 1, kan de observerte toppene være tilordnet de enkelte antocyaniner. Total antocyaner innhold blir oppnådd som summen av innholdet av 13 forskjellige typer antocyaniner.
Kalibreringsmodeller er konstruert av den observerte spektra og de kjemisk bestemt bestanddel innhold. Tabell 2 viser et eksempel på behandlingen av forbehandlinger. Seks typen forbehandlinger blant "ingen (uten forbehandling)" ble undersøkt for bygging av kalibreringsmodellen av den totale sukkerinnhold ved hjelp av spektra til en fast bølgetall-område av 12,500-3,600 cm -1. Ulike forbehandlinger resultere i forskjellige prediksjon forestillinger. Forestillinger av modellene ble evaluert med R2 og RPD. Den type forbehandling som gir best PrediDette skjer ytelse velges. I tabell 2, "Second derivat + MSC", som betyr MSC etter den andre deriverte beregningen, gir de beste resultatene. Da bølgetall regionene som benyttes for modellen konstruksjonen blir undersøkt ved å variere de regionene med de faste forbehandlinger.
Figur 6 viser som et eksempel et resultat av kryssvalidering av kalibreringsmodellen for totalt sukkerinnhold, hvor korrelasjonen mellom verdiene forutsagt ved NIR-spektroskopi og de som ble bestemt ved HPLC er vist. Modellen ble bygget med "den andre deriverte + MSC" som forbehandlinger, og ved hjelp av 8,539-7,775 cm -1-regionen av spekteret. Prediksjon resultatene av modellen er R 2 = 0,85 og RPD = 2,6, like over kriteriene for praktisk bruk. I dette eksempel antall prøver som brukes for modellen konstruksjon var 30, som er for liten til å ulempertruct høy ytelse modeller.
Figur 7 viser som et eksempel et resultat av kryssvalidering av kalibreringsmodellen for totalt innhold av organisk syre, hvor korrelasjonen mellom verdiene forutsagt ved NIR-spektroskopi og de som ble bestemt ved HPLC er vist. Modellen ble konstruert med "den første deriverte + MSC" som forbehandling og bruke 7,505-5,446 og 4,605-4,242 cm -1 regioner av spektra. Prediksjonen resultatene av modellen er R 2 = 0,92 og RPD = 3,6, noe som er tilstrekkelig for praktisk anvendelse.
Figur 8 viser som et eksempel et resultat av den ytre validering av kalibreringsmodellen for total anthocyanin innhold, med korrelasjonen mellom verdiene forutsagt ved NIR-spektroskopi og de som ble bestemt ved HPLC. Modellen ble konstruert med "den første derivative "som forbehandling og ved hjelp av 12,489-6,094 og 4,605-4,242 cm -1 områder av spektrene. Forutsigelsen resultatene av modellen er R 2 = 0,95 og RPD = 4,4, noe som viser forholdsvis god ytelse av den konstruerte modell. Siden anthocyanin eksisterer hovedsakelig i skallet av blåbær, er det lett observeres med diffuse reflektansmålinger selv om innholdet i en blåbær er ikke høy. gode resultater er vist i Figur 8 ville være forårsaket også av det store antall prøver (70) som brukes for modellkonstruksjon .
