Introduction
Proche infrarouge (NIR) est largement appliquée comme une technique non destructive pour analyser le contenu de fruits et légumes de toutes sortes. 1,2 Nondestructive analyse par spectroscopie NIR permettre à l'expédition de seulement délicieux fruits et légumes avec des qualités garanties. La spectroscopie NIR a déjà été appliquée à l'orange, pomme, melon, cerise, kiwi, mangue, papaye, pêche et ainsi de suite pour connaître leur Brix qui correspond à la teneur totale en sucre, acidité, TSC (solides totaux contenus), et ainsi de suite . Récemment, nous avons signalé l'application de la spectroscopie NIR à l'évaluation de la qualité des bleuets. 3 Nous mesurée non seulement la teneur totale en sucre et la teneur totale en acide organique correspondant à l' acidité, mais aussi la teneur en anthocyanes totale. L'anthocyanine est un composant bioactif qui est censé améliorer la santé humaine. Il est commode pour les consommateurs s'ils peuvent acheter de délicieux bleuets avec une assurance de leur teneur en sucre, acidité et teneur en anthocyanes.
Dans les spectres d'absorption NIR de fruits et légumes, seules des bandes d'absorption larges sont observés. Ils sont principalement les bandes dues à la fibre et de l'humidité. Bien que de nombreuses bandes faibles en raison de divers ingrédients de la cible non-destructed sont observées en même temps, les bandes observées ne peuvent pas être attribués à des modes vibratoires spécifiques des composants spécifiques de la cible dans la plupart des cas. Par conséquent, la technique traditionnelle pour déterminer la teneur d'un composant spécifique en utilisant la loi de Beer-Lambert est pas efficace pour les spectres NIR. Au lieu de cela, des modèles d'étalonnage pour prédire la teneur des composants à partir des spectres observés cibles sont construits à l' aide de la chimiométrie , en examinant la corrélation entre les spectres observés et le contenu de l' ingrédient correspondant aux spectres 4,5. Ici, un protocole de construire et de valider les modèles pour la prédiction de la teneur totale en sucre, teneur totale en acide organique correspondant à Acidity, et la teneur en anthocyanes totale de bleuets de spectres NIR est présenté.
La figure 1 montre l'organigramme général pour construire des modèles d'étalonnage fiables et robustes. Des échantillons de nombre suffisant sont collectés. Certains d'entre eux sont utilisés pour la construction de modèles, tandis que les autres sont utilisés pour la validation des modèles construits. Pour chacun des échantillons prélevés, un spectre proche infrarouge est mesurée, et ensuite les composants cibles sont analysés quantitativement par des méthodes d'analyse chimique destructive traditionnelles. Ici, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est utilisée pour les analyses chimiques des sucres, des acides organiques et des anthocyanines. Moindres carrés partiels (PLS) regression est utilisé pour la construction de modèles d'étalonnage, où la corrélation entre les spectres observés et les teneurs en ingrédients déterminée par des analyses chimiques est examinée. Afin de construire des modèles robustes avec la meilleure capacité de prédiction, les prétraitements de obserLes spectres vés et les régions de longueurs d'onde utilisées pour la prédiction sont également examinés. Enfin, les modèles construits sont validés pour confirmer leur capacité de prédiction suffisante. La validation, le contenu prédit à partir du spectre observé par le modèle de construction (valeurs prédites) sont comparées aux teneurs déterminées par les analyses chimiques (valeurs observées). Si la corrélation suffisante ne peut pas être trouvé entre les valeurs prédites et observées, le modèle d'étalonnage doit être à nouveau réalisée jusqu'à ce que la corrélation suffisante soit obtenue. Bien qu'il soit préférable d'utiliser différents groupes d'échantillons pour la construction et la validation d'un modèle, comme indiqué sur cette figure (de validation externe), les échantillons d'un même groupe sont utilisés aussi bien pour la construction et la validation (validation croisée) lorsque le nombre d' échantillons ne sont pas assez grand.
Figure 1. Diagramme pour la construction et la validation du modèle d'étalonnage. Les procédures entourées par des lignes bleues et vertes correspondent, respectivement, à la construction d'un modèle d'étalonnage et sa validation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
1. Prélèvement des échantillons
- Décidez quels cultivars seront inclus dans la cible du modèle d'étalonnage.
- Collecter nombre suffisant et divers types de bleuets échantillons des cultivars cibles.
- Recueillir de préférence 100 bleuets pour la construction du modèle d'étalonnage, et au moins 10 pour la validation du modèle construit. Afin de construire des modèles robustes, prélever des échantillons de divers types, soit avec différentes couleurs, tailles, et à diverses conditions de maturation.
