Introduction
Nära infraröda (NIR) spektroskopi är i stor utsträckning som en icke-förstörande teknik för att analysera innehållet i frukter och grönsaker av olika slag. 1,2 Oförstörande analyser av NIR-spektroskopi gör det möjligt för leverans av endast läckra frukter och grönsaker med garanterade egenskaper. NIR-spektroskopi har redan använts på apelsin, äpple, melon, körsbär, kiwi, mango, papaya, persika och så vidare för att veta deras Brix som motsvarar den totala sockerhalten, syra, TSC (totalt torrhalt), och så vidare . Nyligen har vi rapporterat att tillämpa NIR-spektroskopi till kvalitetsutvärdering av blåbär. 3 Vi mätte inte bara den totala sockerhalten och det totala innehållet organisk syra motsvarande syra, men även den totala antocyanin innehåll. Antocyanin är en bioaktiv komponent som tros förbättra människors hälsa. Det är bekvämt för konsumenterna om de kan köpa läckra blåbär med en försäkran om deras sockerhalt, acidity och antocyanin-innehåll.
I NIR absorptionsspektra för frukt och grönsaker, är endast breda absorptionsband observeras. De är främst banden på grund av fiber och fukt. Även om många svaga band på grund av olika ingredienser i den icke-Destructed mål observeras samtidigt, kan de observerade banden inte tilldelas särskilda vibrationssätt specifika komponenter i målet i de flesta fall. Därför är den traditionella tekniken för att bestämma halten av en specifik komponent med hjälp av Lambert-Beers lag inte är effektiva för NIR-spektra. I stället för att kalibreringsmodeller förutsäga innehållet i de mottagande komponenterna från de observerade spektra är konstruerade med hjälp av kemometri genom att undersöka sambandet mellan den observerade spektra och ingrediensinnehållet motsvarande spektra. 4,5 Här ett protokoll konstruera och validera modeller för prediktion av den totala sockerhalten, total halt organisk syra motsvarande ACIDITy, och total antocyanin innehållet i blåbär från NIR-spektra presenteras.
Figur 1 visar det allmänna flödesschemat för att konstruera tillförlitliga och robusta kalibreringsmodeller. Prover av tillräckligt antal samlas. Några av dem används för att bygga modeller, medan andra används för validering av de konstruerade modeller. För var och en av insamlade prover, är en NIR-spektrat mäts, och sedan nå de mottagande komponenterna analyseras kvantitativt med traditionella destruktiva kemiska analysmetoder. Här är HPLC (HPLC) användes för de kemiska analyserna av socker, organiska syror och antocyaniner. Partiell minsta kvadrat (PLS) regression används för konstruktion av kalibreringsmodeller där korrelationen mellan den observerade spektra och innehållet ingrediens bestäms av kemiska analyser undersöks. För att konstruera robusta modeller med bästa prognosen förmåga, förbehandlingar av observed-spektra och de våglängdsområden som används för förutsägelse undersöks också. Slutligen konstruerade modeller valideras för att bekräfta sin tillräcklig förutsägelse förmåga. I valideringen innehållet förutspådde från observerade spektrumet av den konstruerade modellen (predikterade värden) jämförs med innehållet bestäms av de kemiska analyserna (observerade värden). Om inte kan hittas tillräckligt samband mellan de förutsagda och observerade värden, kalibreringsmodellen bör rekonstruerat tills tillräcklig korrelation erhålls. Även om det är att föredra att använda olika grupper av prover för konstruktion och validering av en modell som visas i denna figur (extern validering), prover i samma grupp som används både för konstruktion och validering (korsvalidering) när antalet prov är inte tillräckligt stor.
Figure 1. Flödesschema för konstruktion och validering av kalibreringsmodellen. De förfaranden omgiven av blå och gröna linjerna motsvarar respektive till byggandet av en kalibreringsmodell och validering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provtagning
- Bestäm vilka sorter kommer att ingå i målet för kalibreringsmodellen.
- Samla tillräckligt många och olika typer av prov blåbär i målgruppen sorter.
- Samla företrädesvis 100 blåbär för byggandet av kalibreringsmodellen, och åtminstone 10 för validering av den konstruerade modellen. För att konstruera robusta modeller, samla in prover av olika slag, det vill säga med olika färger, storlekar och i olika mognads förhållanden.
