Introduction
Nabij-infrarood (NIR) spectroscopie wordt op grote schaal toegepast als een niet-destructieve techniek om de inhoud van groenten en fruit van verschillende soorten te analyseren. 1,2 destructieve analyse door NIR-spectroscopie in staat de verzending van alleen lekker fruit en groenten met gegarandeerde kwaliteit. NIR-spectroscopie reeds toegepast sinaasappel, appel, meloen, kers, kiwi, mango, papaja, perzik enzovoort hun Brix die overeenkomt met het totale suikergehalte, zuurgraad, TSC (totale vaste inhoud) kent, enzovoort . Onlangs hebben we de toepassing van NIR-spectroscopie om de kwaliteitsbeoordeling van bosbessen gemeld. 3 We maten niet alleen het totale suikergehalte en het totale gehalte aan organisch zuur dat overeenstemt met zuren, maar ook de totale anthocyaninegehalte. Anthocyanine is een bioactieve component die wordt verondersteld om menselijke gezondheid te verbeteren. Het is handig voor de consument als ze heerlijke bosbessen kunt kopen met een garantie van hun suikergehalte, acidity en anthocyaan inhoud.
In NIR absorptie spectra van groenten en fruit, worden alleen brede absorptiebanden waargenomen. Het zijn voornamelijk de banden door vezels en vocht. Hoewel veel zwakke banden door verschillende bestanddelen van de niet-vernietigde doelwit gelijktijdig waargenomen, de waargenomen banden niet specifieke trillingsmodes van specifieke onderdelen van het doelwit meestal toegewezen. Daarom is de traditionele techniek om de inhoud van een bepaalde component via de wet van Lambert-Beer bepalen is niet effectief voor NIR spectra. In plaats daarvan, kalibratiemodellen de inhoud van de beoogde componenten van de waargenomen spectra worden met gebruik chemometrie door onderzoek van de correlatie tussen de waargenomen spectra en het ingrediënt inhoud overeenkomt met de spectra hier voorspellen. 4,5, een protocol te bouwen en te valideren modellen voor het voorspellen van het totale suikergehalte, totaal gehalte aan organisch zuur dat overeenstemt met acidity, en de totale anthocyaan inhoud van blauwe bessen uit NIR spectra wordt gepresenteerd.
Figuur 1 toont de algemene stroomdiagram betrouwbare en robuuste calibratiemodellen construeren. Monsters van voldoende worden verzameld. Sommigen van hen zijn gebruikt voor de constructie van modellen terwijl de andere worden gebruikt voor de validatie van de geconstrueerde modellen. Voor elk van de verzamelde monsters, wordt een NIR spectrum gemeten en de doelcomponenten kwantitatief geanalyseerd met traditionele destructieve chemische analysemethoden. Hier is high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) worden de chemische analyse van suikers, organische zuren en anthocyanen. Partiële kleinste kwadraten (PLS) regressie wordt gebruikt voor de constructie van calibratiemodellen waarbij de correlatie tussen de waargenomen spectra en de inhoud ingrediënt bepaald door chemische analyses onderzocht. Met het oog op robuuste modellen met de beste voorspelling vermogen, de voorbehandelingen van opmer construerenved spectra en de golflengte regio's gebruikt voor het voorspellen worden ook onderzocht. Ten slotte worden de geconstrueerde modellen gevalideerd om hun voorspelling voldoende vermogen te bevestigen. In de validatie, de inhoud voorspeld uit de waargenomen spectrum van het geconstrueerde model (voorspelde waarde) wordt vergeleken met de door de chemische analyses (gemeten waarden) inhoud. Indien onvoldoende correlatie niet kunnen worden gevonden tussen de voorspelde en gemeten waarden, de calibratiemodel opnieuw worden opgebouwd tot voldoende correlatie wordt verkregen. Hoewel het de voorkeur om verschillende groepen van monsters voor de bouw en validatie van een model dat in deze figuur weergegeven (externe validatie) worden monsters in eenzelfde groep zowel gebruikt voor de constructie en de validatie (kruisvalidatie) wanneer het aantal monsters niet groot genoeg is.
FIGUUR 1. Stroomdiagram voor de bouw en validatie van de kalibratie-model. De procedures omgeven door blauwe en groene lijnen overeenkomen, respectievelijk, om de bouw van een kalibratie-model en de validatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het verzamelen van monsters
- Bepaal welke cultivars zullen worden opgenomen in het doel van de kalibratie model.
- Verzamel voldoende aantal verschillende typen monster bosbessen van het doel cultivars.
- Verzamel voorkeur 100 bosbessen voor de bouw van het ijkingsmodel, en minstens 10 voor de validatie van de geconstrueerde model. Om robuuste modellen te bouwen, het verzamelen van monsters van verschillende soorten, dat wil zeggen met verschillende kleuren, formaten en op verschillende rijping omstandigheden.