- Peser chaque bleuet. Remarque: les poids mesurés sont utilisés ultérieurement pour le calcul de la teneur pour cent des ingrédients de chaque bleuet.
2. Les mesures des spectres
- Warm-up spectrophotomètre suffisamment (plus de 1 h) avant que les mesures pour obtenir des spectres fiables.
- Réglez le spectrophotomètre. Assurez-vous que les conditions sont constantes tout au long des mesures. Unexemple de conditions typiques pour la mesure est donnée ci-dessous.
- Définissez la plage de mesures à 12,500-3,600 cm -1.
- Réglez la résolution spectrale de 16 cm -1.
- Réglez l'accumulation à 32 fois.
- Sélectionner réflectance diffuse comme mode de mesure.
- Placez le réflecteur standard sur la fenêtre du spectrophotomètre pour les mesures de réflectance diffuse. En utilisant le "canal unique de fond" de commande, mesurer le spectre de fond qui est automatiquement utilisé pour le calcul des spectres de réflectance par rapport à partir des spectres de bleuets de l'échantillon mesuré plus tard.
- Mettez un échantillon de bleuets dans le centre de la fenêtre du spectrophotomètre pour les mesures de réflectance diffuse. En utilisant la commande "canal échantillon unique», de mesurer les spectres de chaque myrtille de préférence à plusieurs points du fruit.
Remarque: Kubelka-Munk transformation 6,7 sera également effectuée automatiquement pour les spectres observés de bleuets de l'échantillon si la condition d'acquisition spectrale est définie pour le faire. la transformation de Kubelka-Munk modifie les spectres mesurés en mode de réflexion diffuse aux spectres équivalentes à celles mesurées dans le mode de transmission et qui est nécessaire pour l'analyse des spectres avec une grande précision. Spectra à l'échelle d'absorbance sont utilisés pour les analyses. - Calculer le spectre moyen du spectre de chaque échantillon à l'aide d'un programme de traitement de données tel que MS Excel si les spectres d'un échantillon de bleuet sont mesurées en plusieurs points. Utilisez le spectre en moyenne pour les analyses.
3. Prétraitement pour les mesures de CLHP de sucres et d' acides organiques 8
Remarque: extraire les sucres et les acides organiques de chaque bleuet, qui sont solubles dans l'eau, avec de l'eau ultra-pure de la manière suivante. L'ensemble de chaque bleuet est utilisé pour les analyses.
- Gardez les bleuets dans un congélateur en dessous de -30 ° C prêt foanalyse r chimique si elles ne sont pas analysées juste après les mesures spectrales.
- Couper un bleuet en plusieurs morceaux afin qu'il puisse être facilement homogénéisée dans les étapes suivantes. Couper la myrtille sans décongélation quand il est gelé.
- Mettez les morceaux dans un bêcher de 50 ml.
- Ajouter ca. 10 ml d'eau ultra-pure (eau distillée dont la conductivité électrique est inférieure à 0,1 pS / cm) dans le bêcher.
- Chauffer la myrtille de coupe dans l'eau ultrapure dans un four à micro-ondes pendant 20 secondes pour désactiver les enzymes qui pourraient décomposer les sucres pendant les analyses.
- Ajouter environ 10 ml d'eau ultra pure dans le bécher.
- Homogénéiser le mélange pendant 5 minutes à 12 000 tours par minute avec un homogénéisateur équipé d'un arbre standard et le générateur.
- Centrifuger le mélange homogénéisé pendant 10 minutes à 3000 tours par minute (2000 x g).
- Recueillir le filtrat par filtration sous vide de l'échantillon centrifugé en utilisant un filtre en papier 5B.
- Répétez les étapes 3.6-3.9 à deux reprises sur efiltration e résidu pour recueillir tous les sucres et les acides organiques, et de combiner tous les filtrats.
- Mesurer le pH du filtrat et de l' ajuster à 7 avec de l' acide chlorhydrique dilué (0,1 et 0,01 mol L -1) , et des solutions aqueuses diluées d'hydroxyde de sodium (0,1 et 0,01 mol L -1).
- On dilue le filtrat à 50 ml avec de l'eau ultrapure.
- Diviser l'échantillon en deux; une pour l'analyse des sucres et l'autre pour l'analyse des acides organiques.
- Passer la première solution d'échantillon à travers des colonnes (deux C18, CM, et AMQ) connectés en série afin d'exclure des pigments, des cations et des anions. Jeter les premiers 1 ml de la solution d'échantillon à partir des colonnes. Ensuite, utilisez la solution d'échantillon à partir des colonnes pour l'analyse des sucres par HPLC.