- Väga varje blåbär. Obs: Vikterna mäts används senare för beräkning av innehåll procent av ingredienserna i varje blåbär.
2. Mätningar av Spectra
- Warm-up spektrofotometern tillräckligt (mer än 1 timme) innan mätningarna för att få tillförlitlig spektra.
- Ställa in spektrofotometer. Se till att villkoren är konstanta under hela mätningarna. Enexempel på typiska förhållanden för mätning ges nedan.
- Ställa in området av mätningar för att 12,500-3,600 cm -1.
- Ställ den spektrala upplösningen till 16 cm -1.
- Ställ ackumuleringen till 32 gånger.
- Välj diffus reflektans som sättet mätningen.
- Sätt standardreflektorn på fönstret i spektrofotometer för diffusa mätningar reflektions. Genom att använda den "bakgrund enda kanal" kommando, mäta bakgrundsspektrum som automatiskt används för beräkning av relativ reflektionsspektra från spektra av prov blåbär mätt senare.
- Sätt en blåbär provet i mitten av fönstret av spektrofotometern för diffusa mätningar reflektions. Genom att använda "prov enda kanal" kommando, mäta spektra av varje blåbär företrädesvis vid flera punkter av frukten.
Obs: Kubelka-Munk transformations 6,7 kommer också utföras automatiskttiskt för den observerade spektra av prov blåbär om villkoret av spektral förvärvet är inställd att göra det. Kubelka-Munk omvandling förändrar spektra mäts i diffusa reflektionsläge till spektra motsvarar de som uppmätts i sändnings och behövs för analyser av spektra med hög noggrannhet. Spektra i absorbans skala används för analyser. - Beräkna den genomsnittliga spektrum av spektra för varje prov med hjälp av ett databehandlingsprogram som MS Excel om spektra av en blåbär prov mäts vid flera punkter. Använd den genomsnittliga spektrum för analyser.
3. Förbehandling för HPLC Mätningar av sockerarter och organiska syror 8
Notera: Extrahera sockerarter och organiska syror av varje blåbär, som är lösliga i vatten, med ultrarent vatten enligt följande. Hela varje blåbär används för analyser.
- Håll blåbär i en frys under -30 ° C redo for kemiska analyser om de inte analyseras precis efter de spektrala mätningar.
- Skär ett blåbär i flera bitar så att den lätt kan homogeniseras i följande steg. Skär blåbär utan avfrostning när den är frusen.
- Lägg bitarna i en 50 ml bägare.
- Lägga ca. 10 ml ultrarent vatten (destillerat vatten vars elektriska ledningsförmåga är mindre än 0,1 | iS / cm) till bägaren.
- Värm den skurna blåbär i ultrarent vatten i en mikrovågsugn i 20 sekunder för att inaktivera de enzymer som kan sönderdelas sockerarter under analyserna.
- Lägg ca 10 ml ultrarent vatten till bägaren.
- Homogenisera blandningen under 5 min vid 12000 rpm med en homogenisator utrustad med en standardaxel och generator.
- Centrifugera den homogeniserade blandningen under 10 min vid 3000 rpm (2000 x g).
- Samla filtratet genom vakuumfiltrering av det centrifugerade provet med hjälp av en 5B pappersfilter.
- Upprepa steg från 3,6 till 3,9 gånger på the filtreringsrest för att samla alla socker och organiska syror, och kombinera alla filtraten.
- Mäta pH av filtratet och justera det till 7 med utspädd klorvätesyra (0,1 och 0,01 mol L -1) och utspädd vattenlösningar av natriumhydroxid (0,1 och 0,01 mol L -1).
- Späd filtratet till 50 ml med ultrarent vatten.
- Dela upp provet i två; ett för analys av sockerarter och den andra för analys av organiska syror.
- Passera den första provlösningen genom kolonner (två C18, CM och QMA) kopplade i serie för att utesluta pigment, katjoner och anjoner. Kasta bort de första 1 ml av provlösningen från kolonnerna. Använd sedan provlösningen från kolonnerna för analys av sockerarter med hjälp av HPLC.
- Passerar den andra provlösningen genom kolonner (två C18 och CM) kopplade i serie för att utesluta pigment och katjoner. Kasta bort de första 1 ml av provlösningen från kolonnerna. Använd sedan provlösningen från columns för analys av organiska syror med HPLC.
