Introduction
Infravermelho próximo (NIR) é amplamente aplicada como uma técnica não destrutiva para analisar o conteúdo de frutas e vegetais de vários tipos. Analisa 1,2 Nondestructive por espectroscopia NIR habilitar o envio de apenas deliciosas frutas e vegetais com qualidades garantidas. espectroscopia NIR já foi aplicada ao laranja, maçã, melancia, cereja, fruta de kiwi, manga, papaia, pêssego e assim por diante para saber o seu Brix que corresponde ao teor total de açúcar, acidez, TSC (teor de sólidos totais), e assim por diante . Recentemente, relatou a aplicação da espectroscopia NIR para a avaliação de mirtilos qualidade. 3 Medimos não só o teor de açúcares totais e o teor de ácido orgânico total correspondente à acidez, mas também o conteúdo de antocianina total. A antocianina é um componente bioactivo que se crê melhorar a saúde humana. É conveniente para os consumidores se eles podem comprar deliciosos blueberries com uma garantia de seu teor de açúcar, acidity e teor de antocianinas.
Em NIR espectro de absorção de frutas e legumes, apenas largas bandas de absorção são observados. Eles são principalmente as bandas devido à fibra e à humidade. Embora muitas bandas fracas devido a vários ingredientes de o alvo não-destruído são observados simultaneamente, as bandas observadas não podem ser atribuídos a modos de vibração específicos de componentes específicos do alvo, na maioria dos casos. Portanto, a técnica tradicional para determinar o teor de um componente específico utilizando a lei de Lambert-Beer não é eficaz para espectros NIR. Em vez disso, modelos de calibração para prever o conteúdo dos componentes alvo a partir dos espectros observados são construídos utilizando quimiometria por examinar a correlação entre o espectro observado e o conteúdo de ingrediente correspondentes aos espectros de 4,5. Aqui, um protocolo para a construção e validar os modelos para a previsão de teor de açúcares totais, teor de ácido orgânico total correspondente ao ACIDIty, e teores de antocianinas totais de mirtilos de espectros NIR é apresentado.
A Figura 1 mostra o fluxograma geral para a construção de modelos de calibração confiáveis e robustas. Amostras de número suficiente são coletados. Alguns deles são utilizados para a construção de modelos enquanto os outros são utilizados para a validação dos modelos construídos. Para cada uma das amostras recolhidas, um espectro de NIR é medida, e em seguida, os componentes alvo são analisados quantitativamente com os métodos de análise química destrutivas tradicionais. Aqui, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é utilizada para as análises químicas de açúcares, ácidos orgânicos, e antocianinas. mínimos quadrados parciais (PLS) A regressão é usada para a construção de modelos de calibração em que a correlação entre o espectro observado e o conteúdo de ingrediente determinado por análise química é examinada. A fim de construir modelos robustos com a melhor capacidade de previsão, os pré-tratamentos de observed espectros e os comprimentos de onda utilizados para a predição são também examinados. Por fim, os modelos construídos são validados para confirmar a sua capacidade de previsão suficiente. Na validação, o conteúdo previsto a partir do espectro observado pelo modelo construído (valores previstos) são comparados com o conteúdo determinado pelas análises químicos (valores observados). Se a correlação suficiente não pode ser encontrada entre os valores previstos e observados, o modelo de calibração deve ser re-construída até que seja obtida a correlação suficiente. Embora seja preferível utilizar diferentes grupos de amostras para a construção e a validação de um modelo, como mostrado nesta figura (validação externa), amostras em um mesmo grupo são usados tanto para a construção e a validação (validação cruzada) quando o número de amostras não é grande o suficiente.
Figura 1. Fluxograma para a construção e validação do modelo de calibração. Os procedimentos cercado por linhas azuis e verdes correspondem, respectivamente, para a construção de um modelo de calibração e sua validação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Coleta de Amostras
- Decidir qual cultivares serão incluídos no alvo do modelo de calibração.
- Recolhe número suficiente e vários tipos de amoras de amostra dos cultivares alvo.
