Introduction
В ближней инфракрасной области (БИК) спектроскопии широко применяется в качестве неразрушающего метода анализа содержания фруктов и овощей различных видов. 1,2 Неразрушающий анализ с помощью БИК - спектроскопии позволяют отгрузку только вкусных фруктов и овощей с гарантированными свойствами. БИК-спектроскопии уже применяется к апельсин, яблоко, арбуз, вишня, киви, манго, папайя, персик и так далее, чтобы знать их Брикса, что соответствует общему содержанию сахара, кислотность, TSC (всего содержание твердого вещества), и так далее , Недавно мы сообщали о применении NIR спектроскопии для оценки качества черники. 3 Мы измерили не только общее содержание сахара и общее содержание органической кислоты , соответствующей кислотности, но и общее содержание антоцианов. Антоцианин является биоактивный компонент, который, как полагают, улучшить здоровье человека. Это удобно для потребителей, если они могут купить вкусные черники с гарантией их содержания сахара, ACidity и антоцианов содержание.
В спектрах поглощения БИК фруктов и овощей, наблюдаются только широкие полосы поглощения. Они, в основном, полосы из-за волокна и влаги. Хотя многие слабые полосы из-за различных ингредиентов, не уничтоженного мишени наблюдаются одновременно, наблюдаемые полосы не могут быть отнесены к конкретным колебательными модами конкретных компонентов мишени в большинстве случаев. Таким образом, традиционный метод для определения содержания конкретного компонента с использованием закона Ламберта-Бера не является эффективным для спектров БИК. Вместо калибровки моделей для прогнозирования содержания целевых компонентов из наблюдаемых спектров , построенных с использованием хемометрики путем изучения корреляции между наблюдаемыми спектрами и содержание ингредиентов , соответствующих спектров. 4,5 Здесь протокол для построения и проверки моделей для прогнозирования общего содержания сахаров, общее содержание органических кислот, соответствующих ACIDIти, а также общее содержание антоцианов черники из NIR-спектров представлена.
На рисунке 1 показана общая блок - схему для построения надежных и надежные калибровки моделей. Образцы достаточного количества собираются. Некоторые из них используются для построения моделей в то время как другие используются для проверки построенных моделей. Для каждого из собранных образцов, спектр БИК измеряется, а затем целевые компоненты анализируют количественно с традиционными методами деструктивных химического анализа. Здесь, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для химического анализа сахаров, органических кислот, и антоцианы. Частичные наименьших квадратов (БВР) регрессии используется для построения калибровочных моделей, где анализ рассматривается корреляция между наблюдаемыми спектрами и содержанием ингредиентов, определенной химической. Для того чтобы построить надежные модели с лучшей способностью прогнозирования, предварительной обработки obserвед спектры и области длин волн, используемых для прогнозирования также рассматриваются. Наконец, построенные модели проверяются, чтобы подтвердить их достаточную способность прогнозирования. В проверке, содержание предсказывается из наблюдаемого спектра с помощью построенной модели (предсказанные значения) сравниваются с содержанием определенных химических анализов (наблюдаемые значения). Если достаточная корреляция не может быть найден между предсказанными и наблюдаемыми значениями, модель калибровки должна быть реконструировано до тех пор, пока не будет получено достаточное корреляции. Хотя предпочтительно использовать разные группы образцов для построения и проверки модели, как показано на этом рисунке (внешней проверки), образцы в одной и той же группы используются как для построения и валидации (проверки кросс), когда число образцы не является достаточно большим.
Figure 1. Блок - схема для построения и проверки модели калибровки. Процедуры в окружении синих и зеленых линий соответствуют, соответственно, к построению модели калибровки и ее проверки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор образцов
- Решите, какие культурные сорта растения будут включены в целевой модели калибровки.
- Собрать достаточное количество и различные типы образцов черники целевых сортов.
- Собрать предпочтительно 100 чернику для построения модели калибровки, и, по меньшей мере, 10 для проверки построенной модели. Для того чтобы построить надежные модели, собирают образцы различных типов, т.е. с различными цветов, размеров, и при различных условиях созревания.
- Взвесить каждую чернику. Примечание: Веса, измеренные в дальнейшем используются для расчета процентного содержания ингредиентов каждого голубики.
2. Измерения спектров
- Разминка спектрофотометр достаточно (более 1 ч) перед измерениями, чтобы получить надежные спектры.
- Установите спектрофотометр. Убедитесь в том, что условия являются постоянными на всем протяжении измерений.Пример типичных условий измерений приведена ниже.
- Установите диапазон измерений до 12,500-3,600 см -1.