Figur 2. NIR absorpsjon spektra av blåbær. Spectra på 70 blåbær vises samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kromatogrammer for kvantitativ analyse av sukker i blåbær. Kromatogrammer av standard løsninger av (A) sukrose, (B) glukose, (C) fruktose, og (D) en kromatogram av en prøveløsning. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kromatogrammet for kvantitativ analyse av organiske syrer i en blåbær. De observerte toppene samsvarer med sitronsyre (1), eplesyre (2), kininsyre (0 og 3), og ravsyre (4). Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. kromatogram for kvantitativ analyse av antocyaner i blåbær. Observerte topper tildeles enkelt antocyaniner som er oppført i tabell 1 hvor standarden oppholdstid for hver anthocyanin vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Et resultat av kryssvalidering av modellen for totalt sukkerinnhold. De predikerte ved NIR-spektroskopi verdier plottes mot de som ble bestemt ved HPLC. R 2 = 0,85 og RPD = 2,6 erholdes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Et resultat av kryssvalidering av modellen for totalt organisk syreinnhold. De spådd av NIR-spektroskopi verdier plottes mot de bestemt ved HPLC. R 2 = 0,92 og RPD = 3,6 oppnås. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 8. Et resultat av ekstern validering av modellen for total anthocyanin innhold. De spådd av NIR-spektroskopi verdier plottes mot de determined ved HPLC. R 2 = 0,95 og RPD = 4,4 oppnås. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Formel | Antocyanin | Representant Oppholdstid (min) |
| C 21 H 21 O 12 | Delphinidin-3- O -galactoside | 17.3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delphinidin-3- O -glucoside | 19,7 |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3- O -galactoside | 22.8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delphinidin-3- | 23,6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3- O -glucoside | 24.5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O -galactoside | 28.7 |
| C 20 H 19 O 10 | Cyanidin-3- O -arabinoside | 31.3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O -glucoside | 36,0 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3- O -galactoside | 37,0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidin-3- O -arabinoside | 40.8 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3- O -glucoside | 43.7 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidin-3- O -galactoside | 45,0 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidin-3- O -glucoside | 49.6 |
Tabell 1. Store antocyaniner som finnes i blåbær. De representative oppholdstider i HPLC analyse under dagens eksperimentelle forhold er også oppført.
| forbehandling | Bølgetallet region brukes for analyse (cm -1) | RPD | R2 |
| Ingen | 12,500-3,600 | 1.7 | 0.69 |
| annenderiverte | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| første deriverte | 12,500-3,600 | 2,5 | 0,84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0,81 |
| Annenderiverte + MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0,88 |
| Først derivat + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0,87 |
Tabell 2. En undersøkelse av avhengigheten av prediksjon ytelse på forbehandlinger av den observerte spektra. R2 og RPD for prediksjon av det totale sukkerinnhold er oppført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noen ytterligere kommentarer til protokollen er beskrevet her. For det første, i trinn 1.1, er det nevnt for å bestemme de sortene som inngår i målet. Selv om det er mulig å konstruere modeller som dekker blåbær fra mange sortar eller uten å spesifisere sortar, de prediksjon nøyaktighet med modellene er ofte mye lavere enn de med modellene for et enkelt sorten og for begrensede sortar. Det bør også bemerkes at kalibreringsmodeller bør være konstruert for blåbær fra hver produksjonsstedet for å få høy forutsigelse ytelse fordi blåbær høstet ved forskjellige produksjonssteder har forskjellige egenskaper som påvirker forutsigelse ytelse. 1
Dernest, i trinn 2.3, er det nevnt for å velge den diffuse refleksjon modus for måling av spektra. Overføringsmodus er også forberedt for målinger på spektrofotometer. Selv spektra målt i overføringsmodus er enLSO er tilgjengelig for bygging av kalibreringsmodeller, kan mer nøyaktig og mer robuste modeller være konstruert med spektrene måles i den diffuse refleksjonsmodus i de fleste tilfeller. De totale organiske syreinnhold kan ikke forutsies med spektra målt i transmisjon modus. 3
For det tredje, for målingene av spektra av blåbær, er det ikke anbefalt å måle spektra på begeret siden overflatetilstanden og innholdet rundt begeret er forskjellige fra de på andre posisjoner. Ikke desto mindre er det mulig å konstruere kalibreringsmodeller ved bruk av et stort antall spektra målt ved både begeret og andre stillinger. Imidlertid nøyaktighet på modellene er i de fleste tilfeller lavere enn for de modeller konstruert med spektrene målt bare ved andre enn begeret posisjoner.
