Introduction
Yakın-kızılötesi (NIR) spektroskopisi yaygın çeşitli meyve içeriğini ve sebze analiz etmek için tahribatsız tekniği olarak uygulanır. 1,2 Tahribatsız garantili nitelikleri ile sadece lezzetli meyve ve sebze nakliye etkinleştirmek NIR spektroskopisi ile analiz eder. NIR spektroskopisi böylece zaten portakal, elma, kavun, kiraz, kivi, mango, papaya, şeftali uygulandı ve böylece toplam şeker içeriği karşılık onların Brix, asitlik, TSC (toplam katı içeriği) bilmek ve . Son zamanlarda, biz. Yaban mersini kalite değerlendirmesine NIR spektroskopisi uygulanmasını bildirmiştir 3 Biz toplam şeker içeriği ve asitlik karşılık gelen toplam organik asit içeriğine değil, aynı zamanda toplam antosiyanin içeriği sadece ölçtük. Antosiyanin insan sağlığını iyileştirmek için inanılır bir biyolojik olarak aktif bir bileşendir. onların şeker içeriği, ac bir güvence ile lezzetli yaban mersini satın alabilirsiniz eğer tüketiciler için uygundurgeçerlik ve antosiyanin içeriği.
Meyve ve sebze NIR emiş spektrumları, sadece geniş emme bantları gözlemlenir. Genelde lif ve nemden dolayı bantlar vardır. bağlı olmayan tahrip hedef çeşitli maddeler çok zayıf bantlar, aynı anda gözlenir birlikte, gözlemlenen bantlar çoğu durumda hedefin özel bileşenlerin spesifik titreşim modları tahsis edilemez. Bu nedenle, Lambert-Beer yasası kullanarak belirli bir bileşenin içeriğini belirlemek için geleneksel teknik NIR spektrumları için etkili değildir. Bunun yerine, kalibrasyon modelleri gözlenen spektrumları ve spektrumları karşılık gelen madde içerikleri arasındaki ilişkiyi inceleyerek Kemometri kullanılarak inşa edilmiştir gözlenen spektrumları hedef bileşenlerinin içeriğini tahmin etmek. 4,5 Burada bir protokol oluşturmak ve modelleri doğrulamak için toplam şeker içeriği tahmininde, toplam organik asit içeriği acidi karşılık gelenty ve NUR spektrumları yaban mersini toplam antosiyanin içeriği sunulmaktadır.
Şekil 1, güvenli ve sağlam bir kalibrasyon modellerini oluşturmak için genel bir akım şemasını göstermektedir. yeterli sayıda örnekleri toplanır. Diğerleri inşa modellerin doğrulanması için kullanılan Bazıları modellerin yapımında kullanılır. Toplanan numunelerin her biri için, bir NIR spektrum ölçülür ve daha sonra hedef bileşenleri geleneksel yıkıcı kimyasal analiz yöntemleri ile kantitatif analiz edilir. Burada, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), şekerler, organik asitler, ve antosiyanin kimyasal analizler için kullanılır. Kısmi en küçük kareler (PLS) regresyon kimyasal tarafından belirlenen gözlenen spektrumları ve madde içerikleri arasındaki ilişki incelendiğinde analizleri kalibrasyon modellerinin yapımı için kullanılır. Sağlam iyi tahmin yeteneği olan modeller, glikozu ve ön terbiye inşa etmek üzereved spektrumları ve tahmini için kullanılan dalga boyu bölgeleri incelenmektedir. Son olarak, inşa modellerinin yeterli tahmin yeteneğini onaylamak için doğrulanır. doğrulama, içeriği kimyasal analizler (gözlenen değerler) tarafından belirlenen içerikler ile karşılaştırılır inşa modeli (tahmin edilen değerler) tarafından gözlenen spektrum öngördü. Yeterli ilişki tahmin ve gözlenen değerler arasındaki bulunamazsa eğer yeterli korelasyon elde edilinceye kadar, kalibrasyon modeli yeniden inşa edilmelidir. Bu şekilde (dış doğrulama) 'de gösterildiği gibi bir model inşası ve doğrulama için numune farklı grupları kullanılması tercih edilir, ancak, aynı gruptaki örnekleri ve diğer araştırma yöntemleri (çapraz validasyon) her iki kullanıldığı zaman sayısı numuneler yeterince büyük değil.
FKalibrasyon modelinin oluşturulması ve onaylanması için ŞEKIL 1. akış şeması. mavi ve yeşil çizgilerle çevrili prosedürler kalibrasyon modeli ve doğrulama inşaatı, sırasıyla gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Numunelerin 1. Koleksiyonu
- Kalibrasyon modeli hedefine dahil edilecek olan çeşitlerin karar verin.
- yeterli sayıda ve hedef çeşitlerinin örnek yaban mersini çeşitli toplayın.