- Установите спектральное разрешение 16 см -1.
- Установите накопление в 32 раза.
- Выберите диффузного отражения в качестве режима измерения.
- Поместите стандартный отражатель на окне спектрофотометра для измерения диффузного отражения. С помощью команды "фоновый" одноканальный, измерить фоновый спектр, который автоматически используется для расчета относительных спектров отражения от спектров образцов черники, измеренной позже.
- Поместите образец черники в центре окна спектрофотометра для измерения диффузного отражения. С помощью команды "образца одного канала", измерять спектры каждого голубики предпочтительно в нескольких точках плода.
Примечание: Кубелка-Мунка преобразование 6,7 также будет выполняться автоматическийчески для наблюдаемых спектров образцов голубика, если условие спектрального приобретения устанавливается сделать это. преобразование Кубелка-Мунка изменяет спектров, измеренных в режиме диффузного отражения в спектрах эквивалентные тем, которые измеряются в режиме передачи, и необходим для анализа спектров с высокой точностью. Спектры в шкале оптической плотности используются для анализа. - Вычислить средний спектр спектров каждого образца с использованием программы обработки данных, таких как MS Excel, если спектры образца черники измеряются в нескольких точках. Используйте усредненный спектр для анализа.
3. Предварительная обработка для ВЭЖХ измерений сахаров и органических кислот 8
Примечание: Извлечение сахара и органические кислоты каждого черника, которые растворимы в воде, сверхчистой водой следующим образом. Весь каждого черника используется для анализа.
- Держите чернику в морозильной камере ниже -30 ° C готовый FOR химических анализов, если они не анализируются только после того, как спектральных измерений.
- Вырезать голубики на несколько частей, поэтому он может быть легко гомогенизируют в следующих шагах. Вырезать чернику без размораживания, когда она замерзает.
- Поместите кусочки в химический стакан на 50 мл.
- Добавить ок 10 мл сверхчистой воды (дистиллированная вода, которой электропроводность меньше 0,1 мкСм / см) в мензурку.
- Нагреть отрезанный чернику в сверхчистой воде в микроволновой печи в течение 20 секунд, чтобы дезактивировать ферменты, которые могут разлагаться сахара во время анализа.
- Добавить приблизительно 10 мл сверхчистой воды в стакан.
- Перемешать смесь в течение 5 мин при 12000 оборотах в минуту с помощью гомогенизатора, оснащенного стандартной валом и генератором.
- Центрифуга гомогенизированной смеси в течение 10 мин при скорости 3000 оборотов в минуту (2000 & bull; g).
- Сбор фильтрата с помощью вакуумной фильтрации центрифугированной пробы с использованием бумажного фильтра 5В.
- Повторите шаги 3,6-3,9 раза по наце осадок после фильтрации, чтобы собрать все сахара и органические кислоты, и объединить все фильтратов.
- Измеряют рН фильтрата и регулировать его до 7 разбавленной хлористоводородной кислотой (0,1 и 0,01 моль · л -1) и разбавленные водные растворы гидроксида натрия (0,1 и 0,01 моль · л -1).
- Развести фильтрата до 50 мл сверхчистой воды.
- Разделите выборку на две; один для анализа сахаров, а другой для анализа органических кислот.
- Пропускают первый образец раствора через колонки (два С18, CM и QMA), соединенных последовательно, чтобы исключить пигменты, катионы и анионы. Выбросьте первые 1 мл раствора образца из колонн. Затем используют раствор образца из колонок для анализа сахаров с помощью ВЭЖХ.
- Пропускают второго образца раствора через колонки (два С18 и КМ), соединенных последовательно, чтобы исключить пигменты и катионы. Выбросьте первые 1 мл раствора образца из колонн. Затем используйте раствор образца из Columns для анализа органических кислот с помощью ВЭЖХ.
- Центрифуга каждое решение с шагом 3,14 и 3,15 при 6,600 оборотах в минуту (5,800 & bull; g), в течение 10 мин в микропробирки, снабженной фильтром 0,45 мкм с мини-центрифуге перед анализом методом ВЭЖХ.
4. ВЭЖХ Измерения Sugars
Примечание: В данном исследовании содержание сумма сахарозы, глюкозы и фруктозы каждого голубики рассматривается как общее содержание сахара. Таким образом, рабочая кривая для каждого из трех сахаров получается, а затем содержание сумма сахаров в каждом голубики получается. Стандартные материалы представлены в виде 0,3-0,4% мас (сахароза), 3.8-4.8% по весу (глюкоза) и 4.2-5.3% мас (фруктоза). 9
- Мера около 200 мг сахарозы точно, и растворить его в 50 мл сверхчистой воды для приготовления стандартного раствора. Разбавляют 5 мл раствора до 50 мл сверхчистой воды для приготовления второго стандартных решений. Аналогичным образом готовят третью позициюARD раствор из второго стандартного раствора.