- Passer la seconde solution échantillon à travers des colonnes (deux CM) et C18 connectés en série pour éliminer les pigments et les cations. Jeter les premiers 1 ml de la solution d'échantillon à partir des colonnes. Ensuite, utilisez la solution de l'échantillon de la columns pour l'analyse des acides organiques par HPLC.
- Centrifuger chaque solution à partir des étapes 3,14 et 3,15 à 6.600 tours par minute (5,800 x g) pendant 10 min dans un micro-tube équipé d'un filtre de 0,45 pm avec une mini-centrifugeuse avant l'analyse par HPLC.
4. Les mesures HPLC des sucres
Remarque: Dans cette étude, la teneur en somme de saccharose, le glucose et le fructose de chaque myrtille est considérée comme la teneur totale en sucre. Par conséquent, la courbe de fonctionnement pour chacun des trois sucres est obtenu en premier, puis la teneur en somme des sucres dans chaque bleuet est obtenu. Le contenu standard sont rapportés comme 0,3 à 0,4% en poids (saccharose), 03.08 à 04.08% en poids (glucose) et 4,2 à 5,3% en poids (fructose). 9
- Mesurer environ 200 mg de saccharose avec précision, et le dissoudre dans 50 ml d'eau ultrapure pour préparer une solution standard. Diluer 5 ml de la solution à 50 ml avec de l'eau ultra pure pour préparer les solutions de deuxième standard. Préparer de manière similaire à la troisième positionsolution ard de la deuxième solution étalon.
- Préparer des solutions étalons de glucose et de fructose, de la même manière.
- Disposer le système HPLC comme suit:
- Utiliser une colonne de perméation de gel dans le four à colonne à 40 ° C.
- Utiliser de l'eau ultra pure dégazée avec le débit de 0,1 ml / min comme éluat d'écoulement.
- Utiliser un détecteur d'indice de réfraction.
- Mesurer les spectrogrammes CLHP des solutions étalons par injection d'une aliquote de 20 ul pour chaque mesure. Remarque: ici, le PAC est utilisée comme solution de logiciel pour la mesure.
- Obtenez l'intensité de la bande de sucre sur le chromatogramme de chaque solution standard de la zone en cliquant sur «ré-analyse» avec le bouton droit de la souris.
- Tracer les intensités de la zone contre les concentrations correspondantes pour obtenir la courbe de travail pour chaque sucre par la régression linéaire, où l'équation représentant la relation entre l'intensité de la zone et la concentration est obtenue for chaque sucre.
- Mesurer les spectrogrammes HPLC des solutions d'échantillon par injection d'une aliquote de 20 ul pour chaque mesure.
- Obtenir les intensités des bandes de sucres sur le chromatogramme de chaque solution d'échantillon de la zone, comme décrit précédemment à l'étape 4.5.
- Obtenir les concentrations des sucres dans les solutions en utilisant les équations correspondant aux courbes de fonctionnement obtenues à l'étape 4.6.
- Obtenir la quantité de chaque sucre dans chaque bleuet à partir des concentrations de la solution d'échantillon obtenue dans l'étape précédente, et le volume total de la solution d'échantillon (50 ml, voir l'étape 3.12).
- Obtenir les quantités totales de sucre de chaque fruit en additionnant le contenu des trois sucres.
- Obtenir le pour cent de la teneur en sucre totale de chaque bleuet en utilisant le poids mesuré à l'étape 1.3.
5. Mesures de CLHP d'acides organiques
Nota: Dans cette étude, la teneur en somme de l'acide citrique, l'acide quinique, l'acide maliquel'acide et l'acide succinique sont considérés comme la teneur totale en acide organique. Par conséquent, la courbe de travail pour chacun des quatre acides organiques, on obtient d'abord, puis la teneur en acide organique dans chaque myrtille est mesurée. Le contenu standard sont rapportés comme 0,42 à 0,62% en poids (acide citrique), de 0 à 0,15% en poids (acide quinique), 0,08 à 0,23% en poids (acide malique) et de 0,06-0,25% en poids (acide succinique). 9
- Mesurer environ 5 mg d'acide citrique avec précision, et le dissoudre dans 50 ml d'eau ultrapure pour préparer une solution standard. Diluer 5 ml de la solution à 50 ml avec de l'eau ultra pure pour préparer les solutions de deuxième standard. Préparer de même la troisième solution standard à partir de la deuxième solution étalon.
- Préparer les solutions étalons de l'acide quinique, l'acide malique et l'acide succinique, de la même manière.
- Disposer le système HPLC comme suit:
- Utiliser deux colonnes échangeuses d'anions connectés en série dans le four à colonne à 40 ° C.
- L'utilisation dégazé une solution aqueuse à 0,1% d'acide phosphoriqued'acide avec la vitesse de 0,02 ml / min comme éluat d'écoulement.