- inşa modelin doğrulanması için tercihen 100 kalibrasyon modelinin oluşturulması için yaban mersini, ve en az 10 toplayın. Güçlü modelleri inşa etmek üzere, çeşitli renk, boyut ve çeşitli olgunlaşma koşulları yani çeşitli örnekleri toplamak.
- Her blueberry tartılır. Not: ölçülen ağırlıklar her yaban mersini maddelerin içeriği yüzde hesaplanması için daha sonra kullanılır.
Spectra 2. Ölçümler
- Isınma ölçümlerden önce spektrofotometre yeterince (en fazla 1 saat) güvenilir spektrumları elde etmek.
- spektrofotometre ayarlayın. koşullar tüm ölçümlerle sabit olduğundan emin olun. birölçümler için tipik koşullar arasında, örneğin, aşağıda verilmiştir.
- 12,500-3,600 cm ölçümlerin aralığını ayarlayın -1.
- 16 cm spektral çözünürlüğü ayarlamak -1.
- 32 kez birikimi ayarlayın.
- Ölçüm modu olarak yaygın yansıma seçin.
- dağınık yansıma ölçümleri için spektrofotometre penceresinde standart reflektör koydu. "Arka plan tek kanal" komutunu kullanarak, otomatik olarak daha sonra ölçülen örnek yaban mersini spektrumları göreli yansıma spektrumları hesaplanmasında kullanılan arka plan spektrumu ölçmek.
- dağınık yansıma ölçümleri için spektrofotometre penceresinden merkezinde bir yaban mersini örneği koyun. "Numune tek kanal" komutunu kullanarak, tercihen meyve birkaç noktada her yaban mersini spektrumları ölçün.
Not: Kubelka-Munk dönüşümü 6,7 da otomatik yapılacaktırÖrnek yaban mersini gözlenen spektrumları için otomatik spektral edinimi durumu bunu ayarlanırsa. Kubelka-Munk dönüşümü, transmisyon modunda ölçüldü ve yüksek doğrulukla spektrumları analiz için gerekli olan eşdeğer spektrumları dağınık yansıtıcılık modunda ölçülmüştür spektrumları değiştirir. Absorbans ölçeğinde Spectra analizler için kullanılır. - yaban mersini numunenin spektrumu birçok noktasında ölçülen halinde MS Excel gibi bir veri işleme programı kullanılarak her numune spektrumları ortalama spektrumunu hesaplayın. analizler için ortalama spektrumunu kullanır.
Şekerler ve Organik Asitlerin 8 HPLC Ölçümleri 3. Ön Arıtma
Not: şu şekilde saf su ile, su içinde çözünür olan şeker ve her yaban mersini, organik asitler, ekstrakte edin. Her bir yaban mersini bütün analizler için kullanılır.
- fo aşağıda -30 ° C hazır dondurucuda yaban mersini tutunonlar sadece spektral ölçümlerden sonra analiz değilse r kimyasal analizler.
- kolayca aşağıdaki adımlardan homojenize böylece çeşitli parçalar halinde yaban mersini kesin. donmuş zaman defrost olmadan blueberry kesin.
- 50 ml'lik bir cam kaba parçaları koyun.
- ca. ekle ultra-saf su behere (ki elektrik iletkenliği en az 0,1 uS / cm damıtılmış su), 10 ml.
- analizler boyunca şekerler dekompoze olabilir enzimlerin etkisiz hale getirilmesi 20 saniye boyunca bir mikrodalga fırın içinde, aşırı saf su içinde kesme böğürtlen ısıtın.
- Behere ca. ultra saf su 10 ml.
- Standart bir şaft ve jeneratör ile donatılmış bir homojenizatör ile 12,000 rpm'de 5 dakika boyunca homojen bir karışım.
- 3000 rpm'de (2,000 x g) 10 dakika süre ile homojenize edilmiş karışım santrifüjleyin.
- Bir 5B kağıt filtre kullanılarak santrifüj numunenin, vakumla süzülerek süzüntü toplanır.
- th iki kez adımlar 3.6-3.9 tekrarlayıne filtrasyon Tortu, bütün şeker ve organik asitler toplamak ve süzüntüler birleştirmek.
- Süzülen maddenin pH'ı ölçün ve seyreltilmiş hidroklorik asit (0.1 ve 0.01 mol L-1) ile 7'ye ayarlamak ve sodyum hidroksit (0.1 ve 0.01 mol L-1) arasında sulu çözeltiler.
- ultra-saf su ile 50 ml'ye filtrat seyreltilir.
- ikiye örnek bölün; şekerlerin analizi ve organik asitlerin analizi için diğer için.
- pigmentleri, katyonlar ve anyonlar dışlamak için seri bağlı sütunların üzerinden ilk örnek çözümü (iki C18, CM ve QMA) geçirin. sütunlarından örnek çözeltinin ilk 1 ml atınız. Sonra HPLC ile şeker analizi için sütunları örnek çözümü kullanın.
- pigmentler ve katyonları dışlamak için seri bağlı sütunlar (iki C18 ve CM) üzerinden ikinci örnek çözümü geçmektedir. sütunlarından örnek çözeltinin ilk 1 ml atınız. Sonra c örnek çözümü kullanmakHPLC ile organik asit analizi için olumns.