- Подготовка стандартных растворов глюкозы и фруктозы, аналогичным образом.
- Расположить систему ВЭЖХ следующим образом:
- Используйте колонку для гель-проникающей в колонку печи при 40 ° C.
- Используйте дегазированной сверхчистой воды с расходом 0,1 мл / мин в качестве элюата.
- Использование детектора показателя преломления.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы стандартных растворов путем инъекции 20 мкл аликвоты для каждого измерения. Примечание: В данном РАС решение используется в качестве программного обеспечения для измерения.
- Получить интенсивности площадь полосы сахара на хроматограмме каждого стандартного раствора, нажав кнопку "повторный анализ" с правой кнопкой мыши.
- Участок интенсивности ПЛОЩАДЬЮ соответствующие концентрации, чтобы получить рабочую кривую для каждого сахара с помощью линейной регрессии, где уравнение, представляющее соотношение между интенсивностью областью и концентрации получают FOг каждый сахар.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы растворов образцов путем инъекции 20 мкл аликвоты для каждого измерения.
- Получить интенсивности площадь из полос сахаров на хроматограмме каждого раствора образца, как описано выше в шаге 4.5.
- Получить концентрации сахаров в растворах с использованием уравнений, соответствующих рабочему кривых, полученных на шаге 4.6.
- Получить количество каждого сахара в каждом голубики от концентрации раствора образца, полученного на предыдущей стадии, и общий объем раствора образца (50 мл, см этап 3.12).
- Получить общее количество сахара каждого плода путем суммирования содержания трех сахаров.
- Получить содержание процента от общего сахара каждого голубики, используя вес, измеренный на этапе 1.3.
5. ВЭЖХ измерения органических кислот
Примечание: В данном исследовании содержание сумма лимонной кислоты, хинной кислоты, яблочнойкислота, янтарная кислота и рассматриваются как общее содержание органических кислот. Таким образом, рабочая кривая для каждого из четырех органических кислот получают первый, а затем содержание органических кислот в каждом голубики измеряется. Стандартные материалы представлены в виде 0.42-0.62% мас (лимонная кислота), 0-0,15 мас% (хинной кислоты), 0.08-0.23 мас% (яблочной кислоты), и 0.06-0.25 мас% (янтарная кислота). 9
- Мера около 5 мг лимонной кислоты точно, и растворить его в 50 мл сверхчистой воды для приготовления стандартного раствора. Разбавляют 5 мл раствора до 50 мл сверхчистой воды для приготовления второго стандартных решений. Аналогичным образом готовят третьего стандартного раствора из второго стандартного раствора.
- Готовят стандартные растворы хинной кислоты, яблочной кислоты и янтарной кислоты, аналогичным образом.
- Расположить систему ВЭЖХ следующим образом:
- С помощью двух анионообменных колонок, соединенных последовательно в колонку печи при 40 ° C.
- Использование дегазированной 0,1% -ного водного раствора фосфорнойкислоты со скоростью потока 0,02 мл / мин в качестве элюата.
- Используйте набор детекторов ультрафиолетовой и видимой при 210 нм.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы стандартных растворов путем инъекции 20 мкл аликвоты стандартного раствора для каждого измерения.
- Получить интенсивности площадь полосы органической кислоты на хроматограмме каждого стандартного раствора, нажав кнопку "повторный анализ" с правой кнопкой мыши.
- Участок интенсивности ПЛОЩАДЬЮ соответствующие концентрации, чтобы получить рабочую кривую для каждой органической кислоты, с помощью линейной регрессии, где уравнение, представляющее соотношение между интенсивностью областью и концентрации определяется для каждой органической кислоты.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы растворов образцов путем инъекции 20 мкл аликвоты пробы для каждого измерения.
- Получить интенсивности по площадям полос органических кислот на хроматограмме каждого раствора пробы, как описано выше на стадии 5.5,
- Получить концентрации органических кислот в растворах с использованием уравнений, соответствующих рабочему кривым, полученным на шаге 5.6.
- Получить количество каждой органической кислоты, в каждом из голубики концентрации раствора образца, полученного на предыдущей стадии, и общий объем раствора образца (50 мл, см этап 3.12).
- Получить количество общей органической кислоты в каждой голубики путем суммирования содержание четырех органических кислот.