- Weeg elke bosbessen. Opmerking: De gewichten gemeten worden later gebruikt voor de berekening van de inhoud procent bestanddelen van elke bosbessen.
2. Metingen van Spectra
- Warm-up van de spectrofotometer voldoende (meer dan 1 uur) voorafgaande aan de metingen om betrouwbare spectra te krijgen.
- Stel de spectrofotometer. Zorg ervoor dat de voorwaarden zijn constant allen door de metingen. Eenvoorbeeld van typische omstandigheden voor metingen wordt hieronder gegeven.
- Stel het bereik van de metingen om 12,500-3,600 cm -1.
- Stel de spectrale resolutie tot 16 cm -1.
- Zet de accumulatie 32 keer.
- Selecteer diffuse reflectie als de wijze van meten.
- Zet de standaardreflector op het raam van de spectrofotometer diffuse reflectie metingen. Met de opdracht "achtergrond enkele channel", meet het achtergrondspectrum die automatisch wordt gebruikt voor de berekening van relatieve reflectie spectra van de spectra van het monster bosbessen later gemeten.
- Liep bosbes monster in het midden van het venster van de spectrofotometer diffuse reflectie metingen. Door het gebruik van het commando "sample single channel", meten spectra van elk blueberry bij voorkeur op verschillende punten van de vrucht.
Opmerking: Kubelka-Munk transformatie 6,7 zal ook worden uitgevoerd automatisch bij de waargenomen spectra van monster bosbessen indien de staat van spectrale acquisitie leidt daartoe. Kubelka-Munk transformatie verandert de spectra gemeten in de diffuse reflectie modus om de spectra overeenstemmen met die gemeten in de transmissiemodus en is nodig voor het analyseren van spectra met hoge nauwkeurigheid. Spectra van de absorptie schaal gebruikt voor analyse. - Bereken het gemiddelde spectrum van de spectra van elk monster met behulp van een gegevensverwerkende programma zoals MS Excel als de spectra van een bosbes monster worden gemeten op verschillende punten. Gebruik de gemiddelde spectrum voor analyses.
3. voorbehandeling voor HPLC Metingen van suikers en organische zuren 8
Opmerking: Extract suikers en organische zuren van elk bosbessen, die oplosbaar zijn in water, met ultrazuiver water als volgt. Op een volledig bosbes wordt gebruikt voor analyse.
- Bewaar de bosbessen in een vriezer beneden -30 ° C klaar for chemische analyses als ze niet worden geanalyseerd direct na de spectrale metingen.
- Snijd een bosbes in stukken zodat het gemakkelijk in de volgende stappen kunnen worden gehomogeniseerd. Snijd de bosbes zonder ontdooien wanneer het wordt bevroren.
- De stukjes in een 50 ml bekerglas.
- ca. toevoegen 10 ml ultrazuiver water (gedestilleerd water waarvan de elektrische geleidbaarheid lager dan 0,1 uS / cm) aan de beker.
- Verwarm de snede bosbessen in ultrazuiver water in een magnetronoven gedurende 20 seconden om de enzymen die suikers kunnen ontleden tijdens de analyses uit te schakelen.
- Ca. 10 ml van ultrapuur water aan de beker.
- Homogeniseer het mengsel gedurende 5 minuten bij 12.000 rpm met een homogenisator uitgerust met een standaard as en generator.
- Centrifugeer het gehomogeniseerde mengsel gedurende 10 minuten bij 3000 rpm (2000 x g).
- Verzamel het filtraat door vacuümfiltratie van het gecentrifugeerde monster 5B met behulp van een papieren filter.
- Herhaal de stappen 3,6-3,9 tweemaal op The filtratieresidu alle suikers en organische zuren te verzamelen, en een combinatie van alle filtraten.
- Meet de pH van het filtraat en afstellen op 7 met verdund zoutzuur (0,1 en 0,01 mol L -1) en verdunde waterige oplossingen van natriumhydroxide (0,1 en 0,01 mol L -1).
- Verdun het filtraat tot 50 ml met ultrazuiver water.
- Verdeel het monster in twee; een voor de analyse van suikers en andere voor de analyse van organische zuren.
- Passeer de eerste monster oplossing door kolommen (twee C18, CM en QMA) in serie verbonden met pigmenten, kationen en anionen uit te sluiten. Gooi de eerste 1 ml van het monster oplossing uit de kolommen. gebruik de monsteroplossing uit de kolommen voor de analyse van suikers met HPLC.