- Utilisez un détecteur de jeu ultraviolet-visible à 210 nm.
- Mesurer les spectrogrammes CLHP des solutions étalons par injection d'une aliquote de 20 ul de solution étalon pour chaque mesure.
- Obtenez l'intensité de la bande d'acide organique sur le chromatogramme de chaque solution standard de la zone en cliquant sur «ré-analyse» avec le bouton droit de la souris.
- Tracer les intensités de la zone par rapport aux concentrations correspondantes pour obtenir la courbe de travail pour chaque acide organique, par régression linéaire, lorsque l'équation représentant la relation entre l'intensité de la région, et la concentration est obtenue pour chaque acide organique.
- Mesurer les spectrogrammes HPLC des solutions d'échantillon par injection d'une aliquote de 20 ul de l'échantillon pour chaque mesure.
- Obtenir les intensités des bandes d'acides organiques sur le chromatogramme de chaque solution échantillon dans la région de la manière décrite précédemment dans l'étape 5.5.
- Obtenir les concentrations des acides organiques dans les solutions en utilisant les équations correspondant aux courbes de fonctionnement obtenues à l'étape 5.6.
- Obtenir la quantité de chaque acide organique dans chaque bleuet à partir des concentrations de la solution d'échantillon obtenue dans l'étape précédente, et le volume total de la solution d'échantillon (50 ml, voir l'étape 3.12).
- Obtenir la quantité d'acide organique total dans chaque bleuet en additionnant le contenu des quatre acides organiques.
- Obtenir le pour cent de teneur en acide organique total de chaque bleuet en utilisant le poids mesuré à l'étape 1.3.
6. Prétraitement pour les mesures de CLHP de anthocyanes
- Gardez les bleuets dans un congélateur en dessous de -80 ° C prêt pour analyses chimiques si elles ne sont pas analysées juste après les mesures spectrales.
- Sécher chaque fruit congelé avec un lyophilisateur sous vide pendant 12 heures.
- Extrait anthocyane du bleuet séché dans 1% de solution méthanolique of l'acide trifluoroacétique [en poids de myrtille (g) / volume de la solution (ml) = 10/01], en laissant le mélange dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant 12 heures.
- Centrifuger l'extrait pendant 15 min dans un microtube de 2 ml en utilisant une ultracentrifugeuse à -8 ° C et 15 000 tpm (21.900 x g).
- Filtrez l'extrait à travers un filtre de 0,45 um pour obtenir l'échantillon pour les mesures de HPLC.
7. Mesures de CLHP de anthocyanes
Remarque: Environ 13 aimables anthocyanes sont inclus dans les bleuets. Comme il est difficile d'obtenir des courbes de travail pour tous les anthocyanines, une courbe de travail pour seulement cyanidine-3- chlorure O -glucoside, l' un des anthocyanines les plus populaires dans les bleuets, est obtenu. La courbe de travail est appliquée pour les quantifications approximatives d'autres anthocyanes.
- Mesurer environ 1,5 mg de cyanidine-3 - O -glucoside chlorure de précision, et le dissoudre dans 10 ml d' une solution de methanol à 1% d'acide trifluoroacétique à prepare une solution standard. Diluer 5 ml de la solution à 10 ml avec une solution de methanol à 1% d'acide trifluoroacétique pour préparer les secondes solutions standard. De même, préparer la troisième et de la quatrième solutions standard de manière séquentielle.
- Disposer le système HPLC comme suit:
- Utiliser une colonne en phase inverse C18 dans un four à colonne à 40 ° C.
- Appliquer la méthode du gradient en utilisant les éluats de 0,1% d'acide trifluoroacétique aqueux (éluent A) et de l'acide trifluoroacétique à 0,5% dans l'acétonitrile (éluent B) avec le débit d'écoulement de 0,1 ml / min, où le rapport de éluées B augmente de 8% à 15% pendant 0-50 minutes après l'injection, et de 15% à 75% pendant 50 à 60 minutes après l'injection.
- Utilisez un réseau de surveillance du détecteur de photodiode à 520 nm.
- Mesurer les spectrogrammes CLHP des solutions étalons par injection d'une aliquote de 10 ul pour chaque mesure. «Solution LC» est utilisé comme logiciel pour la mesure.
- Obtenez l'intensité de la bande de zonecyanidine-3- chlorure O -glucoside sur le chromatogramme de chaque solution standard en cliquant sur «re-analyse» avec le bouton droit de la souris.
- Tracer les intensités de la zone contre les concentrations correspondantes pour obtenir la courbe de travail pour cyanidine-3- chlorure O -glucoside par la régression linéaire, où l'équation représentant la relation entre l' intensité de la zone et la concentration est obtenue pour cyanidine-3- chlorure O -glucoside.