- Centrifugera varje lösning från steg 3.14 och 3,15 vid 6600 rpm (5800 x g), i 10 min i ett mikrorör utrustad med ett 0,45 pm filter med en mini-centrifug innan analys med HPLC.
4. HPLC Mätningar av sockerarter
Obs: I denna studie är summan sackaroshalten, glukos och fruktos i varje blåbär betraktas som den totala sockerhalten. Därför är arbetskurvan för var och en av tre sockerarter som erhålls först, och sedan summan innehållet av det socker i varje blåbär erhålles. Av schabloninnehållet rapporteras som 0,3-0,4 vikt% (sackaros), 3,8 till 4,8 vikt-% (glukos) och 4,2 till 5,3 vikt% (fruktos). 9
- Mäta cirka 200 mg sackaros noggrant, och lös den i 50 ml ultrarent vatten för att framställa en standardlösning. Späd 5 ml av lösningen till 50 ml med ultrarent vatten för att framställa de andra standardlösningarna. Förbereda på liknande sätt den tredje stativetard lösning från den andra standardlösningen.
- Framställa de standardlösningar av glukos och fruktos, på liknande sätt.
- Ordna HPLC-systemet på följande sätt:
- Använda en gelpermeationskolonn i kolumnen ugn vid 40 ° C.
- Använd avgasade ultrarent vatten med flödeshastigheten av 0,1 ml / min som eluatet.
- Använda ett brytningsindexdetektor.
- Mät HPLC spektrogram av standardlösningar genom att injicera en 20 pl alikvot för varje mätning. Obs: Här är PAC lösning används som programvara för mätningen.
- Få området intensiteten hos bandet av socker på kromatogrammet för varje standardlösning genom att klicka på "re-analys" med den högra knappen på musen.
- Plotta intensitet area mot de motsvarande koncentrationerna för att få arbetskurvan för varje socker med den linjära regressionen, där ekvationen som representerar förhållandet mellan arean intensitet och koncentrationen erhålls for varje socker.
- Mät HPLC spektrogram av provlösningar genom att injicera en 20 pl alikvot för varje mätning.
- Få intensiteten hos banden av socker på kromatogrammet för varje provlösning området, som tidigare beskrivits i steg 4,5.
- Erhålla koncentrationerna av socker i de lösningar med hjälp av ekvationerna motsvarar arbetskurvor erhållna i steg 4,6.
- Skaffa mängden av varje socker i varje blåbär utifrån koncentrationen av provlösningen som erhölls i föregående steg och den totala volymen av provlösningen (50 ml, se steg 3,12).
- Erhålla den totala socker mängderna av varje frukt genom att summera innehållet i tre socker.
- Skaffa innehållet procent av det totala socker varje blåbär med vikten mätt i steg 1,3.
5. HPLC Mätning av organiska syror
Notera: I denna studie, summa halt av citronsyra, kininsyra, äppelsyrasyra och bärnstenssyra anses vara den totala halten organisk syra. Därför arbetar kurvan för var och en av fyra organiska syror erhålls först, och därefter innehållet organiska syran i varje blåbär mäts. Av schabloninnehållet rapporteras som 0,42-0,62 vikt% (citronsyra), 0-0,15 vikt-% (kininsyra), 0,08-0,23 vikt% (äppelsyra), och 0,06-0,25 vikt% (bärnstensyra). 9
- Mät cirka 5 mg citronsyra noggrant, och lös det i 50 ml ultrarent vatten för att framställa en standardlösning. Späd 5 ml av lösningen till 50 ml med ultrarent vatten för att framställa de andra standardlösningarna. Förbered liknande den tredje standardlösning från den andra standardlösningen.
- Bered standardlösningar av kininsyra, äppelsyra och bärnstensyra, på liknande sätt.
- Ordna HPLC-systemet på följande sätt:
- Använd två anjonbytande kolonner kopplade i serie i kolumnen ugn vid 40 ° C.
- Användning avgasad 0,1% vattenlösning av fosforsyran med flödeshastighet av 0,02 ml / min eftersom eluatet.
- Använda ett ultraviolettsynligt detektor inställd på 210 nm.
- Mät HPLC spektrogram av standardlösningar genom att injicera en 20 pl portion av standardlösning för varje mätning.