- Passeer de tweede monster oplossing door kolommen (twee C18 en CM) in serie verbonden met pigmenten en kationen uit te sluiten. Gooi de eerste 1 ml van het monster oplossing uit de kolommen. Maak dan gebruik van het monster oplossing uit de columns voor de analyse van organische zuren met HPLC.
- Centrifuge elke oplossing van stap 3,14 en 3,15 bij 6600 rpm (5800 x g) gedurende 10 min in een microbuis met een 0,45 urn filter met een mini-centrifuge voor de analyse met HPLC.
4. HPLC Metingen van Sugars
Opmerking: In dit onderzoek wordt som gehalte aan sucrose, glucose en fructose elk bosbessen beschouwd als het totale suikergehalte. Daarom wordt de werking curve voor elk van de drie suikers eerst verkregen en vervolgens totaal gehalte aan suikers per bosbes verkregen. De standaard inhoud wordt gerapporteerd als 0,3-0,4 gew% (sucrose), 3,8-4,8 gew% (glucose) en 4,2-5,3 gew% (fructose). 9
- Meet ongeveer 200 mg sucrose nauwkeurig, en oplossen in 50 ml ultrapuur water om een standaard oplossing te bereiden. Verdun 5 ml van de oplossing tot 50 ml met ultrazuiver water voor de tweede standaardoplossingen bereid. Bereid eveneens de derde standard oplossing uit de tweede standaardoplossing.
- Bereid de standaardoplossingen van glucose en fructose, eveneens.
- Schik de HPLC-systeem als volgt:
- Gebruik een gelpermeatiekolom in de kolom oven bij 40 ° C.
- Gebruik ontgast ultrazuiver water met de stroomsnelheid van 0,1 ml / min als eluaat.
- Gebruik een brekingsindexdetector.
- Meet de HPLC spectrogrammen van standaardoplossingen door injectie van een 20 pi aliquot voor elke meting. Opmerking: Hier wordt PAC oplossing gebruikt als software voor de meting.
- Haal het gebied intensiteit van de band van suiker op het chromatogram van elke standaardoplossing door te klikken op 're-analyse' met de rechter muisknop.
- Plot gebied intensiteiten tegen de bijbehorende concentraties om de werking curve voor elke suiker te krijgen door de lineaire regressie, waarbij de vergelijking die de relatie tussen het gebied intensiteit en de concentratie wordt verkregen for elke suiker.
- Meet de HPLC spectrogrammen van sample oplossingen door het injecteren van een 20 ul monster voor elke meting.
- Haal het gebied intensiteiten van de banden van suikers met de retentietijd van elke monsteroplossing zoals eerder beschreven in stap 4,5.
- Verkrijgen van de concentratie van de suikers in de oplossingen met de vergelijkingen die overeenkomt met de werking curves verkregen in stap 4.6.
- Verkrijgen van de hoeveelheid van elke suiker per bosbessen door de concentraties van de monsteroplossing verkregen in de voorgaande stap en het totale volume van de monsteroplossing (50 ml, zie stap 3.12).
- Het verkrijgen van de totale hoeveelheid suiker van elke vrucht door het optellen van de inhoud van drie suikers.
- Het verkrijgen van de inhoud procent van de totale suikerproductie van elke bosbes door gebruik te maken van het gewicht gemeten in stap 1.3.
5. HPLC metingen van organische zuren
Opmerking: In dit onderzoek som gehalte citroenzuur, chininezuur, appelzuurzuur en barnsteenzuur worden beschouwd als de totale organische zuurgehalte. Daarom werkt curve voor elk van de vier organische zuren eerst verkregen, en daarna werd de organische zuren per bosbes gemeten. De standaard inhoud wordt gerapporteerd als 0,42-0,62 gew% (citroenzuur), 0-0,15 gew% (kinazuur), 0,08-0,23 gew% (appelzuur) en 0,06-0,25 gew% (barnsteenzuur). 9
- Meet ongeveer 5 mg van citroenzuur nauwkeurig, en los het in 50 ml ultrapuur water om een standaard oplossing te bereiden. Verdun 5 ml van de oplossing tot 50 ml met ultrazuiver water voor de tweede standaardoplossingen bereid. Bereid eveneens de derde standaardoplossing van de tweede standaardoplossing.
- Bereid de standaardoplossingen van chininezuur, appelzuur en barnsteenzuur, eveneens.
- Schik de HPLC-systeem als volgt:
- Gebruik twee anionenuitwisseling kolommen in serie verbonden in de kolom oven bij 40 ° C.
- Gebruik ontgast 0,1% waterige oplossing van fosforzuurzuur met de stroomsnelheid van 0,02 ml / min als eluaat.
- Gebruik een ultraviolet-zichtbare detector ingesteld op 210 nm.