- Mesurer les spectrogrammes HPLC des solutions d'échantillon par injection d'une aliquote de 10 ul pour chaque mesure.
- Obtenez l'intensité de la bande de chaque anthocyane sur le chromatogramme de chaque solution d'échantillon de la zone comme décrit précédemment à l'étape 7.4.
- Obtenir les concentrations des anthocyanines dans les solutions à l'aide de l'équation correspondant à la courbe de travail obtenue à l'étape 7.5.
- Obtenir les quantités de chaque anthocyane dans chaque myrtille de la concentration obtenue dans la précédentel'étape et le volume total de la solution de l'échantillon utilisé dans l'étape 6.3.
- Obtenir le montant total des anthocyanes dans chaque bleuet en résumant le contenu des treize anthocyanes.
- Obtenir le pour cent de teneur en anthocyanine totale de chaque bleuet en utilisant le poids mesuré à l'étape 1.3.
8. Construction de modèles d'étalonnage pour la prévision des ingrédients Sommaire
Remarque: La régression PLS, le 4,5 qui est une sorte de technique de régression multiple en utilisant les variantes latentes, est utilisé pour la construction de modèles d'étalonnage pour chaque composant à partir des spectres observés et les teneurs des ingrédients déterminés par des analyses chimiques. La régression PLS est réalisée soit avec les programmes commerciaux ou avec les programmes faits maison. Voir les références 5,10 pour les processus détaillés de la construction de modèles.
- Examiner qui prétraitements pour les spectres observés sont les plus efficaces pour précis etprédiction robuste.
- Construire des modèles d'étalonnage en appliquant une ou deux des prétraitements suivants: MSC (multiplicatif Correction Scatter), 1,2,5 SNV (Standard normal Variate), 1,2,5 NMM (Min-Max Normaliser), COE (Constant élimination Offset ), et le premier ou le second calcul dérivé par SG méthode (Savitzky-Golay). 1,2,5 Prédire le contenu des ingrédients de la validation définir à partir de leurs spectres avec les modèles construits.
Note: Dans la NMM, un spectre est normalisée de telle sorte que les valeurs minimales et maximales seront 0 et 1, respectivement. Dans EOC, l'ordonnée d'un spectre est décalé de telle sorte que la valeur minimale devient égale à zéro. - Calculer le coefficient de détermination, R 2, et la déviation résiduelle prédictive, SPR, entre l'observé et les valeurs de l'ensemble de validation d'examiner quels prétraitements pour les spectres observés sont les plus efficaces prédit. Choisissez la combinaison de prétraitements donnant plusR 2 et SPR.
- Construire des modèles d'étalonnage en appliquant une ou deux des prétraitements suivants: MSC (multiplicatif Correction Scatter), 1,2,5 SNV (Standard normal Variate), 1,2,5 NMM (Min-Max Normaliser), COE (Constant élimination Offset ), et le premier ou le second calcul dérivé par SG méthode (Savitzky-Golay). 1,2,5 Prédire le contenu des ingrédients de la validation définir à partir de leurs spectres avec les modèles construits.
- Examiner quelles régions sont efficaces pour nombre d' onde la prédiction précise et robuste en appliquant, par exemple, se déplacent-fenêtres PLS technique 11 pour rechercher les régions efficaces.
Remarque: La procédure correspond à l'élimination des régions d'onde où les spectres ne contiennent pas d'information efficace pour les prévisions ou contiennent de l'information qui interfère avec les prédictions.
9. Validation des modèles d'étalonnage construits
Note: Voir les références 5,10 pour les processus détaillés de la validation des modèles construits.
- Prédire le contenu des ingrédients de la validation définir à partir de leurs spectres avec les modèles d'étalonnage construites avec la meilleure combinaison de prétraitements et pour les régions du nombre d'ondes efficaces pour la prédiction. 5,10
- Calculer R 2 et SPR entre l'observé et préditvaleurs de l'ensemble de validation. 5,10
- Examiner si les critères généraux pour l'exécution pratique des modèles d'étalonnage, 12,13 R 2> 0,85 et SPR> 2,5, sont satisfaits. Envisager la reconstruction du modèle si les critères ne sont pas satisfaits.
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Representative Results
La figure 2 montre à titre d'exemple un ensemble de spectres d'absorption NIR de bleuets où les spectres de 70 bleuets sont présentés simultanément. Depuis les bandes définitivement assignables à des sucres, des acides organiques, ou les anthocyanes ne sont pas observées dans les spectres NIR, la loi traditionnelle de Beer-Lambert est sans objet pour quantifier le contenu des ingrédients. Par conséquent, la construction de modèles pour la prédiction du contenu des ingrédients est nécessaire.