- Получить содержание процентов от общей органической кислоты каждого голубики, используя вес, измеренный на этапе 1.3.
6. Предварительная обработка для ВЭЖХ измерений антоцианов
- Хранить чернику в морозильной камере ниже -80 ° С готовым для химических анализов, если они не анализируются только после того, как спектральных измерений.
- Сушат каждый замороженные фрукты с вакуумной лиофилизации в течение 12 ч.
- Экстракт антоцианов из высушенного черники в 1% раствор в метаноле OF трифторуксусной кислоты [вес черники (г) / объем раствора (мл) = 1/10], оставляя смесь в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 12 часов.
- Центрифуга экстракт в течение 15 мин в 2 мл микропробирок с использованием ультрацентрифуге при -8 ° С и 15000 оборотов в минуту (21900 & bull; g).
- Фильтр экстракта через фильтр с размером 0,45 мкм, чтобы получить образец для измерений ВЭЖХ.
7. ВЭЖХ Измерение антоцианового
Примечание: Около 13 вид антоцианы включены в чернике. Так как трудно получить рабочие кривые для всех антоцианы, рабочая кривая только цианидин-3- хлорида O -glucoside, один из самых популярных антоцианов в чернике, получается. Рабочая кривая применяется для приближенного количественными других антоцианов.
- Мера около 1,5 мг цианидин-3- O хлорида -glucoside точно, и растворяют его в 10 мл 1% раствора метанола трифторуксусной кислоты в прepare стандартное решение. Разбавляют 5 мл раствора до 10 мл 1% раствора метанола трифторуксусной кислоты для получения второго стандартного решения. Аналогичным образом, подготовить третий и четвертый стандартные решения последовательно.
- Расположить систему ВЭЖХ следующим образом:
- С помощью колонны с обратной фазой С18 в колонне печи при 40 ° C.
- Применение градиентного метода с использованием элюатов 0,1% -ной водной трифторуксусной кислоты (элюирования) и 0,5% -ной трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (элюирования В) со скоростью потока 0,1 мл / мин, где соотношение элюирования B возрастает с 8% до 15% в течение 0-50 мин после инъекции и от 15% до 75% в течение 50-60 мин после инъекции.
- С помощью мониторинга матричного детектора фотодиод при длине волны 520 нм.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы стандартных растворов путем инъекции 10 мкл аликвоты для каждого измерения. "LC-решение" используется в качестве программного обеспечения для измерения.
- Получить интенсивности площадь полосыцианидин-3- хлорид O -glucoside на хроматограмме каждого стандартного раствора, нажав кнопку "Повторный анализ" с правой кнопкой мыши.
- Участок интенсивности площадь против соответствующих концентраций , чтобы получить рабочую кривую для цианидин-3- хлорида O -glucoside линейной регрессии, где уравнение , представляющее зависимость между интенсивностью площади и концентрации получают для цианидин-3- хлорида O -glucoside.
- Измерение с помощью ВЭЖХ спектрограммы растворов образцов путем инъекции 10 мкл аликвоты для каждого измерения.
- Получить интенсивность площади полосы каждого антоцианов на хроматограмме каждого раствора пробы, как описано ранее на шаге 7.4.
- Получить указаны концентрации антоцианов в растворах с использованием уравнения, соответствующего рабочей кривой, полученной на стадии 7.5.
- Получение количества каждого антоцианов в каждой голубики от концентрации, полученного на предыдущейшаг и общий объем раствора образца, используемого на стадии 6.3.
- Получить общее количество антоцианов в каждой голубики путем суммирования содержания тринадцати антоцианов.
- Получить содержание процента от общего антоцианов каждого голубики, используя вес, измеренный на этапе 1.3.
8. Построение градуировочных моделей для прогнозирования Ингредиент Содержание
Примечание: PLS регрессии, 4,5 , который является своего рода метод множественного регрессионного с использованием латентных вариантов, используется для построения калибровочных моделей для каждого ингредиента из наблюдаемых спектров и содержания ингредиентов , определенных химических анализов. PLS регрессии осуществляется либо с коммерческими программами или с самодельными программами. Смотри рекомендации 5,10 для детальных процессов построения моделей.
- Изучение, которое для предварительной обработки наблюдаемых спектров являются наиболее эффективными для точной инадежный прогноз.
- Построить калибровки моделей путем применения одного или двух из следующих предварительных обработок: MSC (мультипликативный Scatter коррекции), 1,2,5 SNV (Стандартная нормальная случайная величина), 1,2,5 MMN (Min-Max нормировки), COE (Constant Offset Устранение ), а также метод первой или второй производной расчет по SG (Савицкого-Голея). 1,2,5 Прогнозировать содержание ингредиента набор подтверждающих данных из их спектров с построенных моделей.