- Meet de HPLC spectrogrammen van standaardoplossingen door het injecteren van een 20 ui monster van de standaard oplossing voor elke meting.
- Haal het gebied intensiteit van de band van organisch zuur op het chromatogram van elke standaardoplossing door te klikken op 're-analyse' met de rechter muisknop.
- Plot gebied intensiteiten tegen de bijbehorende concentraties aan de werkende curve voor elk organisch zuur krijgen door de lineaire regressie, waarbij de vergelijking die de relatie tussen het gebied intensiteit en de concentratie wordt verkregen voor elk organisch zuur.
- Meet de HPLC spectrogrammen van monsteroplossingen door injectie van een 20 pi aliquot van het monster voor elke meting.
- Haal het gebied intensiteiten van de banden van organische zuren met de retentietijd van elke monsteroplossing zoals eerder beschreven in stap 5,5.
- Verkrijgen van de concentratie van de organische zuren in de oplossingen met de vergelijkingen die overeenkomt met de werking curves verkregen in stap 5.6.
- Verkrijgen van de hoeveelheid van elk organisch zuur in elk bosbessen door de concentraties van de monsteroplossing verkregen in de voorgaande stap en het totale volume van de monsteroplossing (50 ml, zie stap 3.12).
- Het verkrijgen van de totale hoeveelheid organisch zuur in elk bosbes door het optellen van de inhoud van de vier organische zuren.
- Het verkrijgen van de inhoud procent van de totale organisch zuur van elk bosbessen met behulp van het gewicht gemeten in stap 1.3.
6. voorbehandeling voor HPLC Metingen van anthocyanen
- Houd de bosbessen in een vriezer beneden -80 ° C gereed voor chemische analyses als ze niet worden geanalyseerd direct na de spectrale metingen.
- Droog elk bevroren fruit met een vacuüm vriesdroger gedurende 12 uur.
- Uittreksel anthocyanine uit de gedroogde bosbessen in 1% methanol oplossing of trifluorazijnzuur [gewicht van blueberry (g) / volume van de oplossing (ml) = 1/10] door het verlaten van het mengsel in een koelkast bij 4 ° C gedurende 12 uur.
- Na centrifugeren gedurende 15 min in een 2 ml microbuis met een ultracentrifuge bij -8 ° C en 15.000 rpm (21.900 x g).
- Filtreer het extract door een 0,45 urn filter om het monster voor HPLC-metingen te krijgen.
7. HPLC Metingen van anthocyanen
Opmerking: Over 13 soort anthocyanen zijn opgenomen in bosbessen. Aangezien het moeilijk werken curves krijgen voor anthocyanines, een werkkromme alleen cyanidine-3-O -glucoside chloride, een van de meest populaire anthocyanines in bosbessen, wordt verkregen. De werkende curve wordt aangevraagd bij benadering kwantificering van andere anthocyanen.
- Zijn ongeveer 1,5 mg cyanidine-3-O -glucoside chloride nauwkeurig en los deze in 10 ml van 1% methanol oplossing van trifluorazijnzuur prepare een standaardoplossing. Verdun 5 ml van de oplossing tot 10 ml met 1% methanol oplossing van trifluorazijnzuur tweede standaardoplossingen bereid. Bereid op dezelfde wijze de derde en vierde standaardoplossingen elkaar.
- Schik de HPLC-systeem als volgt:
- Gebruik een C18 omgekeerde fasekolom in een kolom oven bij 40 ° C.
- Breng de gradiënt methode met eluaten van 0,1% waterig trifluorazijnzuur (elueren A) en 0,5% trifluorazijnzuur in acetonitril (elueren B) met de stroomsnelheid van 0,1 ml / min, waarbij de verhouding tussen eluaat B toeneemt van 8% tot 15% gedurende 0-50 min na de injectie, en van 15% tot 75% gedurende 50-60 min na de injectie.
- Gebruik een fotodiodearraydetector controle bij 520 nm.
- Meet de HPLC spectrogrammen van standaardoplossingen door injectie van een 10 pi aliquot voor elke meting. "LC oplossing" wordt gebruikt als software voor de meting.
- Haal het gebied intensiteit van de band vancyanidin-3-O -glucoside chloride op het chromatogram van elke standaardoplossing door te klikken op 're-analyse' met de rechter muisknop.
- Zet de omgeving intensiteiten tegen de bijbehorende concentraties om de werking curve voor cyanidin-3-O -glucoside chloride krijgen door de lineaire regressie, waarbij de vergelijking die de relatie tussen gebied intensiteit en concentratie wordt verkregen voor cyanidin-3-O -glucoside chloride.
- Meet de HPLC spectrogrammen van sample oplossingen door het injecteren van een 10 ul monster voor elke meting.