- Santrifüj HPLC ile analizden önce, bir mini-santrifüj ile 0.45 um filtre ile donatılmış bir mikro 10 dakika için 6,600 rpm'de (5.800 x g) her adımda 3.14 den çözeltisi ve 3.15.
Şekerler 4. HPLC Ölçümleri
Not: Bu çalışmada, sukroz, glukoz ve her bir yaban mersini fruktoz toplamı içeriği toplam şeker içeriği olarak kabul edilir. Bu nedenle, üç şeker her biri için çalışma eğrisi birinci elde edilir ve daha sonra her bir yaban mersini şekerlerin toplamı içeriği elde edilir. Standart içeriği 0.3-0.4 ağırlıkça% (sakaroz), 3,8-4,8 ağırlık% (glikoz) ve 4,2-5,3 ağırlık% (fruktoz) olarak rapor edilir. 9
- doğru sükroz yaklaşık 200 mg ölçün ve standart bir çözelti hazırlamak için, 50 ml ultra saf su içinde çözülür. İkinci standart çözeltilerin hazırlanması için, aşırı saf su ile 50 ml'ye çözeltisi 5 ml seyreltilir. Benzer üçüncü standı hazırlayınİkinci standart çözeltisinden ard çözüm.
- Benzer şekilde, glikoz ve fruktoz standart çözümler hazırlayın.
- aşağıdaki şekilde HPLC sistemi düzenlemek:
- 40 ° C'de sütun fırın içinde bir jel nüfuziyet sütunu kullanın.
- Taşıma ürününden 0.1 ml / dakika akış oranı ile gazı alınmış, aşırı saf su kullanın.
- bir kırılma endeksi detektörü kullanın.
- her ölçüm için 20 ul tablet enjekte edilerek standart çözümlerin HPLC spektrogramlar ölçün. Not: Burada, PAC solüsyon ölçümü için yazılım olarak kullanılır.
- farenin sağ tuşu ile 'yeniden analiz' tıklayarak her standart solüsyon kromotogramda şeker bandın alan yoğunluğunu alın.
- Alan şiddeti ve konsantrasyon arasındaki ilişkiyi temsil eden denklem fo elde edilir lineer regresyon, her şeker çalışma eğrisini elde etmek için gelen konsantrasyonlarına karşı alan şiddetleri çizilirHer şeker r.
- Her bir ölçüm için, 20 ul tablet enjekte edilerek Örnek çözeltilerin HPLC spektrogramlarda ölçün.
- Daha önce adım 4.5 de tarif edildiği gibi, her numune çözeltisinin kromatogramda şekerlerin bantların alanı yoğunlukları al.
- Adım 4.6 'de elde edilen çalışma eğrileri gelen denklemleri kullanarak çözümler şekerlerin konsantrasyonları elde.
- Önceki adımda ve örnek toplam hacmi elde edilen örnek çözelti konsantrasyonları, her bir yaban mersini, her şeker miktarı elde edilir (50 mi adım 3.12).
- Üç şeker içeriğini özetliyor her meyvenin toplam şeker miktarlarını edinin.
- Adım 1.3 ölçülen ağırlık kullanarak her yaban mersini toplam şeker içeriği yüzde edinin.
Organik Asitlerin 5. HPLC Ölçümleri
Not: Bu çalışmada, sitrik asit, kinik asit toplamı içeriği, malikasit ve süksinik asit toplam organik asit içeriği olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, dört organik asitlerin her biri için çalışma eğrisi birinci elde edilir ve daha sonra her bir yaban mersini organik asit içeriği ölçülmektedir. Standart içeriği 0,42-0,62 ağırlık% (sitrik asit), 0-0,15 ağırlıkça% (kinik asit), 0,08-0,23 ağırlık% (malik asit), ve 0.06-0.25 ağırlıkla% (süksinik asit) olarak rapor edilir. 9
- doğru sitrik asit, yaklaşık 5 mg ölçün ve standart bir çözelti hazırlamak için, 50 ml ultra saf su içine çözülür. İkinci standart çözeltilerin hazırlanması için, aşırı saf su ile 50 ml'ye çözeltisi 5 ml seyreltilir. Benzer İkinci standart solüsyonu üçüncü standart çözeltisi hazırlayın.
- Benzer bir şekilde, kinik asit, malik asit ve sukkinik asit, standart çözelti hazırlayın.
- aşağıdaki şekilde HPLC sistemi düzenlemek:
- 40 ° C'de sütun fırın içinde seri olarak bağlı iki anyon değişim sütunları kullanın.
- Kullanım fosforik% 0.1 sulu çözeltisi gazı alınmışTaşıma ürününden olarak 0.02 ml / dakika akış oranı ile asittir.
- 210 nm'lik bir ultraviyole görünür dedektör grubunu kullanın.