- Recolha de um modo preferido 100 mirtilos para a construção do modelo de calibração, e, pelo menos, 10 para a validação do modelo construído. A fim de construir modelos robustos, recolher amostras de vários tipos, ou seja, com várias cores, tamanhos e em diferentes condições de maturação.
- Pesar cada mirtilo. Nota: Os pesos medidos são utilizados mais tarde para o cálculo da percentagem de conteúdo de ingredientes de cada mirtilo.
2. As medições de espectros
- Warm-up o espectrofotômetro suficiente (mais de 1 hora) antes das medições para obter espectros de confiança.
- Ajuste o espectrofotômetro. Certifique-se de que as condições são constantes durante todo as medições. Aexemplo de condições típicas para as medições é dada abaixo.
- Definir a gama de medições para 12,500-3,600 cm -1.
- Defina a resolução espectral para 16 cm -1.
- Defina o acúmulo de até 32 vezes.
- Escolha reflectância difusa como o modo de medição.
- Coloque o refletor padrão na janela do espectrofotômetro para medidas de reflectância difusa. Ao usar o comando "fundo único canal", medir o espectro de fundo que é automaticamente usada para o cálculo dos espectros de reflectância relativa a partir dos espectros de mirtilos amostra medida mais tarde.
- Coloque uma amostra de mirtilo no centro da janela do espectrofotômetro para medidas de reflectância difusa. Ao usar o comando "amostra único canal", medir espectros de cada blueberry de preferência em vários pontos da fruta.
Nota: Kubelka-Munk 6,7 transformação também será realizada autocamente para a espectros observados de mirtilos amostra, se a condição de aquisição espectral é configurado para fazer isso. transformação de Kubelka-Munk altera o espectro medido no modo de reflectância difusa para os espectros equivalente àqueles medidos no modo de transmissão e é necessária para a análise dos espectros com alta precisão. Spectra na escala de absorção são usados para análises. - Calcula-se a média do espectro dos espectros de cada amostra utilizando um programa de processamento de dados, tais como o Microsoft Excel se os espectros de uma amostra de mirtilo são medidas em vários pontos. Utilizar o espectro em média para as análises.
3. Pré-tratamento para medições de HPLC de açúcares e ácidos orgânicos 8
Nota: Extracto açúcares e ácidos orgânicos de cada mirtilo, que são solúveis em água, com água ultrapura como se segue. A totalidade de cada blueberry é utilizado para análises.
- Mantenha os mirtilos em um congelador abaixo de -30 ° C pronto foanalisa r química se não forem analisados logo após as medidas espectrais.
- Cortar uma mirtilo em vários pedaços de modo que pode ser facilmente homogeneizado nos seguintes passos. Corte o blueberry sem descongelar quando ele está congelado.
- Coloque os pedaços em um copo de 50 ml.
- Adicionar ca. 10 ml de água ultrapura (água destilada cuja condutividade eléctrica é inferior a 0,1 mS / cm) para o copo.
- Aquece-se a mirtilo corte em água ultrapura num forno de microondas durante 20 seg para desactivar as enzimas que podem decompor-se açúcares durante as análises.
- Adicionar cerca de 10 ml de água ultrapura ao balão.
- Homogeneizar a mistura durante 5 minutos a 12.000 rpm com um homogeneizador equipado com um eixo padrão e gerador.
- Centrifugar a mistura homogeneizada durante 10 min a 3000 rpm (2000 x g).
- Recolhe filtrado por filtração sob vácuo da amostra centrifugada utilizando um filtro de papel 5B.
- Repetir a 3,6-3,9 passos duas vezes em the resíduo de filtração para recolher todos os açúcares e os ácidos orgânicos, e combinar todos os filtrados.
- Medir o pH do filtrado e ajustá-lo para 7 com ácido clorídrico diluído (0,1 e 0,01 mol L -1) e soluções aquosas diluídas de hidróxido de sódio (0,1 e 0,01 mol L -1).
- Dilui-se o filtrado até 50 ml com água ultrapura.