- Haal het gebied intensiteit van de band van elk anthocyanine met de retentietijd van elke monsteroplossing zoals eerder beschreven in stap 7.4.
- Verkrijgen van de concentraties van de anthocyanines in de oplossingen met de vergelijking die overeenkomt met de werkkromme verkregen in stap 7.5.
- Het verkrijgen van de bedragen van alle anthocyanine in elk bosbessen uit de concentratie verkregen in de vorigestap en het totale volume van de monsteroplossing in stap 6,3.
- Het verkrijgen van de totale hoeveelheid anthocyanine in elk bosbessen door het optellen van de inhoud van de dertien anthocyanen.
- Verkrijgen van de inhoud procent van de totale anthocyanine per bosbessen met het gewicht gemeten in stap 1,3.
8. De bouw van Calibration Modellen voor de voorspelling van Ingrediënt Inhoud
Opmerking: PLS regressie, 4,5 hetgeen een soort meervoudige regressie techniek met latente varianten, wordt gebruikt voor de constructie van calibratiemodellen voor elk ingrediënt van de waargenomen spectra en het ingrediënt bepaald via chemische analyse. PLS regressie wordt uitgevoerd of met de commerciële programma's of met de zelfgemaakte programma's. Zie referenties 5,10 voor de gedetailleerde processen van de bouw van modellen.
- Onderzoeken welke voorbehandelingen voor waargenomen spectra zijn het meest effectief voor nauwkeurige enrobuuste voorspelling.
- Construct calibratiemodellen door toepassing van één of twee van de volgende voorbehandelingen: MSC (Multiplicatieve Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisatie), COE (Constant Offset Elimination ) en de eerste of de tweede afgeleide berekening SG (Savitzky-Golay) methode. 1,2,5 Voorspel het ingrediënt inhoud van de termijn van de spectra met de geconstrueerde modellen validatie.
Opmerking: In MMN, een spectrum genormaliseerd zodat de minimum- en maximumwaarden respectievelijk de 0 en 1,. In COE wordt de ordinaat van een spectrum verschoven zodat de minimale waarde nul. - Bereken determinatiecoëfficiënt, R2 en residuele voorspellende afwijking, RPD, tussen waargenomen en voorspelde waarden van de termijn te onderzoeken welke voorbehandelingen voor waargenomen spectra zijn het meest effectief validatie. Kies de combinatie van voorbehandelingen te verruimenR2 en RPD.
- Construct calibratiemodellen door toepassing van één of twee van de volgende voorbehandelingen: MSC (Multiplicatieve Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisatie), COE (Constant Offset Elimination ) en de eerste of de tweede afgeleide berekening SG (Savitzky-Golay) methode. 1,2,5 Voorspel het ingrediënt inhoud van de termijn van de spectra met de geconstrueerde modellen validatie.
- Nagaan welke golfgetal gebieden effectief voor de accurate en robuuste voorspelling door toepassing van bijvoorbeeld een bewegende vensters techniek PLS 11 de effectieve gebieden te zoeken.
Opmerking: De procedure komt overeen met het verwijderen van de golfgetal regio's waar spectra bevatten geen effectieve informatie over voorspellingen of informatie bevatten die interfereert met voorspellingen.
9. Validatie van de geconstrueerde calibratiemodellen
Opmerking: Zie referenties 5,10 voor de gedetailleerde processen van de validatie van de geconstrueerde modellen.
- Voorspel bestanddeel inhoud van de termijn van de spectra met de aangenomen kalibratiemodellen met de beste combinatie van voorbehandeling en het golfgetal gebieden effectief voor het voorspellen validatie. 5,10
- Bereken R2 en RPD tussen waargenomen en voorspeldewaarden van de validatie set. 5,10
- Onderzoeken of de algemene criteria voor de praktische uitvoering van de kalibratie modellen, 12,13 R2> 0,85 en RPD> 2.5, is voldaan. Denk aan de reconstructie van het model als de criteria niet voldaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont een voorbeeld van een set van NIR absorptie spectra van bosbessen, waar spectra van 70 bosbessen gelijktijdig worden getoond. Omdat de bands zeker toewijsbaar aan suikers, organische zuren, of anthocyanen niet in de NIR spectra worden waargenomen, traditionele Lambert-Beer wet is niet van toepassing op de inhoud ingrediënt kwantificeren. Daarom is de constructie van modellen voor het voorspellen van bestanddeel inhoud noodzakelijk.