- Få området intensiteten hos bandet av organisk syra på kromatogrammet för varje standardlösning genom att klicka på "re-analys" med den högra knappen på musen.
- Plotta intensitet area mot de motsvarande koncentrationerna för att få arbetskurvan för varje organisk syra genom den linjära regressionen, där ekvationen som representerar förhållandet mellan arean intensitet och koncentrationen erhålles för varje organisk syra.
- Mät HPLC spektrogram av provlösningar genom att injicera en 20 ul alikvot av provet för varje mätning.
- Få intensiteten hos banden av organiska syror på kromatogrammet för varje provlösning-området, som beskrivits tidigare i steg 5,5.
- Erhålla koncentrationerna av de organiska syrorna i lösningar med hjälp av ekvationerna som motsvarar de arbetskurvor erhållna i steg 5,6.
- Erhålla den mängd av varje organisk syra i varje blåbär utifrån koncentrationen av provlösningen som erhölls i det föregående steget och den totala volymen av provlösningen (50 ml, se steg 3,12).
- Erhålla mängden total organisk syra i varje blåbär genom att summera innehållet i de fyra organiska syror.
- Skaffa innehållet procent av den totala organisk syra av varje blåbär med vikten mätt i steg 1,3.
6. Förbehandling för HPLC Mätningar av antocyaniner
- Hålla blåbär i en frys under -80 ° C klar för kemiska analyser om de inte analyseras precis efter de spektrala mätningar.
- Torka varje fryst frukt med en vakuum frystorkning för 12 timmar.
- Extrahera antocyanin från den torkade blåbär i 1% metanollösning of trifluorättiksyra [vikt av blåbär (g) / volym av lösningen (ml) = 10/01] genom att lämna blandningen i kylskåp vid 4 ° C under 12 h.
- Centrifugera extraktet i 15 min i en 2 ml mikrorör med användning av en ultracentrifug vid -8 ° C och 15.000 rpm (21.900 x g).
- Filtrera extraktet genom ett 0,45 um filter för att få provet för HPLC-mätningar.
7. HPLC Mätningar av antocyaniner
Obs: Om 13 slag antocyaniner ingår i blåbär. Eftersom det är svårt att få arbetskurvor för alla antocyaniner, en arbetskurva för endast cyanidin-3-O--glucoside klorid, en av de mest populära antocyaniner i blåbär, erhålles. Arbetskurvan söks ungefärliga kvantifieringar av andra antocyaniner.
- Mäta ca 1,5 mg cyanidin-3-O--glucoside klorid noggrant och lös upp den i 10 ml av 1% metanollösning av trifluorättiksyra till prepare en standardlösning. Späd 5 ml av lösningen till 10 ml med 1% metanollösning av trifluorättiksyra för att framställa de andra standardlösningarna. På liknande sätt förbereda den tredje och den fjärde standardlösningar sekventiellt.
- Ordna HPLC-systemet på följande sätt:
- Använda en C18 omvänd fas-kolonn i en kolonn ugn vid 40 ° C.
- Tillämpa gradientmetoden med användning eluaten av 0,1% vattenhaltig trifluorättiksyra (eluerar A) och 0,5% trifluorättiksyra i acetonitril (eluera B) med flödeshastighet av 0,1 ml / min, där förhållandet mellan eluerade B ökar från 8% till 15% under 0-50 minuter efter injektionen, och från 15% till 75% under 50 till 60 min efter injektionen.
- Använda en fotodiodarraydetektor övervakning vid 520 nm.
- Mät HPLC spektrogram av standardlösningar genom att injicera en 10 pl alikvot för varje mätning. "LC lösning" används som programvara för mätningen.
- Få området intensiteten hos bandet avcyanidin-3-O--glucoside klorid på kromatogrammet för varje standardlösning genom att klicka på "re-analys" med den högra knappen på musen.
- Plotta intensitet area mot de motsvarande koncentrationerna för att få arbetskurvan för cyanidin-3-O--glucoside klorid genom den linjära regressionen, där ekvationen som representerar sambandet mellan området intensitet och koncentrationen erhålles för cyanidin-3-O--glucoside klorid.
- Mät HPLC spektrogram av provlösningar genom att injicera en 10 pl alikvot för varje mätning.