Примечание: В ММН, спектр нормирован так, чтобы минимальное и максимальное значения становятся равными 0 и 1 соответственно. В COE, ордината спектра смещается так, чтобы минимальное значение становится равным нулю. - Вычислить коэффициент детерминации, R 2, и остаточного предиктивного отклонения, РПД, между наблюдаемыми и предсказанные значения проверки , установленного для рассмотрения которых предварительная обработка для наблюдаемые спектры являются наиболее эффективными. Выберите сочетание предварительной обработки, дающих большеR 2 и РПД.
- Построить калибровки моделей путем применения одного или двух из следующих предварительных обработок: MSC (мультипликативный Scatter коррекции), 1,2,5 SNV (Стандартная нормальная случайная величина), 1,2,5 MMN (Min-Max нормировки), COE (Constant Offset Устранение ), а также метод первой или второй производной расчет по SG (Савицкого-Голея). 1,2,5 Прогнозировать содержание ингредиента набор подтверждающих данных из их спектров с построенных моделей.
- Исследовать которых волновое число областей эффективны для точного и надежного прогнозирования , путем применения, например, перемещающим и окна PLS технику 11 искать эффективные регионы.
Примечание: Эта процедура соответствует удаления областей волновых чисел, где спектры не содержат информацию для эффективного предсказания или содержат информацию, которая мешает с предсказаниями.
9. Проверка Построенная калибровки моделей
Примечание: ссылки см 5,10 для детальных процессов проверки построенных моделей.
- Предсказать ингредиент содержимое проверки набора из их спектров с построенных градуировочных моделей с лучшей комбинацией предварительной обработки и для волнового числа областей эффективных для прогнозирования. 5,10
- Вычислить R 2 и RPD между наблюдаемым и прогнозируемымзначения множества валидации. 5,10
- Выяснить , имеются ли общие критерии для практического выполнения калибровки моделей, 12,13 R 2> 0,85 и РПД> 2,5, удовлетворены. Рассмотрим реконструкцию модели, если критерии не будут удовлетворены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показано в качестве примера набор спектров поглощения БИК голубика , где спектры 70 черники показаны одновременно. Так как полосы определенно назначаемые до сахаров, органических кислот, или антоцианов не наблюдаются в спектрах NIR, закон традиционного Ламберта-Бера не применяется для количественного определения содержания ингредиентов. Таким образом, построение моделей для прогнозирования ингредиента содержание необходимо.
На рисунке 3 показаны типичные хроматограммы для количественного анализа сахаров в чернике. Три панели из верхней, соответственно, хроматограммы стандартных растворов сахарозы, глюкозы, фруктозы и. На нижней панели показана хроматограмма раствора образца, то есть экстракт черники. Виды и концентрации сахаров в растворе образца известны из времен удерживанияй интенсивности площадь наблюдаемых пиков. Общее содержание сахара получается как сумма содержания сахарозы, глюкозы, фруктозы и.
На рисунке 4 показан пример хроматограммы для анализа органических кислот в голубики. Ссылаясь на хроматограммах стандартного раствора (не показан), видов и концентраций органических кислот в растворе образца известны. Для назначений наблюдаемых пиков, показанных на рисунке легенде, два пика наблюдаются для хинной кислоты в хроматограммах стандартных и растворов образцов. Они могут быть присваиваемые изомеров хинной кислоты. Общее содержание органических кислот получают в виде суммы лимонной кислоты, хинной кислоты, яблочной кислоты, и содержание янтарной кислоты.
На рисунке 5 показан пример хроматограммы для анализа антоцианов в голубики. Многие пики, соответствующие differeнаблюдаются нт вид антоцианы. Так как порядок уклонения для этих антоцианов сообщалось 14,15 , как показано в таблице 1, наблюдаемые пики могут быть отнесены к отдельным антоцианов. Общее содержание антоцианов получается как сумма содержимого 13 видов антоцианинов.
Модели калибровки построены из наблюдаемых спектров и химически определяли содержание ингредиента. В таблице 2 приведен пример рассмотрения предварительной обработки. Шесть типов предварительной обработки не включая "нет (без предварительной обработки)" были рассмотрены для построения калибровочной модели общего содержания сахаров с использованием спектров при фиксированном волновом области 12,500-3,600 см -1. Различные виды предварительной обработки, приводят к различным характеристик прогнозирования. Представления моделей были оценены с R 2 и РПД. Тип предварительной обработки, что дает лучший prediпроизводительность фикция выбрана. В таблице 2, "второй производной + MSC" , что означает MSC после того, как второй производной вычисления, дает наилучшие результаты. Тогда волновое число областей, используемые для построения модели рассматриваются путем изменения областей с фиксированными предварительной обработки.