Figuur 3 toont typische chromatogrammen voor de kwantitatieve analyse van suikers in bosbessen. Drie panelen van boven zijn respectievelijk de chromatogrammen van standaardoplossingen van sucrose, glucose en fructose. Het onderste paneel toont een chromatogram van een monster oplossing, dat wil zeggen het extract van een bosbes. De soorten en concentraties van suikers in de monsteroplossing zijn bekend uit de retentietijden eennd het gebied intensiteiten van de waargenomen pieken. Totale suikergehalte wordt verkregen als de som van de inhoud sucrose, glucose en fructose.
Figuur 4 toont een voorbeeld van een chromatogram voor de analyse van organische zuren in een bosbes. Onder verwijzing naar de chromatogrammen van de standaardoplossing (hier niet getoond), worden de soorten en concentraties van organische zuren in de monsteroplossing bekend. Voor de opgaven van de waargenomen pieken in de legenda van de figuur worden twee pieken waargenomen voor chininezuur in de chromatogrammen van de standaard en monsteroplossingen. Ze kunnen toewijsbaar aan isomeren van chininezuur zijn. Totale organische zuurgehalte wordt verkregen als de som van citroenzuur, chininezuur, appelzuur, barnsteenzuur en zuurgehalte.
Figuur 5 toont een voorbeeld van een chromatogram voor de analyse van anthocyaninen in een bosbes. Veel pieken die overeenkomen met verschillemnt soort anthocyanen in acht worden genomen. Aangezien de volgorde van Elusion deze anthocyanines werden gerapporteerd 14,15 zoals weergegeven in Tabel 1, kan de waargenomen pieken afzonderlijke anthocyaninen toegewezen. Totale anthocyaninegehalte wordt verkregen als de som van de gehalten van 13 soorten anthocyanines.
Callibratiemodellen zijn opgebouwd uit de waargenomen spectra en de inhoud bepaald chemisch bestanddeel. Tabel 2 geeft een voorbeeld van het onderzoek van voorbehandelingen. Zes Type voorbehandelingen zoals "geen (zonder voorbehandeling)" werden onderzocht op de constructie van het ijkingsmodel totale suikergehalte behulp spectra in vaste golfgetalgebied van 12,500-3,600 cm -1. Verschillende voorbehandelingen resulteren in verschillende voorspelling optredens. Uitvoeringen van de modellen geëvalueerd met R 2 en RPD. De aard van de voorbehandelingen die de beste PREDI geeftction prestaties wordt gekozen. In Tabel 2, "tweede afgeleide MSC +" betekent MSC na de tweede afgeleide berekening geeft de beste resultaten. Dan is de golfgetal regio's worden gebruikt voor de modelbouw worden onderzocht door het variëren van de regio's met de vaste voorbehandelingen.
Figuur 6 toont als voorbeeld een gevolg van kruisvalidatie van de ijkingsmodel voor totale suikergehalte, waarbij de correlatie tussen de waarden voorspeld door NIR spectroscopie en die bepaald met HPLC wordt getoond. Het model werd gebouwd met "de tweede afgeleide MSC +" als voorbehandelingen en gebruiken 8,539-7,775 cm -1 gebied van de spectra. De voorspelling prestaties van het model is R 2 = 0,85 en RPD = 2,6, juist boven de criteria voor het praktische gebruik. In dit voorbeeld is het aantal monsters voor de modelbouw was 30, die te klein is om nadelentruct high performance modellen.
Figuur 7 toont als voorbeeld een gevolg van de kruisvalidatie van de ijkingsmodel voor totale organische zuren, waarbij de correlatie tussen de waarden voorspeld door NIR spectroscopie en die bepaald met HPLC wordt getoond. Het model werd gebouwd met "de eerste afgeleide MSC +" als voorbehandelingen en gebruiken en 7,505-5,446 4,605-4,242 cm -1 gebieden van spectra. De voorspelling prestaties van het model is R 2 = 0,92 en RPD = 3,6, die voldoende is voor praktische toepassing.
Figuur 8 toont als voorbeeld een gevolg van de externe validatie van het ijkingsmodel voor totale anthocyaninegehalte, de correlatie tussen de waarden voorspeld door NIR spectroscopie en die bepaald met HPLC. Het model werd gebouwd met "de eerste derivative "als voorbehandeling en met de 12,489-6,094 en 4,605-4,242 cm -1 gebieden spectra. De voorspelling prestatie van het model R 2 = 0,95 en RPD = 4,4, die vrij goede prestaties van de geconstrueerde model toont. Aangezien anthocyanine bestaat voornamelijk in de schil van bosbessen, wordt gemakkelijk waargenomen met diffuse reflectiemetingen hoewel de inhoud in een blueberry niet hoog. de goede prestaties in figuur 8 zou worden veroorzaakt door het grote aantal monsters (70) voor modelbouw .