La figure 3 montre les chromatogrammes typiques de l'analyse quantitative des sucres dans les bleuets. Trois panneaux du haut sont respectivement les chromatogrammes des solutions étalons de saccharose, le glucose et le fructose. Le panneau inférieur montre un chromatogramme d'une solution d'échantillon, à savoir l'extrait de myrtille. Les types et les concentrations de sucres dans la solution d'échantillon sont connus d'après les temps de rétention d'unnd les intensités des pics observés dans la région. teneur en sucres totaux est obtenue comme la somme des teneurs en saccharose, le glucose et le fructose.
La figure 4 montre un exemple de chromatogramme pour l'analyse des acides organiques dans une bleuet. En se référant aux chromatogrammes de la solution étalon (non représentée ici), les types et les concentrations des acides organiques dans la solution d'échantillon sont connus. Pour les affectations des pics observés indiqués dans la légende de la figure, deux pics sont observés pour l'acide quinique dans les chromatogrammes des solutions standards et des échantillons. Ils pourraient être assignables à des isomères de l'acide quinique. La teneur totale en acide organique est obtenu comme somme de l'acide citrique, l'acide quinique, l'acide malique, et des teneurs en acide succinique.
La figure 5 montre un exemple de chromatogramme pour l'analyse des anthocyanines dans un bleuet. De nombreux pics correspondant à Différéanthocyanes nt aimables sont observés. Etant donné que l'ordre de escamotage de ces anthocyanines ont été rapportés 14,15 comme le montre le tableau 1, les pics observés peuvent être attribués à des anthocyanines individuelles. la teneur en anthocyanes totale est obtenue comme la somme des contenus des 13 types d'anthocyanines.
Modèles d'étalonnage sont construits à partir des spectres observés et le contenu des ingrédients déterminés chimiquement. Le tableau 2 montre un exemple de l'examen de prétraitements. Six prétraitements de type , y compris "none (sans prétraitement)" ont été examinés pour la construction du modèle d'étalonnage de la teneur totale en sucre en utilisant des spectres dans une région fixe wavenumber de 12,500-3,600 cm -1. Différents prétraitements se traduisent par des performances différentes de prédiction. Les performances des modèles ont été évalués avec R 2 et SPR. Le type de prétraitements qui donne la meilleure predila performance de ction est choisi. Dans le tableau 2, "Second dérivé + MSC," ce qui signifie MSC après le second calcul dérivé, donne les meilleurs résultats. Ensuite, les régions de nombre d'onde utilisées pour la construction du modèle sont examinées en faisant varier les régions ayant les prétraitements fixes.
Figure 6 montre à titre d'exemple , un résultat de la validation croisée du modèle d'étalonnage pour la teneur en sucres totaux, où la corrélation entre les valeurs prédites par spectroscopie NIR et celles déterminées par HPLC est représentée. Le modèle a été construit avec "la dérivée seconde + MSC" que les prétraitements et en utilisant les 8,539-7,775 cm -1 des spectres. La performance de prédiction du modèle est R 2 = 0,85 et SPR = 2,6, juste au- dessus des critères pour l'utilisation pratique. Dans cet exemple, le nombre d'échantillons utilisés pour la construction du modèle a été de 30, ce qui est trop petit pour les inconvénientstruct modèles de haute performance.
Figure 7 montre à titre d'exemple , un résultat de la validation croisée du modèle d'étalonnage pour la teneur totale en acide organique, où la corrélation entre les valeurs prédites par spectroscopie NIR et celles déterminées par HPLC est représentée. Le modèle a été construit avec "la première dérivée + MSC" que les prétraitements et en utilisant les 7,505-5,446 et 4,605-4,242 cm -1 régions de spectres. La performance de prédiction du modèle est R 2 = 0,92 et SPR = 3,6, qui sont suffisantes pour l'application pratique.
Figure 8 montre à titre d'exemple , un résultat de la validation externe du modèle d'étalonnage pour la teneur en anthocyanes totale, la corrélation entre les valeurs prédites par spectroscopie NIR et celles déterminées par HPLC. Le modèle a été construit avec "la première derivative "comme le prétraitement et en utilisant les 12,489-6,094 et 4,605-4,242 cm -1 régions du spectre. La performance de prédiction du modèle est R 2 = 0,95 et SPR = 4,4, ce qui montre assez bonne performance du modèle construit. Depuis anthocyanine existe principalement dans la peau des bleuets, il est facile d' observer avec des mesures de réflectance diffuse bien que son contenu dans un bleuet est pas élevé. la bonne performance montre la figure 8 serait causé aussi par le grand nombre d'échantillons (70) utilisé pour la construction du modèle .