На рисунке 6 показан в качестве примера в результате перекрестной проверки модели калибровки для общего содержания сахара, где показана корреляция между значениями , предсказанными БИК - спектроскопии и тех , которые определены с помощью ВЭЖХ. Модель была построена с "второй производной + MSC" , как и предварительной обработки с использованием 8,539-7,775 см -1 области спектра. Эффективность предсказания модели R 2 = 0,85 и РПД = 2,6, чуть выше критериев для практического использования. В этом примере число выборок, используемых для построения модели был 30, который слишком мал, чтобы минусыtruct высокопроизводительных моделей.
На рисунке 7 показана в качестве примера в результате перекрестной проверки модели калибровки для общего содержания органических кислот, где показана корреляция между значениями , предсказанными БИК - спектроскопии и тех , которые определены с помощью ВЭЖХ. Модель была построена с "первой производной + MSC" , как и предварительной обработки с использованием 7,505-5,446 и 4,605-4,242 см -1 областей спектров. Эффективность предсказания модели R 2 = 0,92 и РПД = 3.6, которые достаточны для практического применения.
На рисунке 8 показан в качестве примера в результате внешней проверки модели калибровки для общего содержания антоцианов, с корреляции между значениями , предсказанными БИК - спектроскопии и тех , которые определены с помощью ВЭЖХ. Модель была построена с "первой дerivative " в качестве предварительной обработки и использования 12,489-6,094 и 4,605-4,242 см -1 областей спектров. Производительность предсказания модели R 2 = 0,95 и РПД = 4.4, который показывает достаточно хорошую производительность построенной модели. Так как антоцианов существует в основном в кожуре черники, это легко заметить с результатами измерений диффузного отражения , хотя его содержание в чернике не высока. хорошая производительность показано на рисунке 8 будет вызвано также большого количества образцов (70) , используемой для построения модели ,
Рисунок 2. Спектры поглощения БИК черники. Спектры 70 черники показаны одновременно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. хроматограммы для количественного анализа сахаров в чернике. Хроматограммы стандартных растворов (А) сахарозы, (B) глюкозы, (С) фруктоза, и (D) хроматограмма раствора образца. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра большая версия этой фигуры.
Рисунок 4. Хроматограмма для количественного анализа органических кислот в голубики. Наблюдаемые пики соответствуют лимонной кислоты (1), яблочная кислота (2), хинной кислоты (0 и 3), и янтарной кислоты (4). PLEаза нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Хроматограмма для количественного анализа антоцианов в голубики. Наблюдаемые пики присваиваются отдельным антоцианы , перечисленных в таблице 1 , где показано стандартное время удерживания для каждого антоцианов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Результат перекрестной проверки модели для общего содержания сахара. Значения , предсказанные БИК - спектроскопии приведены в отношении тех , определяли с помощью ВЭЖХ. R 2 = 0,85 и РПД = 2,6 получаются. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Результат перекрестной проверки модели для общего содержания органических кислот. Значения , предсказанные БИК - спектроскопии приведены в отношении тех , определяли с помощью ВЭЖХ. R 2 = 0,92 и РПД = 3.6 получены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Результат внешней проверки модели для общего содержания антоцианов. Значения , предсказанные NIR спектроскопии нанесены против тех гetermined с помощью ВЭЖХ. R 2 = 0,95 и РПД = 4.4 получены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| формула | антоциан | Представитель Время удерживания (мин) |
| C 21 H 21 O 12 | Делфинидин-3- O галактозид | 17.3 |
| C 21 H 21 O 12 | Делфинидин-3- O -glucoside | 19,7 |
| C 21 H 21 O 11 | Цианидин-3- O галактозид | 22,8 |
| C 20 H 19 O 11 | Делфинидин-3- | 23,6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Цианидин-3- O -glucoside | 24.5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O галактозид | 28,7 |
| C 20 H 19 O 10 | Цианидин-3- O -arabinoside | 31,3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidin-3- O -glucoside | 36,0 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3- O галактозид | 37,0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidin-3- O -arabinoside | 40,8 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidin-3- O -glucoside | 43,7 |
| C 23 H 25 O 12 | Мальвидин-3- O галактозид | 45,0 |
| C 23 H 25 O 12 | Мальвидин-3- O -glucoside | 49,6 |
Таблица 1. Основные антоцианы , содержащиеся в чернике. Представительные времена удерживания в ВЭЖХ - анализа в нынешних условиях эксперимента также перечислены.