- Få området intensiteten hos bandet av varje antocyanin på kromatogrammet för varje provlösning såsom beskrivits tidigare i steg 7,4.
- Erhålla koncentrationerna av antocyaniner i lösningarna med användning av ekvationen som motsvarar den arbetskurva som erhållits i steg 7,5.
- Erhålla mängderna av varje antocyanin i varje blåbär från koncentrationen som erhölls i föregåendesteg och den totala volymen av provlösningen som används i steg 6,3.
- Erhålla den totala mängden antocyanin i varje blåbär genom att summera innehållet i de tretton antocyaniner.
- Erhålla innehållet procent av den totala antocyanin av varje blåbär med hjälp av vikten som uppmätts i steg 1,3.
8. Konstruktion av kalibreringsmodeller för att förutsäga ingrediens Innehåll
Obs: PLS regression, 4,5 som är en typ av multipel regression teknik med hjälp av latenta varianter, används för konstruktion av kalibreringsmodeller för varje ingrediens från den observerade spektra och ingredienshalter, som bestämts genom kemiska analyser. PLS regression utförs antingen med kommersiella program eller med hemgjorda program. Se referenser 5,10 för de detaljerade processer för byggande av modeller.
- Undersöka vilka förbehandlingar för observerade spektra är mest effektiva för noggrann ochrobust förutsägelse.
- Konstruera kalibreringsmodeller genom att tillämpa en eller två av följande förbehandlingar: MSC (Multiplikativ Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisering), COE (Constant Offset Elimination ), och den första eller andra derivatan beräkningen av SG (Savitzky-Golay) metoden. 1,2,5 Förutspå ingrediens innehållet i validerings in från deras spektra med de konstruerade modeller.
Obs: I MMN, är ett spektrum normaliserad så att lägsta och högsta värden blir 0 och 1, respektive. I COE är ordinatan av ett spektrum förskjutits så att det lägsta värdet blir noll. - Beräkna determinationskoefficienten, R2, och resterande prediktiva avvikelse RPD, mellan den observerade och förutsagda värden för validering inställd att undersöka vilka förbehandlingar för observerade spektra är mest effektiva. Välj en kombination av förbehandlingar ger störreR 2 och RPD.
- Konstruera kalibreringsmodeller genom att tillämpa en eller två av följande förbehandlingar: MSC (Multiplikativ Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard Normal Variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalisering), COE (Constant Offset Elimination ), och den första eller andra derivatan beräkningen av SG (Savitzky-Golay) metoden. 1,2,5 Förutspå ingrediens innehållet i validerings in från deras spektra med de konstruerade modeller.
- Undersöka vilka vågtal regioner är effektiva för noggrann och robust förutsägelse genom att tillämpa, till exempel flytta-fönster PLS teknik 11 för att söka effektiva regionerna.
Obs: Proceduren motsvarar avlägsna vågtalet regioner där spektra innehåller ingen effektiv information för prognoser eller innehåller information som stör förutsägelser.
9. Validering av det konstruerade kalibreringsmodeller
Obs: Se referenser 5,10 för de detaljerade processer validering av konstruerade modeller.
- Förutse ingrediens innehåll validering in från deras spektra med de konstruerade kalibreringsmodeller med den bästa kombinationen av förbehandlingar och vågtalet regioner effektiva för prediktionen. 5,10
- Beräkna R2 och RPD mellan de observerade och förutsagdavärden för validerings set. 5,10
- Undersök om de allmänna kriterierna för det praktiska utförandet av kalibreringsmodeller, 12,13 R2> 0,85 och RPD> 2,5, är uppfyllda. Överväga återuppbyggnaden av modellen om kriterierna inte är uppfyllda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar som ett exempel en uppsättning av NIR-absorption spektra av blåbär där spektra av 70 blåbär visas samtidigt. Eftersom banden definitivt hänförliga till sockerarter, organiska syror, eller antocyaniner inte observeras i NIR-spektra, är traditionell Lambert-Beers lag inte är tillämplig att kvantifiera innehållet ingrediens. Därför är det nödvändigt att bygga modeller för att förutsäga ingrediens innehåll.