- Dividir a amostra em dois; uma para a análise de açúcares e a outra para a análise de ácidos orgânicos.
- Passar a primeira solução de amostra através de colunas (duas C18, CM e QMA) ligados em série, para excluir pigmentos, catiões e aniões. Jogue fora os primeiros 1 ml da solução da amostra a partir das colunas. Em seguida, utilizar a solução da amostra a partir das colunas para a análise de açúcares por HPLC.
- Passar a segunda solução de amostra através de colunas (duas C18 e CM) ligados em série para excluir pigmentos e catiões. Jogue fora os primeiros 1 ml da solução da amostra a partir das colunas. Em seguida, use a solução de amostra a partir da columns para a análise de ácidos orgânicos por HPLC.
- Centrifugar cada solução de passos 3.14 e 3.15 a 6600 rpm (5800 x g), durante 10 min num microtubo equipado com um filtro de 0,45 um, com um mini-centrífuga antes da análise por HPLC.
4. Medições de açúcares por HPLC
Nota: Neste estudo, o teor total de sacarose, glicose e frutose de cada mirtilo é considerado como o teor total de açúcar. Portanto, a curva de trabalho para cada um dos três açúcares é obtido em primeiro lugar, e, em seguida, o conteúdo é obtido soma dos açúcares em cada mirtilo. O conteúdo padrão são relatadas como 0,3-0,4% em peso de (sacarose), 3,8-4,8% em peso (glicose), e 4,2-5,3% em peso (frutose) 9.
- Medir cerca de 200 mg de sacarose com precisão, e dissolvê-lo em 50 ml de água ultrapura para preparar uma solução-padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 50 ml com água ultrapura para preparar a segunda soluções-padrão. Prepare de forma semelhante a terceira posiçãoard solução a partir da segunda solução padrão.
- Preparar as soluções padrão de glucose e frutose, de forma semelhante.
- Dispor o sistema de HPLC como segue:
- Utilizar uma coluna de permeação em gel na coluna forno a 40 ° C.
- Use água ultrapura desgaseificada com a taxa de fluxo de 0,1 ml / min como o eluato.
- Usar um detector de índice de refracção.
- Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão por injecção de uma alíquota de 20 uL para cada medição. Nota: Aqui, o PAC solução é utilizada como o software para a medição.
- Obter a intensidade da banda do açúcar no cromatograma de cada solução padrão área clicando 're-análise "com o botão direito do mouse.
- Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada açúcar pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade e a área de concentração é obtido for cada açúcar.
- Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 20 uL para cada medição.
- Obter as intensidades das bandas de açúcares no cromatograma da solução de amostra a cada área, como descrito anteriormente no passo 4.5.
- Obter as concentrações dos açúcares nas soluções que utilizam as equações correspondentes para as curvas de trabalho obtidos no passo 4.6.
- Obter a quantidade de cada açúcar em cada mirtilo a partir das concentrações da solução de amostra obtida na etapa anterior e o volume total da solução da amostra (50 ml, ver passo 3.12).
- Obter as quantidades totais de açúcar de cada fruta somando-se o conteúdo de três açúcares.
- Obter a percentagem de conteúdo de açúcar total de cada blueberry usando o peso medido no passo 1.3.
5. As medições de HPLC dos ácidos orgânicos
Nota: Neste estudo, o teor total de ácido cítrico, ácido quínico, ácido málicoácido, e ácido succínico são considerados como o conteúdo de ácido orgânico total. Portanto, a curva de trabalho para cada um dos quatro ácidos orgânicos é obtido em primeiro lugar, e, em seguida, o conteúdo de ácido orgânico em cada mirtilo é medido. O conteúdo padrão são relatadas como 0,42-0,62% em peso (ácido cítrico), 0-0,15% em peso (ácido quínico), 0,08-0,23% em peso (ácido málico), e 0,06-0,25% em peso (ácido succínico) 9.