For det fjerde, en NIR-spektrum av blåbær avhenger av temperaturen. Derfor, for nøyaktig prediksjon enten det er imtig å alltid måle spektra ved samme omgivelsestemperatur eller å konstruere kalibreringsmodeller med kompensasjon for temperatur variasjon. 1
For det femte, selv om bare R2 og RPD brukes for å velge de forbehandlinger og vurdere resultatene av konstruerte modeller her, noen andre verdier som SEC (Standard Error of Calibration), september (Standard Error of Prediction), SECV (Standard Error of Cross -Validation), er RMSEP (Root Mean Square error of Prediction), og RMSECV (Root Mean Square feil av kryssvalidering) vanligvis brukt for mer detaljert undersøkelse. I vår forrige papiret, tre for eksempel RMSEP og RMSECV ble brukt for å velge forbehandlinger og vurdere resultatene av konstruerte modeller.
Destruktiv prediksjon av total sukker, totalt organisk syre, og totalt Antocyanin innholdet i en blåbær var found være mulig hvis modellene for spådommer er konstruert riktig. Denne teknikk er anvendbar for valg av bare delikate blåbær fra alle høstede seg, noe som ikke kan oppnås med andre tradisjonelle analytiske teknikker. 8,9 Selv om fremgangsmåtene i de kjemiske analysene kan virke komplisert, blir de tatt med i vanlige analytiske teknikker, og er ikke ledsaget av store vanskeligheter. Det er viktig å få nøyaktige resultater for de kjemiske analysene fordi resultatene er grunnlaget for den konstruerte modell. I denne studien RSD (relativt standardavvik) av HPLC-målingene var omkring 1%. Det er også nødvendig å følge den vanlige fremgangsmåten, for eksempel som vist i figur 1, for bygging av praktisk talt aktuelle modeller.
Enkle og raske metoder i stedet for HPLC kan brukes for de kjemiske analysene. Totalt sukkerinnhold og syre kan måles henholdsvis med et refraktometer(Brix meter) og et pH-meter. PH differensial metode 16,17 er anvendelig for måling av total anthocyanin innhold. Anvendelse av enkle metoder gjør bygging av modeller mye enklere, selv om nøyaktigheten av verdier prediksjonen modell, kan være lavere enn de som er forutsagt av modellene konstruert på basis av HPLC-målingene som er vist her. Likevel kan nøyaktigheten av modellene konstruert på grunnlag av enkle kjemiske analyser være praktisk anvendelig på produksjonssteder og sirkulasjonsprosesser fordi høye nøyaktighets ikke alltid nødvendig der. Metodene for de kjemiske analyser, bør derfor velges i henhold til de nøyaktigheter som trengs for de modellene som skal bygges.
Selv om noen frukter som eple og appelsin selges vanligvis med garantert sukkerinnhold og surheter, har blåbær ikke blitt solgt med garantert kvaliteter. Som et resultat, er kvaliteten av de kommersielle blåbær gjørikke synes stabil i det minste i Japan; noen ganger lav kvalitet blåbær selges i markeder. Destruktiv analysemetoder av NIR-spektroskopi som vises her er forventet å aktivere, i prinsippet, forsendelsen og salg av blåbær med garanterte kvaliteter.
Endelig, er det begrensninger for denne metoden. For det første, som nevnt ovenfor, er konstruksjonen av prediksjonsmodeller temmelig besværlig. Videre bør prediksjon modell konstrueres for hvert område og hvert år dyrking fordi forskjellen i mengden av andre sykdoms komponenter (som avhenger av stedet og året dyrking) påvirker presisjonen til prediksjon. Derfor er noen innsats er nødvendig for vedlikehold av prediksjonsmodeller. For det andre, selv om vi har vist at nær-infrarød spektroskopi er i prinsippet gjelder for kvalitetskontrollen av blåbær, utstyr og teknikker som vises her er kun brukt i laboratoriet og ikke gjelder på produksjonssteder væreføre til en rask sjekk av store mengder bær på produksjonssteder er umulig. Praktisk utvikling av egnet utstyr og utvikling av robuste kalibreringsmodeller som er egnet for bruk i produksjonssteder og sirkulasjon prosesser er fremtidige retninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
- Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
- Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
- Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
- Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
- Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
- Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
- Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
- Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
- Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
- Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
- Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
- Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
- Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
- Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
- Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
- Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).