- Her bir ölçüm için, standart çözeltisinin 20 ul kısım enjekte edilerek standart çözeltilerin HPLC spektrogramlarda ölçün.
- farenin sağ tuşu ile 'yeniden analiz' tıklayarak her standart solüsyonun kromatogramında organik asitin bandın alan yoğunluğunu alın.
- Alan şiddeti ve konsantrasyon arasındaki ilişkiyi temsil eden denklem, her organik asit elde edilir lineer regresyon, her organik asit için çalışan eğri almak için gelen konsantrasyonlarına karşı alan şiddetleri çizilir.
- Her bir ölçüm için örnek bir 20 ul kısım enjekte edilerek Örnek çözeltilerin HPLC spektrogramlarda ölçün.
- Adım 5.5'te, daha önce tarif edildiği gibi her bir numune çözeltisi kromatogramda organik asitlerin bantların alanı yoğunlukları alın.
- Adım 5.6 'de elde edilen çalışma eğrileri gelen denklemleri kullanarak çözümler organik asitlerin konsantrasyonları elde edin.
- Önceki adımda ve örnek toplam hacmi elde edilen örnek çözelti konsantrasyonları, her bir yaban mersini, her organik asidin miktarı elde edilir (50 mi adım 3.12).
- Dört organik asit içeriği toplanarak her bir yaban mersini toplam organik asidin miktarı elde edilir.
- Adım 1.3 ölçülen ağırlık kullanarak her yaban mersini toplam organik asit içeriği yüzde edinin.
Antosiyaninlerin HPLC Ölçümleri 6. Tedavi öncesi
- onlar sadece spektral ölçümlerden sonra analiz değilse kimyasal aşağıda -80 ° C hazır dondurucuda yaban mersini tutun analiz eder.
- 12 saat boyunca vakumlu bir liyofilizatör her dondurulmuş meyve kurutun.
- % 1 metanol çözüm o kurutulmuş yaban mersini, antosiyanin Özüf trifloroasetik asit [yaban mersini (g) ağırlıkça çözeltisi / hacim (mi) = 1/10] 12 saat boyunca 4 ° C'de bir buzdolabı içinde karışımın bırakarak.
- Santrifüj C ve 15.000 rpm (21,900 x g) °, bir ultra santrifüj -8 kullanılarak bir 2 mi mikrotüp, 15 dakika boyunca özü.
- HPLC ölçümleri için örnek elde etmek için 0.45 um filtre içinden süzülür.
Antosiyaninlerin 7. HPLC Ölçümleri
Not: Yaklaşık 13 çeşit antosiyaninler yaban mersini yer almaktadır. Tüm antosiyaninler için çalışma eğrileri elde etmek zor olduğundan, sadece siyanidol-3- O-glukosit klorür için bir çalışma eğrisi, yaban mersini bölgesindeki en popüler antosiyaninlerin biri, elde edilir. çalışma eğrisi diğer antosiyaninlerin yaklaşık sayımsal uygulanır.
- PR doğru siyanidin-3- O-glukosit klorür, yaklaşık 1.5 mg ölçün ve trifloroasetik asit% 1 metanol çözeltisi, 10 ml içine çözülürStandart bir çözüm epare. İkinci standart çözeltilerin hazırlanması için trifloroasetik asit,% 1 metanol çözeltisi ile 10 ml çözelti 5 ml seyreltilir. Aynı şekilde, üçüncü ve dördüncü standart solüsyonları sekans hazırlanır.
- aşağıdaki şekilde HPLC sistemi düzenlemek:
- 40 ° C'de sütun fırın içinde bir C18 ters faz kolonu kullanır.
- 0.1 ml / dakika akış oranı ile asetonitril (elute B)% 0.1 sulu trifloroasetik asit (elute A) ve% 0.5 trifloroasetik asit eluatları kullanılarak yapılan gradient yöntemi uygulanır burada% 8 ila% 15 elute B oranında artar 0-50 enjeksiyondan sonra dakika ve enjeksiyondan sonra 50-60 dakika boyunca% 75 ila 15% arasında sırasında.
- 520 nm 'de bir fotodiyot dizisi detektörü izleme kullanın.
- Her bir ölçüm için, 10 ul tablet enjekte edilerek standart çözeltilerin HPLC spektrogramlarda ölçün. "LC Çözüm" ölçümü için yazılım olarak kullanılır.
- bandının alan yoğunluğunu alınfarenin sağ tuşu ile 're-analiz' tıklayarak her standart solüsyon kromotogramda siyanidin-3- O-glukosit klorür.
- Alan şiddeti ve konsantrasyon arasındaki ilişkiyi temsil eden denklem siyanidin-3- O-glukosit klorür elde edilir lineer regresyon ile siyanidin-3- O-glukosit klorür çalışma eğrisini elde etmek için gelen konsantrasyonlarına karşı alan şiddetleri çizilir.
- Her bir ölçüm için, 10 ul tablet enjekte edilerek Örnek çözeltilerin HPLC spektrogramlarda ölçün.