- Medir cerca de 5 mg de ácido cítrico com precisão, e dissolvê-lo em 50 ml de água ultrapura para preparar uma solução-padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 50 ml com água ultrapura para preparar a segunda soluções-padrão. Prepare de forma semelhante a terceira solução padrão a partir da segunda solução padrão.
- Preparar as soluções padrão de ácido quínico, ácido málico, ácido succínico e, de forma semelhante.
- Dispor o sistema de HPLC como segue:
- Use duas colunas de permuta aniónica ligadas em série no forno de coluna a 40 ° C.
- Uso desgaseificada solução aquosa a 0,1% de fosfóricoácido com a taxa de fluxo de 0,02 ml / min como o eluato.
- Use um conjunto detector ultravioleta-visível a 210 nm.
- Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão por injecção de uma alíquota de 20 ul da solução padrão de cada medição.
- Obter a intensidade da banda de ácido orgânico no cromatograma de cada solução padrão área clicando 're-análise "com o botão direito do mouse.
- Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cada ácido orgânico pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade de área e a concentração é obtido para cada ácido orgânico.
- Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 20 ul da amostra para cada medição.
- Obter as intensidades das bandas de ácidos orgânicos no cromatograma da solução de amostra a cada área, tal como descrito anteriormente no passo 5.5.
- Obter as concentrações dos ácidos orgânicos nas soluções que utilizam as equações correspondentes para as curvas de trabalho obtidos no passo 5.6.
- Obter a quantidade de cada ácido orgânico em cada mirtilo a partir das concentrações da solução de amostra obtida na etapa anterior e o volume total da solução da amostra (50 ml, ver passo 3.12).
- Obter a quantidade de ácido orgânico total em cada mirtilo pela soma-se os conteúdos dos quatro ácidos orgânicos.
- Obter a percentagem do conteúdo de ácido orgânico total de cada mirtilo usando o peso medido no passo 1.3.
6. Pré-tratamento para medições de HPLC de antocianinas
- Mantenha os mirtilos no congelador a menos de -80 ° C pronto para análises químicas, se eles não são analisados logo após as medidas espectrais.
- Seque cada fruta congelada com um liofilizador vácuo durante 12 h.
- Extrair antocianina do mirtilo secou-se em 1% de solução de metanol óácido trifluoroacético f [peso de mirtilo (g) / volume da solução (ml) = 10/01], deixando a mistura no frigorífico a 4 ° C durante 12 h.
- Centrifugar o extracto durante 15 min num microtubo de 2 ml usando uma ultracentrífuga a -8 ° C e 15.000 rpm (21.900 x g).
- Filtra-se o extracto através de um filtro de 0,45 um para obter a amostra para medições de HPLC.
7. As medições por HPLC de antocianinas
Nota: Cerca de 13 antocianinas tipo estão incluídas na mirtilos. Uma vez que é difícil obter curvas de trabalho para todas as antocianinas, a curva de trabalho para o cloreto O -glucoside única cianidina-3-, uma das antocianinas mais populares em blueberries, é obtido. A curva de trabalho é aplicado por quantificações aproximadas de outros antocianinas.
- Medir cerca de 1,5 mg de cloreto de -glucoside cianidina-3-O com precisão, e dissolvê-lo em 10 ml de solução de metanol a 1% de ácido trifluoroacético a Prepare uma solução padrão. Dilui-se 5 ml da solução para 10 ml com solução de metanol a 1% de ácido trif luoroacético para preparar a segunda soluções-padrão. Do mesmo modo, preparar o terceiro eo quarto soluções padrão sequencialmente.
- Dispor o sistema de HPLC como segue:
- Usar uma coluna de fase inversa C18 num forno de coluna a 40 ° C.
- Aplicar o método do gradiente utilizando eluatos de 0,1% de ácido trifluoroacético aquoso (eluir A) e 0,5% de ácido trifluoroacético em acetonitrilo (eluir B) com a taxa de fluxo de 0,1 ml / min, em que a razão de aumento eluir B de 8% a 15% durante 0-50 min após a injecção, e de 15% para 75% durante 50-60 minutos após a injecção.