| предварительная обработка | Волновое область используется для анализа (см -1) | РПД | R 2 |
| Никто | 12,500-3,600 | 1.7 | 0,69 |
| Вторая производная | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| Первая производная | 12,500-3,600 | 2.5 | 0,84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0,81 |
| Вторая производная + MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0,88 |
| Первая производная + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0,87 |
Таблица 2. Исследование зависимости производительности прогнозирования на предварительной обработки наблюдаемых спектров. R 2 и РПД для предсказания общего содержания сахаров перечислены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Некоторые дополнительные замечания по протоколу описаны здесь. Во-первых, на этапе 1.1, упоминается, чтобы решить культурные сорта, включенные в цель. Несмотря на то, что можно построить модели, охватывающие чернику из многих культурных сортов или без указания культурных сортов, то точность предсказания с моделями иногда значительно ниже, чем те, с моделями для одного сорта и для ограниченных культурных сортов. Следует также отметить , что модели калибровки должны быть сконструированы для чернику из каждой производственной площадке , чтобы получить высокую производительность прогнозирования , поскольку черника заготовленные на различных производственных участках имеют различные характеристики , которые влияют на характеристики предсказания. 1
Во-вторых, на этапе 2.3, упоминается, чтобы выбрать режим диффузного отражения для измерения спектров. Режим передачи также подготовлен для измерений на спектрофотометре. Хотя спектры, измеренные в режиме передачи являютсяРБП доступны для построения калибровочных моделей, более точные и более надежные модели могут быть построены с спектров, измеренных в режиме диффузного отражения в большинстве случаев. Валовое содержание органических кислот , не могут быть предсказаны с спектров , измеренных в режиме пропускания. 3
В-третьих, для измерений спектров черники, не рекомендуется измерять спектры в чашечки, так как состояние поверхности и содержимое вокруг чашечки отличаются от тех, в других местах. Тем не менее, можно построить калибровочные модели, используя достаточное количество спектров, измеренных на обоих чашечка и других позиций. Тем не менее, точностей моделей в большинстве случаев являются более низкими, чем у моделей, построенных с спектров, измеренных только на других, чем чашечка позиции.
В-четвертых, БИК спектр голубики, зависит от температуры. Поэтому для точного предсказания либо это имВАЖН , чтобы всегда измерять спектры при той же температуре окружающей среды , или для построения калибровочных моделей с компенсацией изменения температуры. 1
В- пятых, хотя только R 2 и РПД используются для выбора предварительной обработки и оценки эффективности построенных моделей здесь, некоторые другие ценности , такие как SEC (Стандартная ошибка калибровки), SEP (стандартная ошибка прогноза), SECV (Стандартная ошибка Креста -Validation), RMSEP (Mean Square Root ошибка Prediction), и RMSECV (Root Mean Square ошибка кросс-валидация), как правило , используются для более детального изучения. В нашей предыдущей статье 3, например, RMSEP и RMSECV были использованы для выбора предварительной обработки и оценки эффективности построенных моделей.
Неразрушающий прогнозирование общего сахара, общей органической кислоты и общего содержания антоцианов в чернике был Fouй возможным, если модели для предсказания построены правильно. Этот метод применим для выбора только вкусные черники от всех добываемых из них, которые не могут быть достигнуты с другими традиционными аналитическими методами. 8,9 Хотя процедуры химического анализа может показаться сложным, они включены в популярных аналитических методов и не являются сопряжено с большими трудностями. Важно, чтобы получить точные результаты для химических анализов, потому что результаты являются основой построенной модели. В этом исследовании, ОСБ (относительное стандартное отклонение) измерений для ВЭЖХ составляла около 1%. Кроме того , необходимо соблюдать основные процедуры, например , как показано на рисунке 1, для построения практически применимых моделей.
Простые и быстрые методы вместо ВЭЖХ могут быть применены для химических анализов. Общее содержание сахара и кислотность может быть измерена, соответственно, с помощью рефрактометра(Метр Brix) и рН-метр. Значение рН дифференциальный метод 16,17 применим для измерения общего содержания антоцианов. Применение простых методов делают построение моделей намного проще, хотя точность значений, предсказываемых моделей может быть ниже, чем предсказывали модели, построенные на основе измерений ВЭЖХ, показанных здесь. Тем не менее, точность моделей, построенных на основе простых химических анализов могут быть практически применимы на производственных площадках и циркуляционных процессов, потому что высокие точность не всегда нужны там. Методы химического анализа, таким образом, следует выбирать в соответствии с точностей, необходимых для моделей, которые будут построены.