Figur 3 visar typiska kromatogram för kvantitativ analys av socker i blåbär. Tre paneler från toppen är respektive kromatogrammen av standardlösningar av sackaros, glukos, och fruktos. Den nedre panelen visar ett kromatogram av en provlösning, det vill säga ett extrakt av ett blåbär. De typer och koncentrationer av socker i provlösningen är kända från de retentionstider ennd intensiteterna hos de observerade topparna i området. Totalt sockerinnehåll erhålls som summan av innehållet sackaros, glukos, och fruktos.
Figur 4 visar ett exempel på kromatogram för analys av organiska syror i ett blåbär. Genom att hänvisa till kromatogrammen för standardlösningen (ej visad här), är den typ och koncentrationer av organiska syror i provlösningen kända. För tilldelningen av de observerade topparna som visas i figuren legenden två toppar observeras för kininsyra i kromatogrammen för standard och provlösningar. De kan vara hänförligt till isomerer av kininsyra. Total halt organisk syra erhålls som summan av citronsyra, kininsyra, äppelsyra, och bärnstenssyra-innehåll.
Figur 5 visar ett exempel på kromatogram för analys av antocyaniner i ett blåbär. Många toppar motsvarande different vänliga antocyaniner observeras. Eftersom storleksordningen elusion för dessa antocyaniner rapporterades 14,15 såsom visas i tabell 1, kan de observerade topparna tilldelas individuella antocyaniner. Totala antocyanin innehåll erhålls som summan av innehållet i 13 typer av antocyaniner.
Kalibreringsmodeller är tillverkade av den observerade spektra och kemiskt bestämda ingrediensinnehåll. Tabell 2 visar ett exempel på en undersökning av förbehandlingar. Sex typ förbehandlingar inklusive "ingen (utan förbehandling)" undersöktes för byggandet av kalibreringsmodellen av den totala sockerhalten med hjälp av spektra på en fast vågtalet regionen 12,500-3,600 cm -1. Olika förbehandlingar resulterar i olika förutsägelse föreställningar. Prestanda modellerna utvärderades med R2 och RPD. Den typ av förbehandlingar som ger bäst PrediInsatser prestanda väljs. I tabell 2, "Andra derivat + MSC," vilket betyder MSC efter andraderivatan beräkningen ger de bästa resultaten. Därefter vågtalet regioner som används för modellbygge undersöks genom att variera regionerna med de fasta förbehandlingar.
Figur 6 visar som ett exempel till följd av kors validering av kalibreringsmodellen för total sockerhalt, där sambandet mellan de värden som förutsagts av NIR-spektroskopi och de bestämdes genom HPLC visas. Modellen konstruerades med "andraderivatan + MSC" som förbehandlingar och använda 8,539-7,775 cm -1 region av spektrat. Förutsägelsen prestanda modellen är R2 = 0,85 och RPD = 2,6, strax ovanför kriterierna för praktisk användning. I detta exempel, antalet prover som används för modellbygge var 30, vilket är för litet för att construct högpresterande modeller.
Figur 7 visar som ett exempel ett resultat av den korsvalidering av kalibreringsmodell för total halt organisk syra, där korrelationen mellan värdena förutsagts av NIR-spektroskopi och de som bestämdes med HPLC visas. Modellen konstruerades med "den första derivatan + MSC" som förbehandlingar och använda 7,505-5,446 och 4,605-4,242 cm -1 regioner spektra. Förutsägelsen prestanda modellen är R2 = 0,92 och RPD = 3,6, som är tillräcklig för den praktiska tillämpningen.
Figur 8 visar som ett exempel ett resultat av extern validering av kalibreringsmodellen för total antocyanin innehåll, med sambandet mellan de värden som förutsagts av NIR-spektroskopi och de bestäms med hjälp av HPLC. Modellen konstruerades med "den första derivative "som förbehandling och använda 12,489-6,094 och 4,605-4,242 cm -1 regioner spektra. Förutsägelse prestanda modellen är R2 = 0,95 och RPD = 4,4, vilket visar ganska goda resultat av det konstruerade modellen. Eftersom antocyanin existerar främst i skal av blåbär, det är lätt observeras med diffus reflektionsmätningar även om dess innehåll i en blåbär är inte hög. det goda resultatet visas i figur 8 skulle orsakas också av stort antal prover (70) som används för modellbygge .