- Use um fotodiodo matriz monitoramento detector a 520 nm.
- Medir os espectrogramas de HPLC de soluções padrão injectando uma alíquota de 10 uL para cada medição. "Solução LC" é utilizado como o software para a medição.
- Obter a intensidade da banda de áreacloreto de O -glucoside cianidina-3- no cromatograma de cada solução padrão, clicando em "re-análise" com o botão direito do mouse.
- Traçar as intensidades área contra as concentrações correspondentes para obter a curva de trabalho para cianidina-3- cloreto de o -glucoside pela regressão linear, em que a equação que representa a relação entre a intensidade e a área de concentração é obtido para cianidina-3- cloreto de o -glucoside.
- Medir os espectrogramas de HPLC das soluções de amostra por injecção de uma alíquota de 10 uL para cada medição.
- Obter a intensidade da banda de cada antocianina no cromatograma da solução de amostra a cada área, como descrito anteriormente no passo 7.4.
- Obter as concentrações das antocianinas nas soluções utilizando a equação correspondente à curva de trabalho, obtido no passo 7.5.
- Obter as quantidades de cada antocianina em cada mirtilo da concentração obtida na precedentepasso e o volume total da solução da amostra utilizada no passo 6.3.
- Obter a quantidade total de antocianina em cada blueberry somando-se os conteúdos dos treze antocianinas.
- Obter a percentagem do teor de antocianina total de cada mirtilo usando o peso medido no passo 1.3.
8. Construção de modelos de calibração para predição dos conteúdos Ingrediente
Nota: regressão PLS 4,5, que é um tipo de técnica de regressão múltipla usando variantes latentes, é usado para a construção de modelos de calibração para cada um dos ingredientes a partir dos espectros observados e o conteúdo de ingrediente determinada por análises químicas. PLS de regressão é realizada tanto com os programas comerciais ou com os programas caseiros. Ver referências 5,10 para os processos detalhados da construção de modelos.
- Analisará os pré-tratamentos para espectros observados são mais eficazes para precisas epredição robusta.
- Construir modelos de calibração através da aplicação de um ou dois dos seguintes pré-tratamentos: MSC (multiplicativo Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard normal variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalização), COE (Constant offset Eliminação ), e o primeiro ou o segundo cálculo derivado por SG (Savitzky-Golay) método. 1,2,5 Prever o conteúdo de ingrediente a validação definido a partir de seus espectros com os modelos construídos.
Nota: Em MMN, um espectro é normalizada de modo a que os valores máximos e mínimos e tornar-se 0 e 1, respectivamente. Em COE, a ordenada de um espectro é deslocado de modo a que o valor mínimo torna-se zero. - Calcular coeficiente de determinação, R2, e desvio de previsão residual, RPD, entre os valores observados e estimados de validação definido para examinar que pré-tratamentos para espectros observados são mais eficazes. Escolha a combinação de pré-tratamentos dando maiorR2 e RPD.
- Construir modelos de calibração através da aplicação de um ou dois dos seguintes pré-tratamentos: MSC (multiplicativo Scatter Correction), 1,2,5 SNV (Standard normal variate), 1,2,5 MMN (Min-Max Normalização), COE (Constant offset Eliminação ), e o primeiro ou o segundo cálculo derivado por SG (Savitzky-Golay) método. 1,2,5 Prever o conteúdo de ingrediente a validação definido a partir de seus espectros com os modelos construídos.
- Examinar quais regiões número de onda são eficazes para a previsão precisa e robusta, aplicando, por exemplo,-mover janelas PLS técnica de 11 para procurar as regiões eficazes.
Nota: O procedimento corresponde a remover as regiões número de onda, onde espectros não contêm nenhuma informação eficaz para previsões ou que contenham informações que interfere com as previsões.
9. validação dos modelos de calibração construída
Nota: Ver referências 5,10 para os processos detalhados da validação de modelos construídos.
- Prever conteúdo ingrediente da validação definido a partir de seus espectros com os modelos de calibração construídas com a melhor combinação de pré-tratamentos e para as regiões wavenumber eficazes para a predição 5,10.