Figure 2. NIR spectres d'absorption des bleuets. Spectra de 70 bleuets sont présentés en même temps. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Chromatogrammes pour l'analyse quantitative des sucres dans les bleuets. Chromatogrammes des solutions standard de (A) de saccharose, (B) glucose, (C) le fructose, et (D) un chromatogramme d'une solution d'échantillon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.
La figure 4. Chromatogramme pour l'analyse quantitative des acides organiques dans une bleuet. Les pics observés correspondent à l' acide citrique (1), l' acide malique (2), l' acide quinique (0 et 3) et de l' acide succinique (4). Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Chromatogramme pour l'analyse quantitative des anthocyanes dans une myrtille. Pics observés sont affectés à des anthocyanines individuelles figurant au tableau 1 , où le temps de rétention standard pour chaque anthocyanine est affiché. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. A la suite de la validation croisée du modèle de la teneur en sucres totaux. Les valeurs prédites par spectroscopie proche infrarouge sont tracées par rapport celles qui sont déterminées par HPLC. R2 = 0,85 et RPD = 2,6 sont obtenus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. A la suite de la validation croisée du modèle pour la teneur totale en acide organique. Les valeurs prédites par spectroscopie NIR sont tracées contre celles déterminées par HPLC. R 2 = 0,92 et SPR = 3.6 sont obtenus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8. Un résultat de la validation externe du modèle pour la teneur en anthocyanes totales. Les valeurs prédites par spectroscopie proche infrarouge sont représentés graphiquement sur les dpar HPLC entière est fixé. R 2 = 0,95 et SPR = 4,4 sont obtenus. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Formule | anthocyanine | Temps de rétention Représentant (min) |
| C 21 H 21 O 12 | Delphinidine-3- O -galactoside | 17.3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delphinidine-3- O -glucoside | 19,7 |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidine-3 - O -galactoside | 22,8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delphinidine-3- | 23,6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Cyanidine-3 - O -glucoside | 24,5 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidine-3- O -galactoside | 28,7 |
| C 20 H 19 O 10 | Cyanidine-3 - O -arabinoside | 31,3 |
| C 22 H 23 O 12 | Petunidine-3- O -glucoside | 36,0 |
| C 22 H 23 O 11 | Péonidine-3- O -galactoside | 37,0 |
| C 21 H 21 O 11 | Petunidine-3- O -arabinoside | 40,8 |
| C 22 H 23 O 11 | Péonidine-3- O -glucoside | 43,7 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidol-3- O -galactoside | 45,0 |
| C 23 H 25 O 12 | Malvidol-3- O -glucoside | 49,6 |
Tableau 1. Principales anthocyanines contenues dans les bleuets. Les temps de rétention représentatifs dans l'analyse HPLC dans les conditions expérimentales présentes sont également répertoriés.
| Prétraitement | Région wavenumber utilisé pour l' analyse (cm -1) | SPR | R 2 |
| Aucun | 12,500-3,600 | 1.7 | 0.69 |
| Deuxième dérivé | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| dérivée première | 12,500-3,600 | 2.5 | 0,84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0,81 |
| Deuxième dérivé + MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0,88 |
| Dérivée + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0,87 |
Tableau 2. L'examen de la dépendance à l' égard de la performance de prédiction sur les prétraitements des spectres observés. R 2 et SPR pour la prédiction de la teneur totale en sucre sont répertoriés.
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Discussion
Quelques commentaires supplémentaires sur le protocole sont décrits ici. Tout d'abord, à l'étape 1.1, il est mentionné pour décider les cultivars inclus dans la cible. Bien qu'il soit possible de construire des modèles couvrant les bleuets de nombreux cultivars ou sans préciser les cultivars, les exactitudes de prédiction avec les modèles sont parfois bien inférieurs à ceux des modèles pour un seul cultivar et cultivars limités. Il convient également de noter que les modèles d'étalonnage doivent être construits pour les bleuets de chaque site de production pour obtenir des performances élevées de prédiction , car les bleuets récoltés à différents sites de production ont des caractéristiques différentes qui influent sur la performance de prédiction. 1
En second lieu, à l'étape 2.3, il est indiqué de choisir le mode de réflexion diffuse pour les mesures des spectres. Le mode de transmission est également préparé pour les mesures sur le spectrophotomètre. Bien que les spectres mesurés dans le mode de transmission sont unLSO disponible pour la construction de modèles d'étalonnage, des modèles plus précis et plus robustes peuvent être construits avec les spectres mesurés en mode de réflexion diffuse dans la plupart des cas. Le total des teneurs en acides organiques ne peuvent pas être prédits avec les spectres mesurés en mode de transmission. 3
Troisièmement, pour les mesures de spectres de bleuets, il est recommandé de ne pas mesurer les spectres au calice depuis l'état de surface et le contenu autour du calice sont différentes de celles d'autres positions. Néanmoins, il est possible de construire des modèles d'étalonnage à l'aide d'un nombre suffisant de spectres mesurés à la fois le calice et les autres positions. Cependant, la précision des modèles sont dans la plupart des cas inférieur à ceux des modèles construits avec les spectres mesurés uniquement à des positions autres que le calice.