- Daha önce adım 7.4 de tarif edildiği gibi her bir numune çözeltisi kromatogramında her antosiyanin bandı bölgesi yoğunluğu al.
- Adım 7.5 'de elde edilen çalışma eğrisine karşılık gelen denklem kullanılarak çözümleri antosiyaninlerin konsantrasyonları elde.
- Önceki elde edilen konsantrasyon her yaban mersini, her antosiyanin miktarda elde ediliradım adım 6.3 kullanılan numune çözeltisinin toplam hacmi.
- onüç antosiyaninlerin içeriğini özetliyor her yaban mersini içinde antosiyanin toplam tutarı edinin.
- Adım 1.3 ölçülen ağırlık kullanarak her yaban mersini toplam antosiyanin içeriği yüzde edinin.
Madde İçeriği Tahmininde Kalibrasyon Modelleri 8. İnşaat
Not: PLS regresyon, gizli varyantları kullanarak çoklu regresyon tekniğinin bir türüdür 4,5, gözlenen spektrumları ve kimyasal analizlerle belirlenen madde içeriğinden her madde için kalibrasyon modellerinin yapımı için kullanılır. PLS regresyon ticari programlar ile veya ev yapımı programları ile ya gerçekleştirilir. Modellerin yapımı ayrıntılı işlemler için referanslar 5,10 bakın.
- gözlenen spektrumları için ön işlemler doğru en etkili olduğunu incelemek veSağlam tahmin.
- Aşağıdaki ön işlemlerin bir veya iki uygulayarak kalibrasyon modelleri Construct: MSC (Çarpımsal Dağılım Düzeltme), 1,2,5 SNV (Standart Normal Değişken), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalleştirme), COE (Sabit Eliminasyon Ofset ), ve birinci veya SG ile ikinci türev hesaplama (Savitzky-Golay) yöntemi. 1,2,5 inşa modelleri ile kendi spektrumları ayarlanır doğrulama madde içeriğini tahmin edin.
Not: Minimum ve maksimum değerler sırasıyla 0 ve 1, hale böylece MMN olarak, bir spektrum normalize edilir. Minimum değer sıfır olur, böylece COE olarak, bir spektrum ordinatı kaydırılır. - Gözlenen ve gözlenen spektrumları en etkili için ön işlemler hangi incelemek için ayarlanmış doğrulama değerlerini tahmin arasında, kararlılık, R 2, ve kalan tahmini sapma, RPD katsayısı hesaplayın. daha vererek ön işlemlerin kombinasyonu seçinR2 ve RPD.
- Aşağıdaki ön işlemlerin bir veya iki uygulayarak kalibrasyon modelleri Construct: MSC (Çarpımsal Dağılım Düzeltme), 1,2,5 SNV (Standart Normal Değişken), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalleştirme), COE (Sabit Eliminasyon Ofset ), ve birinci veya SG ile ikinci türev hesaplama (Savitzky-Golay) yöntemi. 1,2,5 inşa modelleri ile kendi spektrumları ayarlanır doğrulama madde içeriğini tahmin edin.
- Etkili bölgeleri aramak için, dalgasayısı bölgeler, örneğin uygulayarak doğru ve sağlam tahmini için etkili olan hareketli pencereler PLS tekniği 11 inceleyin.
Not: Prosedür spektrumları tahminler için etkili bilgi içeren veya tahminler müdahale bilgileri içeren dalgasayısı bölgeleri kaldırarak karşılık gelir.
İnşa Kalibrasyon Modellerinin 9. Doğrulama
Not: inşa modellerin geçerliliğinin ayrıntılı işlemler için başvuruları 5,10 bakın.
- Ön işlemlerin ve tahmini için etkili dalgasayısı bölgeleri için en iyi kombinasyonu ile inşa kalibrasyon modelleri ile kendi spektrumları ayarlanır doğrulama madde içeriğini tahmin. 5,10
- Gözlenen ve öngörülen arasındaki R 2 ve RPD hesaplayınDoğrulama setinin değerlerinin. 5,10
- Kalibrasyon modelleri pratik performans, 12,13 R için genel kriterler 2> 0.85 ve RPD> 2.5, memnun olup olmadığını inceleyin. kriterler memnun değilseniz modelin yeniden düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek olarak 70 yaban mersini spektrumları aynı anda gösterilen yaban mersini NIR soğurma spektrumları bir dizi 2 gösterileri Şekil. şekerler, organik asitler, ya da antosiyanin kesinlikle atanabilir bantları NIR spektrumları gözlenen olmadığından, geleneksel Lambert-Beer yasası madde içeriğini ölçmek için geçerli değildir. Bu nedenle, madde içeriğinin tahmininde modellerinin yapımı gereklidir.