- Calcular R 2 e RPD entre o observado e previstovalores do conjunto de validação 5,10.
- Examinar se os critérios gerais para a realização prática dos modelos de calibração, 12,13 R 2> 0,85 e RPD> 2,5, estão satisfeitos. Considere a reconstrução do modelo, se os critérios não são satisfeitos.
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Representative Results
A Figura 2 mostra como um exemplo de um conjunto de NIR espectro de absorção de mirtilos, onde os espectros de 70 blueberries são mostrados simultaneamente. Uma vez que as bandas definitivamente atribuíveis aos açúcares, ácidos orgânicos, ou antocianinas não são observados no espectro de NIR, a lei de Lambert-Beer tradicional não é aplicável para quantificar os teores de ingredientes. Portanto, a construção de modelos para a predição de conteúdo de ingrediente é necessária.
A Figura 3 mostra cromatogramas típicos para a análise quantitativa de açúcares em mirtilos. Três painéis de topo são, respectivamente, os cromatogramas das soluções-padrão de sacarose, glicose, frutose e. O painel inferior mostra um cromatograma de uma amostra de solução, isto é, o extracto de um mirtilo. Os tipos e concentrações de açúcares na solução da amostra, são conhecidos a partir dos tempos de retenção deND as intensidades dos picos observados na área. O conteúdo total de açúcar é obtida como a soma dos teores de sacarose, glicose, frutose e.
A Figura 4 mostra um exemplo de um cromatograma para a análise de ácidos orgânicos em um mirtilo. Ao referir-se os cromatogramas da solução padrão (não mostrado aqui), os tipos e concentrações de ácidos orgânicos na solução de amostra são conhecidos. Para as atribuições dos picos observados mostradas na legenda da figura, dois picos são observadas para o ácido quínico nos cromatogramas das soluções padrão e de amostra. Eles podem ser atribuíveis a isômeros de ácido quínico. conteúdo de ácido orgânico total é obtido como soma de ácido cítrico, ácido quínico, ácido málico, ácido succínico e conteúdo.
A Figura 5 mostra um exemplo de um cromatograma para a análise das antocianinas em um mirtilo. Muitos picos correspondentes a As difereantocianinas nt tipo são observados. Uma vez que a ordem de elusion para estes antocianinas foram relatados 14,15 como mostrado na Tabela 1, os picos observados podem ser atribuídos a antocianinas individuais. teor de antocianina total é obtida como a soma dos teores de 13 tipos de antocianinas.
Modelos de calibração são construídos a partir de espectros observados e o conteúdo de ingrediente determinado quimicamente. A Tabela 2 mostra um exemplo do exame de pré-tratamentos. Seis pré-tratamentos do tipo, incluindo "Nenhum (sem pré-tratamento)" foram examinados para a construção do modelo de calibração do teor total em açúcar utilizando espectros a uma região do número de onda fixo de 12,500-3,600 cm -1. Diferentes pré-tratamentos resultam em diferentes apresentações de predição. Performances dos modelos foram avaliados com R 2 e RPD. O tipo de pré-tratamentos que lhe dá o melhor predidesempenho cção é escolhido. No Quadro 2, "segunda derivada + MSC", o que significa MSC após o segundo cálculo derivado, dá os melhores resultados. Em seguida, as regiões número de onda utilizados para a construção do modelo são examinados através da variação das regiões com os pré-tratamentos fixos.
A Figura 6 mostra como um exemplo de um resultado da validação cruzada do modelo de calibração para o conteúdo total de açúcar, em que a correlação entre os valores previstos por espectroscopia de NIR e os determinados por HPLC é mostrada. O modelo foi construída com "o segundo derivado de MSC +" como os pré-tratamentos e utilizando os 8,539-7,775 cm -1 região do espectro. O desempenho de previsão do modelo é R 2 = 0,85 e RPD = 2,6, um pouco acima dos critérios para a utilização prática. Neste exemplo, o número de amostras utilizadas para a construção do modelo foi de 30, o qual é muito pequeno para contrastruct modelos de alto desempenho.