Figuur 2. NIR absorptie spectra van bosbessen. Spectra van 70 bosbessen worden tegelijkertijd getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Chromatogrammen voor de kwantitatieve analyse van suikers in bosbessen. Chromatogrammen van standaardoplossingen van (A) sucrose, (B) glucose, (C), fructose, en (D) een chromatogram van een monster oplossing. Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Chromatogram voor de kwantitatieve analyse van organische zuren in een bosbes. Waargenomen pieken corresponderen met citroenzuur (1), appelzuur (2), kinazuur (0 en 3) en barnsteenzuur (4). Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Chromatogram voor de kwantitatieve analyse van anthocyanen in een bosbes. Waargenomen pieken worden toegewezen aan in tabel 1, waar de standaard retentietijd voor elk anthocyanine wordt vermeld individuele anthocyanen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Een resultaat van kruisvalidatie van het model voor totale suikergehalte. De waarden voorspeld door NIR spectroscopie worden uitgezet tegen die vastgesteld met HPLC. R 2 = 0,85 en RPD = 2,6 verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Een gevolg van cross validatie van het model voor de totale organische zuurgehalte. De waarden voorspeld door NIR-spectroscopie zijn uitgezet tegen die bepaald door HPLC. R2 = 0,92 en RPD = 3,6 verkregen. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 8. Een resultaat van de externe validatie van het model voor de totale anthocyaan inhoud. De waarden voorspeld door NIR-spectroscopie zijn uitgezet tegen die dvastgesteld naar door middel van HPLC. R2 = 0,95 en RPD = 4,4 verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Formule | anthocyaan | Vertegenwoordiger Retentietijd (min) |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidine-3- O -galactoside | 17.3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidine-3- O -glucoside | 19.7 |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3-O -galactoside | 22.8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delfinidine-3- | 23.6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3-O -glucoside | 24.5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidine-3-O -galactoside | 28.7 |
| C 20 H 19 O 10 | Cyanidin-3-O -arabinoside | 31.3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidine-3-O -glucoside | 36.0 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidine-3- O -galactoside | 37.0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidine-3-O -arabinoside | 40.8 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidine-3- O -glucoside | 43.7 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidine-3- O -galactoside | 45.0 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidine-3- O -glucoside | 49.6 |
Tabel 1. Major anthocyanen in bosbessen. De vertegenwoordiger retentietijden in de HPLC-analyse onder de huidige experimentele omstandigheden worden ook vermeld.
| preprocessing | Regio golfgetal voor analyse (cm -1) | RPD | R 2 |
| Geen | 12,500-3,600 | 1.7 | 0.69 |
| tweede afgeleide | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| eerste afgeleide | 12,500-3,600 | 2.5 | 0.84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0.81 |
| + Tweede afgeleide MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0.88 |
| Eerste afgeleide + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0.87 |
Tabel 2. Een onderzoek van de afhankelijkheid van voorspelling prestaties op de voorbehandeling van de waargenomen spectra. R2 en RPD voor het voorspellen van de totale suikergehalte zijn opgenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkele aanvullende opmerkingen over het protocol worden hier beschreven. Ten eerste in stap 1,1 wordt vermeld de cultivars in het doel bepalen. Hoewel het mogelijk is om modellen die bosbessen uit vele cultivars of zonder opgave cultivars construeren, de voorspelling nauwkeurigheden de modellen zijn soms veel lager dan die met de modellen voor één cultivar en voor beperkte cultivars. Ook moet worden opgemerkt dat de kalibratiemodellen worden geconstrueerd uit elk bosbessen productielocatie naar hoog voorspelling prestaties omdat bosbessen geoogst op verschillende productielocaties hebben verschillende karakteristieken die voorspelling beïnvloeden. 1
Ten tweede stap 2,3 wordt vermeld om de diffuse reflectie modus voor de meting van spectra selecteren. De verzendmodus wordt ook bereid voor meting op de spectrofotometer. Hoewel spectra gemeten in de transmissie-modus zijn eenlso beschikbaar voor de constructie van kalibratiemodellen, kunnen nauwkeurigere en robuustere modellen worden gebouwd met de spectra gemeten in de diffuse reflectie modus in de meeste gevallen. De totale organische zuurgehalte kan niet voorspeld worden de spectra gemeten in de transmissie modus. 3
Ten derde, de metingen van spectra bosbessen, wordt het afgeraden om spectra meet aan de kelk omdat de oppervlaktegesteldheid en de inhoud rondom de kelk verschillen van die op andere posities. Desalniettemin is het mogelijk calibratiemodellen construeren met een voldoende aantal spectra gemeten op zowel de kelk en andere posities. De nauwkeurigheid van de modellen in de meeste gevallen lager dan die van de modellen gebouwd met de gemeten spectra alleen buiten de kelk posities.