Şekil 3 yaban mersini şeker kantitatif analizi için tipik kromatogramlar gösterir. üstten üç paneli, sırasıyla, sukroz, glukoz, fruktoz, standart çözeltilerin kromatogramları bulunmaktadır. Alt panel, bir yaban mersini ekstresi yani Örnek solüsyondan bir kromatogramı göstermektedir. Örnek çözeltisi içinde şekerlerin çeşitleri ve konsantrasyonları bekleme süreleri arasında bilinen birnd gözlenen piklerin alan şiddetleri. Toplam şeker içeriği sakroz, glükoz ve früktoz içeriğinin toplamı olarak elde edilir.
Şekil 4, bir yaban mersini organik asitlerin analizi için kromatogramın bir örneği göstermektedir. standart solüsyon (burada gösterilmeyen) kromatogramları atıfta bulunarak, örnek eriyiği içinde çeşitleri ve organik asitlerin konsantrasyonları bilinmektedir. Şekil efsane gösterilen gözlenen piklerin atamaları için iki tepe standart ve örnek çözümleri Kromatogramlarda kinik asit için gözlenmiştir. Onlar kinik asit izomerleri atanabilir olabilir. Toplam organik asit, sitrik asit, kinik asit, malik asit ve sukkinik asit içerikleri toplamı olarak elde edilir.
Şekil 5, bir yaban mersini antosiyaninlerin analizi için kromatogramın bir örneği göstermektedir. Ayırıcı tekabül eden çok sayıda tepent tür antosiyaninler gözlenir. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, bu antosiyaninleri elüsyon sırası 14,15 bildirildi görüldüğünden, zirveleri ayrı ayrı antosiyaninler atanabilir. Toplam antosiyanin içeriği antosiyanin 13 çeşit içeriğinin toplamı olarak elde edilir.
Kalibrasyon modelleri gözlemlenen spektrumu ile inşa edilir ve kimyasal olarak tespit madde içeriği. Tablo 2, ön işlemlerin incelenmesi bir örneğini göstermektedir. "(Ön) olmadan hiçbiri" dahil olmak üzere altı tip ön işlemler 12,500-3,600 cm-1 sabit bir dalgasayısı bölgede spektrumları kullanılarak toplam şeker içeriğinin kalibrasyon modelinin oluşturulması açısından incelendi. Farklı ön işlemler farklı tahmin performansları ile sonuçlanır. Modelini Performans R2 ve RPD ile değerlendirildi. En iyi Predi verir pretreatments türüction performansı seçilir. Tablo 2'de, ikinci türev hesaplamasından sonra MSC anlamına gelen "İkinci türevi + MSC," olarak, en iyi sonucu verir. Sonra model yapımı için kullanılan dalga sayısı bölgeleri sabit pretreatments ile bölgeler değiştirilerek incelenmiştir.
Şekil örnek olarak Şekil 6 NIR spektroskopi ve HPLC ile belirlenen kişiler tarafından tahmin değerleri arasındaki korelasyon gösterilmiştir toplam şeker içeriği için kalibrasyon modeli, çapraz doğrulama sonucu. Model spektrumlarının "ikinci türevi + MSC" pretreatments olarak ve 8,539-7,775 cm kullanarak -1 bölge ile inşa edilmiştir. Modelin tahmin performansı sadece pratik kullanım için kriterler üzerinde, R2 = 0.85 ve RPD = 2.6 olduğunu. Bu örnekte, model yapımı için kullanılan örnek sayısı cons için çok küçük olan, 30 idiyüksek performanslı modelleri truct.
Şekil örnek olarak 7 gösterileri NIR spektroskopi ve HPLC ile belirlenen kişiler tarafından tahmin değerleri arasındaki korelasyon gösterilmiştir toplam organik asit içeriği için kalibrasyon modeli, çapraz doğrulama sonucu. Modeli "birinci türevinin + MSC" pretreatments olarak ve 7,505-5,446 ve 4,605-4,242 cm -1 spektrumları bölgeleri kullanılarak inşa edilmiştir. Modelin tahmin performansı R2 = 0.92 ve RPD = 3.6, pratik uygulama için yeterli olmasıdır.
Şekil örnek olarak Şekil 8 NIR spektroskopi ve HPLC ile belirlenen kişiler tarafından tahmin değerleri arasındaki korelasyon toplam antosiyanin içeriği için kalibrasyon modeli, dış doğrulama sonucu. modeli "ilk d inşa edilmiştirön olarak erivative "ve 12,489-6,094 ve 4,605-4,242 cm -1 spektrumları bölgeleri kullanarak. modelin tahmin performansı antosiyanin beri. inşa modeli oldukça iyi bir performans gösteren R2 = 0.95 ve RPD = 4.4 olduğu yaban mersini içinde içeriği yüksek değildir, ancak esas olarak yaban mersini Peel, kolayca dağınık yansıtıcılık ölçümleri gözlenmiştir çalışma mevcuttur. Şekil 8'de gösterilen iyi bir performans model yapımı için kullanılan numune çok sayıda (70) ile de neden olacağı .