A Figura 7 mostra como um exemplo de um resultado da validação cruzada do modelo de calibração para o conteúdo de ácido orgânico total, onde a correlação entre os valores previstos por espectroscopia de NIR e os determinados por HPLC é mostrada. O modelo foi construído com "a primeira derivada + MSC", como os pré-tratamentos e usando os 7,505-5,446 e 4,605-4,242 cm -1 regiões do espectro. O desempenho de previsão do modelo é R2 = 0,92 e RPD = 3,6, que são suficientes para a aplicação prática.
A Figura 8 mostra, como um exemplo de um resultado da validação externa do modelo de calibração para o teor de antocianina total, sendo a correlação entre os valores previstos por espectroscopia de NIR e os determinados por HPLC. O modelo foi construído com "o primeiro derivative ", tal como o pré-tratamento e utilizando os 12,489-6,094 e 4,605-4,242 cm -1 regiões do espectro. O desempenho de previsão do modelo é R2 = 0,95 e RPD = 4,4, o que mostra bastante bom desempenho do modelo de construção. Desde antocianina existe principalmente na casca de mirtilos, é facilmente observada com medições de reflectância difusa, embora o seu teor em um mirtilo não é alta. o bom desempenho mostrado na Figura 8 seria causada também pelo grande número de amostras (70) usado para a construção do modelo .
Figura 2. NIR espectro de absorção de mirtilos. Spectra de 70 blueberries são mostrados simultaneamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Cromatogramas para a análise quantitativa de açúcares em mirtilos. Cromatogramas das soluções padrão de glucose (A) de sacarose, (B), (C) frutose, e (D) um cromatograma de uma amostra de solução. Por favor clique aqui para visualizar um versão maior desta figura.
Figura 4. cromatograma para a análise quantitativa de ácidos orgânicos em um mirtilo. Picos observados correspondem ao ácido cítrico (1), ácido málico (2), ácido quínico (0 e 3), e ácido succínico (4). Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Cromatograma para a análise quantitativa de antocianinas em um mirtilo. Picos observados são atribuídos a antocianinas individuais listadas na Tabela 1, onde o tempo de retenção padrão para cada antocianina é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Um resultado da validação cruzada do modelo para o conteúdo total de açúcar. Os valores previstos por espectroscopia NIR são representados graficamente contra os determinados por HPLC. R2 = 0,85 e RPD = 2,6 são obtidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Um resultado de validação cruzada do modelo de conteúdo de ácido orgânico total. Os valores previstos por espectroscopia de NIR são plotados contra aqueles determinado por HPLC. R2 = 0,92 e RPD = 3,6 são obtidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Um resultado de validação externa do modelo para teores de antocianinas totais. Os valores previstos por espectroscopia de NIR são plotados contra aqueles ddeterminado de por HPLC. R2 = 0,95 e RPD = 4,4 são obtidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Fórmula | antocianina | Tempo de retenção representativas (min) |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidina-3-O -galactoside | 17,3 |
| C 21 H 21 O 12 | Delfinidina-3-O -glucoside | 19,7 |
| C 21 H 21 O 11 | Cianidina-3-O -galactoside | 22,8 |
| C 20 H 19 O 11 | Delfinidina-3- | 23,6 | |
| C 21 H 21 O 11 | Cianidina-3-O -glucoside | 24,5 |
| C 22 H 23 O 12 | O -galactoside petunidina-3- | 28,7 |
| C 20 H 19 O 10 | Cianidina-3-O -arabinoside | 31,3 |
| C 22 H 23 O 12 | O -glucoside petunidina-3- | 36,0 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidina-3-O -galactoside | 37,0 |
| C 21 H 21 O 11 | O -arabinoside petunidina-3- | 40,8 |
| C 22 H 23 O 11 | Peonidina-3-O -glucoside | 43,7 |
| C 23 H 25 O 12 | O -galactoside malvidina-3- | 45,0 |
| C 23 H 25 O 12 | O -glucoside malvidina-3- | 49,6 |
Tabela 1. Principais antocianinas contidas no blueberries. Os tempos de retenção representativas na análise HPLC sob as presentes condições experimentais também estão listados.