Ten vierde, een NIR spectrum van bosbessen afhankelijk van de temperatuur. Daarom is voor een nauwkeurige voorspelling ofwel is imlangrijk om altijd te meten spectra tegelijk omgevingstemperatuur of om calibratiemodellen construeren met compensatie voor temperatuurschommelingen. 1
Ten vijfde, hoewel slechts R2 en RPD worden gebruikt voor het kiezen van de voorbehandelingen en de beoordeling van de prestaties van de geconstrueerde modellen hier, een aantal andere waarden zoals SEC (Standard Error van Calibration), september (Standard Error van Prediction), SECV (Standard Error of Cross -Validatie), RMSEP (Root Mean Square error van Prediction) en RMSECV (Root Mean Square error van Cross-Validation) worden meestal gebruikt voor nader onderzoek. In onze vorige papier, 3 bijvoorbeeld, RMSEP en RMSECV werden gebruikt voor het kiezen van voorbehandelingen en de beoordeling van de prestaties van de geconstrueerde modellen.
Destructieve voorspelling van de totale suiker, totaal organisch zuur, en de totale inhoud van anthocyanine in een bosbes was found mogelijk als de modellen voor voorspellingen correct geconstrueerd. Deze techniek is toepasbaar voor de selectie van alleen heerlijke bosbessen Uit geoogste degenen, die niet kunnen worden bereikt met andere traditionele analysetechnieken. 8,9 Hoewel de procedures van de chemische analyses ingewikkeld lijken, zijn zij opgenomen in populaire analysetechnieken en niet vergezeld van grote moeilijkheden. Het is belangrijk om nauwkeurige resultaten voor de chemische analyse omdat de resultaten vormen de basis van de geconstrueerde model. In deze studie, RSD (relatieve standaardafwijking) van de HPLC-metingen was ongeveer 1%. Ook moet de basisprocedure, bijv volgen zoals weergegeven in figuur 1, voor de constructie van modellen praktisch toepasbaar.
Eenvoudige en snelle methoden in plaats van HPLC kan worden toegepast voor de chemische analyses. Totale suikergehalte en zuurgraad te meten, respectievelijk met een refractometer(Brix meter) en een pH-meter. De pH differentiële 16,17 geldt voor de meting van totale anthocyanine. Toepassing van de eenvoudige methoden maken modelbouw gemakkelijker hoewel de nauwkeurigheid van waarden voorspeld door het model lager dan die voorspeld door de samengesteld op basis van de HPLC bepaling hier getoonde modellen mogelijk. Niettemin kan de nauwkeurigheid van de samengesteld op basis van eenvoudige chemische analyses modellen praktisch toepasbaar bij productielocaties en het verkeer processen omdat hoge nauwkeurigheden er niet altijd nodig is. De werkwijzen voor de chemische analyse, derhalve is afhankelijk van de nauwkeurigheid die nodig is voor het model worden geconstrueerd.
Hoewel sommige vruchten zoals appel en sinaasappel over het algemeen worden verkocht met gegarandeerde inhoud en zuurgraden suiker, zijn bosbessen niet verkocht met een gegarandeerde kwaliteit. Daardoor de kwaliteit van de commerciële bosbessen doetniet stabiel lijken althans Japan; soms lage kwaliteit blauwe bessen worden verkocht op markten. De niet-destructieve analysemethoden door NIR-spectroscopie hier getoond wordt verwacht dat mogelijk te maken, in principe, de overbrenging en de verkoop van bosbessen met gegarandeerde kwaliteit.
Tenslotte zijn er beperkingen van deze methode. Ten eerste, zoals hierboven vermeld, de bouw van voorspellingsmodellen nogal lastig. Bovendien moet het predictiemodel worden geconstrueerd voor elk gebied en elk teeltjaar omdat het verschil in de hoeveelheden van naast elkaar bestaande componenten (die afhangen van de locatie en het teeltjaar) invloed op de nauwkeurigheid van de voorspelling. Daarom is enige moeite nodig voor het onderhoud van voorspellingsmodellen. Ten tweede, hoewel we hebben aangetoond dat nabij-infrarood spectroscopie is in beginsel toepasbaar voor de kwaliteitscontrole bosbessen, uitrusting en technieken die hier getoond worden alleen gebruikt in het laboratorium en niet van toepassing op productie sitesleiden tot een snelle controle van de grote hoeveelheden bessen bij productielocaties is onmogelijk. Praktische ontwikkeling van geschikte apparatuur en het ontwikkelen van robuuste calibratiemodellen geschikt voor gebruik in productielocaties en het verkeer processen zijn toekomstige richtingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
- Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
- Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
- Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
- Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
- Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
- Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
- Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
- Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
- Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
- Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
- Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
- Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
- Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
- Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
- Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
- Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).