Figur 2. NIR absorptionsspektra för blåbär. Spectra 70 blåbär visas samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kromatogram för kvantitativ analys av socker i blåbär. Kromatogram av standardlösningar (A) sackaros, (B) glukos, (C) fruktos, och (D) ett kromatogram av en provlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kromatogram för den kvantitativa analysen av organiska syror i ett blåbär. Observerade toppar motsvarar citronsyra (1), äppelsyra (2), kininsyra (0 och 3), och bärnstenssyra (4). Pleas klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kromatogram för kvantitativ analys av antocyaniner i blåbär. Observerade toppar tilldelas individuella antocyaniner som anges i tabell 1 där standard retentionstiden för varje antocyanin visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Ett resultat av korsvalidering av modellen för total sockerhalt. Värdena förutsagts av NIR-spektroskopi plottas mot dem bestäms av HPLC. R2 = 0,85 och RPD = 2,6 erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Ett resultat av korsvalidering av modellen för den totala halten organisk syra. Värdena förutsagts av NIR-spektroskopi plottas mot dem bestäms av HPLC. R2 = 0,92 och RPD = 3,6 erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Ett resultat av extern validering av modellen för total antocyanin innehåll. Värdena förutsagts av NIR-spektroskopi plottas mot de determined av HPLC. R2 = 0,95 och RPD = 4,4 erhålls. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Formel | antocyanin | Representativ Retentionstid (min) |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidin-3-O--galactoside | 17,3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidin-3-O--glucoside | 19,7 |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3-O--galactoside | 22,8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delfinidin-3- | 23,6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidin-3-O--glucoside | 24,5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3-O--galactoside | 28,7 |
| C 20 H 19 O 10 | Cyanidin-3-O--arabinoside | 31,3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3-O--glucoside | 36,0 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3-O--galactoside | 37,0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidin-3-O--arabinoside | 40,8 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3-O--glucoside | 43,7 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidin-3-O--galactoside | 45,0 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidin-3-O--glucoside | 49,6 |
Tabell 1. Stora antocyaniner som finns i blåbär. De representativa retentionstider i HPLC-analysen enligt föreliggande experimentella betingelser är också listade.
| förbehandling | Vågtal område som används för analys (cm -1) | RPD | R 2 |
| Ingen | 12,500-3,600 | 1,7 | 0,69 |
| andraderivatan | 12,500-3,600 | 2,6 | |
| första derivatan | 12,500-3,600 | 2,5 | 0,84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2,3 | 0,81 |
| Andraderivatan + MSC | 12,500-3,600 | 2,8 | 0,88 |
| Första derivatan + MSC | 12,500-3,600 | 2,7 | 0,87 |
Tabell 2. En undersökning av beroendet av förutsägelse prestanda på förbehandlingar av den observerade spektra. R2 och RPD för förutsägelse av den totala sockerhalten listas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Några ytterligare kommentarer om protokollet beskrivs här. För det första, i steg 1,1, nämns det att besluta om sorter som ingår i målet. Även om det är möjligt att konstruera modeller täcker blåbär från många sorter eller utan att ange sorter, de förutsägelse noggrannhet med modellerna är ibland mycket lägre än de med de modeller för en enda sort och för begränsade sorter. Det bör också noteras att kalibrerings modeller bör konstrueras för blåbär från varje produktionsanläggning för att få hög förutsägelse prestanda eftersom blåbär skördas vid olika produktionsanläggningar har olika egenskaper som påverkar förutsägelse prestanda. 1
För det andra, i steg 2,3, nämns det att välja den diffus reflektans läge för mätningarna av spektra. Läget transmissionen är också förberedd för mätningar på spektrofotometer. Även spektra mäts i sändnings är enLSO tillgängliga för konstruktion av kalibreringsmodeller, kan mer exakta och mer robusta modeller konstrueras med spektra mäts i diffus reflektans läget i de flesta fall. Den totala organiska syrahalter kan inte förutsägas med spektra mäts i transmittans läget. 3
För det tredje, för mätning av spektra av blåbär, är det inte rekommenderat att mäta spektra på blomfoder eftersom ytan tillstånd och innehållet runt fodret skiljer sig från dem vid andra positioner. Trots detta är det möjligt att konstruera kalibreringsmodeller med användning av ett rikligt antal spektra mättes vid både blomfoder och andra positioner. Men noggrannheten hos modellerna är i de flesta fall lägre än de modeller konstruerade med spektra mäts bara på andra platser än blomfoder positioner.