Quatrièmement, un spectre de myrtille NIR dépend de la température. Par conséquent, pour la prédiction précise soit il est important toujours mesurer les spectres à la même température ambiante ou de construire des modèles d'étalonnage avec compensation des variations de température. 1
Cinquièmement, bien que R 2 et SPR sont utilisés pour choisir les prétraitements et l' évaluation de la performance des modèles construits ici, d'autres valeurs telles que la SEC (erreur standard d'étalonnage), SEP (erreur standard de prédiction), SECV (erreur standard de la Croix -Validation), RMSEP (root Mean Square error de Prediction) et RMSECV (erreur quadratique moyenne de validation croisée) sont généralement utilisés pour un examen plus détaillé. Dans notre précédent article, 3 par exemple, RMSEP et RMSECV ont été utilisés pour le choix des prétraitements et l' évaluation de la performance des modèles construits.
prédiction non destructive de sucres totaux, l'acide organique total, et le total des teneurs en anthocyanes dans un bleuet était found être possible si les modèles de prédictions sont construits correctement. Cette technique est applicable pour la sélection de seulement délicieux bleuets de tous ceux récoltés, qui ne peut être réalisée avec d' autres techniques analytiques traditionnelles. 8,9 Bien que les procédures des analyses chimiques peuvent sembler compliqué, ils sont inclus dans les techniques analytiques populaires et ne sont pas accompagné par de grandes difficultés. Il est important d'obtenir des résultats précis pour les analyses chimiques parce que les résultats sont à la base du modèle construit. Dans cette étude, RSD (standard de type relatif) des mesures de HPLC était d'environ 1%. Il est également nécessaire de suivre la procédure de base, par exemple , comme le montre la figure 1, pour la construction de modèles applicables dans la pratique.
Des méthodes simples et rapides au lieu de HPLC peuvent être appliqués pour les analyses chimiques. teneur totale en sucre et l'acidité peuvent être mesurés, respectivement, avec un réfractomètre(Brix mètre) et un pH-mètre. Le procédé différentiel de pH 16,17 est applicable à la mesure de la teneur en anthocyanes totales. Application des méthodes simples rendent la construction de modèles beaucoup plus facile, bien que la précision des valeurs prédites par les modèles peuvent être inférieures à celles prédites par les modèles construits sur la base des mesures de HPLC présentées ici. Néanmoins, la précision des modèles construits sur la base d'analyses chimiques simples peut être pratiquement applicable à des sites de production et les processus de circulation parce élevés exactitudes ne sont pas toujours nécessaires là. Les méthodes utilisées pour les analyses chimiques, par conséquent, doivent être choisis selon les précisions nécessaires pour les modèles à construire.
Bien que certains fruits comme la pomme et l'orange sont vendus généralement avec des contenus et des acidités de sucre garantis, les bleuets ont pas été vendues avec des qualités garanties. Par conséquent, la qualité des bleuets commerciaux faitsemble pas stable au moins au Japon; parfois les bleuets de faible qualité sont vendus sur les marchés. Les méthodes d'analyse non destructives par spectroscopie NIR montré ici devrait permettre, en principe, l'expédition et la vente de bleuets avec des qualités garanties.
Enfin, il existe des limites de cette méthode. En premier lieu, comme mentionné ci-dessus, la construction de modèles de prédiction est assez gênant. En outre, le modèle de prédiction doit être construit pour chaque site et chaque année de culture, car la différence entre les quantités de composants coexistants (qui dépendent du site et de l'année de culture) affecte la précision de la prédiction. Par conséquent, des efforts sont nécessaires pour l'entretien des modèles de prédiction. Deuxièmement, même si nous avons montré que la spectroscopie proche infrarouge est, en principe, applicable pour le contrôle de la qualité des bleuets, l'équipement et les techniques présentées ici sont seulement utilisées en laboratoire et non applicable sur les sites de production estprovoquer une vérification rapide de grandes quantités de baies sur les sites de production est impossible. pratique, le développement de l'équipement et le développement de modèles d'étalonnage robustes convenant à une utilisation dans des sites de production et les processus de circulation appropriés sont les orientations futures.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
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