Yaban mersini Şekil 2. NIR soğurma spektrumları. 70 yaban mersini Spectra aynı anda gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yaban mersini şeker kantitatif analizi için Şekil 3. kromatogramları. (A) sakaroz, (B) glikoz standart solüsyonların Kromatogramlar, (C) fruktoz ve (D) örnek solüsyon bir kromatogram. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Yaban mersini organik asitlerin kantitatif analizi için Şekil 4. kromatogramı. Gözlemlenen tepe sitrik asit (1), malik asit (2), kinik asit (0 ve 3), ve süksinik asit (4). Uygun Please bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.
Şekil yaban mersini antosiyaninlerin kantitatif analiz için 5. kromatogramı. Gözlenen zirveleri Tablo her antosiyanin standart tutma süresi gösterilir 1'de bireysel antosiyaninler atanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NIR spektroskopi tarafından tahmin Şekil 6. toplam şeker içeriği için modelin çapraz doğrulama bir sonuç. Değerler R. HPLC ile belirlenen kişilere karşı çizilir 2 = 0.85 ve RPD 2.6 elde edilir =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. toplam organik asit içeriği için modelin çapraz doğrulama bir sonuç. NIR spektroskopi ile öngörülen değerler HPLC ile belirlenen kişilere karşı çizilmiştir. R2 = 0.92 ve RPD = 3.6 elde edilir. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Şekil 8. toplam antosiyanin içeriği modelin dış doğrulama bir sonuç. NIR spektroskopi ile öngörülen değerler bu d karşı çizilirtarafından etermined HPLC. R2 = 0.95 ve RPD = 4.4 elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| formül | antosiyanin | Temsilci Tutma süresi (dakika) |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidin-3- O-P-galaktozid | 17.3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidin-3- O-glukosit | 19.7 |
| C 21 H 21 O 11 | Siyanidin-3- O-P-galaktozid | 22.8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delfinidin-3- | 23.6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Siyanidin-3- O-glukosit | 24.5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O-P-galaktozid | 28.7 |
| C 20 H 19 O 10 | Siyanidin-3- O -arabinoside | 31.3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O-glukosit | 36.0 |
| Cı 22 saat 23 O 11 | Peonidin-3- O-P-galaktozid | 37.0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidin-3- O -arabinoside | 40.8 |
| Cı 22 saat 23 O 11 | Peonidin-3- O-glukosit | 43.7 |
| C23 H 25 O 12 | Te malvidin-3- O-P-galaktozid | 45.0 |
| C 23 H 25 O 12 | Te malvidin-3- O-glukosit | 49.6 |
Yaban mersini içerdiği Tablo 1. Başlıca antosiyaninler. Bu deneysel koşullar altında HPLC analizinde temsilcisi tutma süreleri de listelenir.
| önişleme | Analiz için kullanılan Dalga sayısı bölgesi (cm-1) | RPD | R2 |
| hiçbiri | 12,500-3,600 | 1.7 | 0.69 |
| ikinci türev | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| ilk türev | 12,500-3,600 | 2.5 | 0.84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0.81 |
| Ikinci türev + MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0.88 |
| İlk türev + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0.87 |
Tablo 2. gözlenen spektrumları pretreatments üzerinde tahmin performansının bağımlılığı incelenmesi. Toplam şeker içeriği tahmininde R2 ve RPD listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokol üzerinde bazı ek yorumlar burada açıklanmıştır. Öncelikle, adım 1.1, hedefe dahil çeşitlerin karar bahsedilmektedir. birçok çeşitler veya çeşitlerinin belirtmeden yaban mersini kapsayan modelleri inşa etmek mümkün olsa da, modelleri ile tahmin doğrulukları bazen tek bir çeşidi için modelleri ile daha sınırlı çeşitlerin için çok daha düşüktür. Ayrıca kalibrasyon modelleri farklı üretim sahalarında hasat yaban mersini tahmin performansını etkileyen farklı özelliklere sahip olduğundan yüksek tahmin performansı elde etmek için her üretim sitesinden yaban mersini için inşa edilmelidir dikkat edilmelidir. 1
İkincisi, adım 2.3, spektrumlarının ölçümleri için yaygın yansıma modunu seçmek için bahsedilmektedir. iletim modu, spektrofotometresinde ölçümleri için hazırlanmıştır. transmisyon modunda ölçüldü spektrumları olmasına rağmen, birkalibrasyon modelleri yapımı için uygun LSO, daha doğru ve daha sağlam bir model çoğu durumda dağınık yansıtıcılık modunda ölçülmüştür spektrumu ile yapılabilir. Toplam organik asit içerikleri geçirgenlik modunda ölçülmüştür spektrumu ile tahmin edilemez. 3
Üçüncü olarak, yaban mersini spektrumları ölçümleri için, yüzey durumu ve kaliks yaklaşık içerikleri diğer konumlarda farklıdır çünkü kaliks Spectra ölçmek için tavsiye edilmez. Bununla birlikte, çanak ve diğer pozisyonda, ölçülen spektrumları geniş bir sayıda kullanarak kalibrasyon modellerini oluşturmak mümkündür. Ancak, modellerin doğrulukları sadece kaliks dışındaki pozisyonlarda ölçülen spektrumları ile inşa modellere göre daha düşük çoğu durumda bulunmaktadır.