För det fjärde, en NIR-spektrat hos blåbär beror på temperaturen. Därför antingen det är im för exakt förutsägelsetigt att alltid mäta spektra vid samma omgivningstemperatur eller att konstruera kalibreringsmodeller med kompensation för temperaturvariationer. 1
För det femte, även om endast R2 och RPD används för att välja förbehandlingar och bedöma resultatet av konstruerade modeller här, några andra värden som SEC (standardfel av Calibration), september (standardfel av Prediction), SECV (standardfel Cross -Validation), RMSEP (Root Mean Square Error av Prediction), och RMSECV (Root Mean Square error av korsvalidering) används vanligen för mer detaljerad granskning. I vår tidigare papper, tre till exempel RMSEP och RMSECV användes för att välja förbehandlingar och bedöma resultatet av konstruerade modeller.
Oförstörande förutsägelse av total sockerhalt, total organisk syra, och den totala antocyanin innehållet i en blåbär var found att vara möjligt om modeller för förutsägelser är konstruerade på rätt sätt. Denna teknik kan tillämpas för val av endast läckra blåbär från alla skördade sådana, som inte kan uppnås med andra traditionella analytiska tekniker. 8,9 Även om förfarandena för de kemiska analyserna kan verka komplicerat, ingår de i populära analysteknik och är inte åtföljs av stora svårigheter. Det är viktigt att få exakta resultat för de kemiska analyserna eftersom resultaten är grunden för den konstruerade modellen. I denna studie, RSD (relativ standardavvikelse) av HPLC-mätningar var cirka 1%. Det är också nödvändigt att följa det grundläggande förfarandet, t ex som visas i Figur 1, för byggandet av praktiskt användbara modeller.
Enkla och snabba metoder i stället för HPLC kan användas för de kemiska analyserna. Totalt sockerinnehåll och surhet kan mätas, respektive, med en refraktometer(Brix meter) och en pH-mätare. PH differensmetod 16,17 är tillämplig för mätning av den totala antocyanin innehåll. Tillämpning av de enkla metoder gör konstruktionen av modeller mycket lättare även om noggrannheten av värden förutsagda av de exemplar kan vara lägre än de som förutsagts av modellerna konstruerats på grundval av de HPLC-mätningar som visas här. Icke desto mindre kan noggrannheten hos modellerna byggda på grundval av enkla kemiska analyser vara praktiskt tillämpbart på produktionsanläggningar och cirkulationsprocesser eftersom höga noggrannhet inte alltid behövs där. Metoderna för kemiska analyser, därför bör väljas i enlighet med de noggrann behövs för modeller som ska byggas.
Även om vissa frukter som äpple och apelsin säljs i allmänhet med garanterad innehåll och surhetsgrader socker, har blåbär inte sålts med garanterade egenskaper. Som ett resultat, kvaliteten på de kommersiella blåbär görinte verkar stabil åtminstone i Japan; ibland låg kvalitet blåbär säljs på marknader. De icke-förstörande analysmetoder av NIR-spektroskopi visas här förväntas möjliggöra, i princip, transporten och försäljningen av blåbär med garanterade egenskaper.
Slutligen finns det begränsningar med denna metod. För det första, såsom nämnts ovan, är konstruktionen av förutsägelsemodeller ganska besvärlig. Dessutom bör förutsägelse modell konstrueras för varje plats och varje odlingsåret eftersom skillnaden i mängderna av samexisterande komponenter (som beror på platsen och odlingsåret) påverkar precisionen i förutsägelsen. Därför behövs en viss ansträngning för underhåll av prognosmodeller. För det andra, även om vi har visat att nära infraröd spektroskopi är i princip gäller för kvalitetskontrollen av blåbär, utrustning och tekniker som visas här är endast används i laboratoriet och inte tillämplig på produktionsanläggningar varaorsaka en snabb kontroll av de stora mängderna av bär vid produktionsanläggningar är omöjligt. Praktisk utveckling av lämplig utrustning och utveckling av robusta kalibreringsmodeller som lämpar sig för användning i produktionsanläggningar och cirkulationsprocesser framtida riktningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
- Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
- Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
- Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
- Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
- Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
- Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
- Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
- Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
- Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
- Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
- Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
- Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
- Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
- Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
- Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
- Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).