Хотя некоторые фрукты, такие как яблоко и апельсин продаются в основном с гарантированным содержанием сахара и кислотностью, черника не были проданы с гарантией качества. В результате, качество коммерческих черники делаетне кажутся стабильными по крайней мере, в Японии; иногда низкие голубика качества продаются на рынках. Неразрушающему аналитические методы Нир-спектроскопии показано здесь, как ожидается, позволит, в принципе, отгрузки и продажи черники с гарантированными свойствами.
И, наконец, существуют ограничения этого метода. Во-первых, как уже упоминалось выше, построение моделей прогнозирования весьма хлопотное. Кроме того, модель прогнозирования должна быть построена для каждого сайта, и каждый год выращивания, поскольку разница в количестве компонентов сосуществующих (которые зависят от места и года выращивания) влияет на точность прогнозирования. Таким образом, некоторые усилия необходимы для поддержания моделей прогнозирования. Во-вторых, хотя мы показали, что в ближней инфракрасной спектроскопии, в принципе, применим для проверки качества черники, оборудование и методы, показанные здесь, используются только в лаборатории и не применяется на производственных площадках бытьвызывают быструю проверку большого количества ягод на производственных площадках невозможно. Практическая разработка соответствующего оборудования и разработке надежных градуировочных моделей, пригодных для использования в производственных объектах и процессах циркуляции являются будущие направления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
- Ozaki, Y., McClure, W. F., Christy, A. A. Near-infrared Spectroscopy in Food Science and Technology. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Sun, D. W. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. , Academic Press. New York. (2009).
- Bai, W., Yoshimura, N., Takayanagi, M. Quantitative analysis of ingredients of blueberry fruits by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 22, 357-365 (2014).
- Hasegawa, T. Chemometrics in infrared spectroscopic analysis. In: Introduction to Experimental Infrared Spectroscopy. Tasumi, M. , John Wiley & Sons. Chichester. 97-113 (2015).
- Varmuza, K., Filzmoser, P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. , CRC Press. Boca Raton. (2009).
- Kubelka, P. New contributions to the optics of intensely light-scattering materials. Part I. J. Opt. Soc. Am. 38, 448-457 (1948).
- Juang, R. H., Storey, D. E. Quantitative determination of the extent of neutralization of carboxylic acid functionality in carbopol 974P NF by diffuse reflectance fourier transform infrared spectrometry using Kubelka-Munk function. Pharm Res. 15, 1714-1720 (1998).
- Ogiwara, I., Ohtsuka, Y., Yoneda, Y., Sakurai, K., Hakoda, N., Shimura, I. Extraction method by water followed by microwave heating for analyzing sugars in strawberry fruits. J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 68, 949-953 (1999).
- Che, J., Suzuki, S., Ishikawa, S., Koike, H., Ogiwara, I. Fruit ripening and quality profile of 64 cultivars in three species of blueberries grown in Tokyo. Hort. Res. (Japan). 8, 257-265 (2009).
- Pomerantsev, A. L. Chemometrics in Excel. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2014).
- Jiang, H. J., Berry, R. J., Siesler, H. W., Ozaki, Y. Wavelength Interval Selection in Multicomponent spectral analysis by moving window partial least-squares regression with applications to mid-infrared and near-infrared spectroscopic data. Anal. Chem. 74, 3555-3565 (2002).
- Edney, M. J., Morgan, J. E., Williams, P. C., Campbell, L. D. Analysis of feed barley by near infrared reflectance spectroscopy. J. Near-Infrared Spectrosc. 2, 33-41 (1994).
- Mathison, G. W., et al. Prediction of composition and ruminal degradability characteristics of barley straw by near infrared reflectance spectroscopy. Can. J. Anim. Sci. 79, 519-523 (1999).
- Chiara, F., et al. Analysis of anthocyanins in commercial fruit juices by using nano-liquid chromatography electrospray-mass spectrometry and high performance liquid chromatography with UV-vis detector. J. Separation Sci. 34, 150-159 (2011).
- Li, Q., et al. Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China. Food Chemistry. 132, 759-765 (2013).
- Sinelli, N. Evaluation of quality and nutraceutical content of blueberries (Vaccinium corymbosum L.) by near and mid-infrared spectroscopy. Postharvest Biol. Technol. 50, 31-36 (2008).
- Giusti, M. M., Wrolsted, R. E. Anthocyanins: characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wrolstad, R. E., Schwartz, S. J. , John Wiley & Sons. New York. 1-13 (2001).