Dördüncüsü, yaban mersini bir NIR spektrum sıcaklığına bağlıdır. Bu nedenle, hassas tahmini için ya da imnem li her zaman aynı ortam sıcaklığında spektrumları ölçmek veya sıcaklık değişimi için tazminat ile kalibrasyon modelleri oluşturmak için. 1
Beşincisi, sadece R2 ve RPD burada inşa modellerinin performansını ön terbiye seçme ve değerlendirmek için kullanılmasına rağmen, bu tür SEC (Kalibrasyon Standart Hata), SEP (Tahmin Standart Hata), SECV (Haç Standart Hata gibi diğer bazı değerler -Validation), RMSEP (Root Mean Kare Tahmini hata) ve RMSECV Çapraz Doğrulama (Root Mean Kare hatası) genellikle daha detaylı inceleme için kullanılır. Daha önceki yazıda, örneğin 3, RMSEP ve RMSECV ön terbiye seçme ve inşa modellerinin performansını değerlendirmek için kullanıldı.
yaban mersini toplam şeker, toplam organik asit ve toplam antosiyanin içeriği Tahribatsız tahmini fou oldutahminler için modeller uygun bir şekilde inşa halinde nd mümkün olduğunu. Bu teknik diğer geleneksel analitik tekniklerle elde edilemez tüm hasat olanlardan sadece lezzetli yaban mersini seçimi için geçerlidir. 8,9 kimyasal analiz prosedürleri karmaşık görünse de, bunlar popüler analitik teknikler dahil ve değillerdir büyük zorluklarla eşliğinde. Sonuçlar inşa modelin temeli, çünkü kimyasal analizler için doğru sonuçlar elde etmek için önemlidir. Bu çalışmada, HPLC ölçümleri RSD (nispi standart sapma) yaklaşık% 1 idi. Pratik olarak uygulanamaz model yapımı için, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, örneğin temel prosedür takip etmek de gereklidir.
yerine HPLC basit ve hızlı yöntemler kimyasal analizler için uygulanabilir. Toplam şeker içeriği ve asitlik bir refraktometre ile, sırasıyla, ölçülebilir(Brix metre) ve bir pH ölçer. PH diferansiyel metodu 16,17, toplam antosiyanin içeriğinin ölçümü için geçerlidir. basit yöntemlerle uygulanması modelleri öngördüğü değerlerin doğruluğu Burada gösterilen HPLC ölçümleri temelinde inşa modelleri ile beklenenden daha düşük olabilir, ancak çok daha kolay modellerin inşaat yapmak. Bununla birlikte, basit kimyasal analizleri temelinde inşa modellerin doğruluğu üretim yerleri ve dolaşım süreçlerinin yüksek doğruluk her zaman orada gerekli değildir, çünkü pratik olarak uygulanabilir. Kimyasal analiz yöntemleri, bu nedenle, model inşa edilmesi için gereken hassasiyet göre seçilmelidir.
Böyle elma ve portakal gibi bazı meyveler garantili şeker içeriği ve asitlik genellikle satılmaktadır rağmen, yaban mersini garantili nitelikleri ile satmadığın. Bunun bir sonucu olarak, ticari bir yaban mersini kalitesi deEn azından Japonya'da kararlı görünmüyor; bazen düşük kaliteli yaban mersini pazarlarda satılmaktadır. Burada gösterilen NIR spektroskopi ile tahribatsız analiz yöntemleri prensip, garantili nitelikleri ile sevkiyat ve yaban mersini satışı, olanak sağlaması bekleniyor.
Son olarak, bu yöntem sınırlamalar vardır. yukarıda da belirtildiği gibi Birincisi, tahmin modellerinin yapımı oldukça zahmetli. (Site ve yetiştirme yılı bağlıdır) eşlik eden bileşenlerin miktarları arasındaki fark tahmin doğruluğunu etkiler çünkü Ayrıca, tahmin modeli her site ve tarımı her yıl için inşa edilmelidir. Bu nedenle, bazı çabalar tahmin modelleri bakım için gereklidir. biz yakın-kızılötesi spektroskopi, prensip olarak, yaban mersini kalite kontrolü için uygulanabilir olduğunu göstermiştir rağmen İkincisi, burada gösterilen ekipman ve teknikler sadece laboratuarda kullanılan ve üretim yerlerinde geçerli değildir olmaküretim yerlerinde çilek büyük miktarlarda hızlı bir kontrol mümkün değildir neden olur. uygun ekipman ve üretim yerleri ve dolaşım işlemlerinde kullanıma uygun sağlam kalibrasyon modellerinin geliştirilmesi pratik gelişme gelecek yön vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
- Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
- Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
- Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
- Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
- Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
- Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
- Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
- Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
- Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
- Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
- Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
- Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
- Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
- Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
- Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
- Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).