| Pré-processando | Região Número de onda utilizado para a análise (cm-1) | RPD | R2 |
| Nenhum | 12,500-3,600 | 1.7 | 0,69 |
| segunda derivada | 12,500-3,600 | 2.6 | |
| primeira derivada | 12,500-3,600 | 2.5 | 0,84 |
| MSC | 12,500-3,600 | 2.3 | 0,81 |
| Segunda derivada + MSC | 12,500-3,600 | 2.8 | 0,88 |
| Primeira derivada + MSC | 12,500-3,600 | 2.7 | 0,87 |
Tabela 2. Uma análise da dependência do desempenho de previsão sobre os pré-tratamentos dos espectros observados. R2 e RPD para a previsão do teor total em açúcar são listados.
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Discussion
Alguns comentários adicionais sobre o protocolo são descritos aqui. Em primeiro lugar, no passo 1.1, menciona-se para decidir as cultivares incluídos no alvo. Embora seja possível construir modelos que cobrem blueberries de muitos cultivares ou sem especificar cultivares, as precisões de previsão com os modelos são, por vezes, muito mais baixa do que aqueles com os modelos para um único cultivar e para as cultivares limitados. Deve também notar-se que os modelos de calibração deve ser construído para mirtilos de cada local de produção para obter o desempenho de predicção elevado porque mirtilos colhidas em diferentes locais de produção têm características diferentes que afectam o desempenho de previsão 1.
Em segundo lugar, no passo 2.3, menciona-se para seleccionar o modo de reflectância difusa para as medições de espectros. O modo de transmissão é também preparado para medidas no espectrofotómetro. Embora espectro medido no modo de transmissão são de umlso disponíveis para a construção de modelos de calibração, os modelos mais precisos e mais robustas podem ser construídos com os espectros medidos no modo de reflectância difusa, na maioria dos casos. Os teores de ácidos orgânicos totais não pode ser prevista com o espectro medido no modo de transmissão. 3
Em terceiro lugar, para as medições de espectros de mirtilos, não é recomendado para medir espectros no cálice uma vez que a condição da superfície e o conteúdo de todo o cálice são diferentes daqueles em outras posições. No entanto, é possível construir modelos de calibração usando um amplo número de espectros medidos tanto no cálice e outras posições. No entanto, as precisões dos modelos são na maior parte dos casos inferiores aos dos modelos construídos com o espectro medido apenas num momento diferente do que o cálice posições.
Em quarto lugar, um espectro de NIR de mirtilo depende da temperatura. Portanto, para a previsão precisa ou é importante para medir sempre espectros à mesma temperatura ambiente ou para a construção de modelos de calibração com uma compensação para a variação de temperatura. 1
Em quinto lugar, apesar de apenas R 2 e RPD são utilizados para a escolha dos pré-tratamentos e avaliar o desempenho dos modelos construídos aqui, alguns outros valores como a SEC (Erro Padrão de Calibração), a SEP (erro padrão de previsão), SECV (erro padrão da Cruz -Validação), RMSEP (Root Mean Square erro de Predição), e RMSECV (erro Root Mean Square de validação cruzada) são normalmente utilizados para exame mais detalhado. Em nosso artigo anterior, 3, por exemplo, RMSEP e RMSECV foram utilizados para a escolha de pré-tratamentos e avaliar o desempenho dos modelos construídos.
previsão não destrutiva de açúcares totais, ácido orgânico total e conteúdo total de antocianinas em um mirtilo foi found ser possível se os modelos para previsões são construídos corretamente. Esta técnica é aplicável para a selecção de apenas delicioso mirtilos de todos os colhidas, que não pode ser conseguido com outras técnicas analíticas tradicionais 8,9. Apesar de os processos das análises químicas pode parecer complicado, que estão incluídos nas técnicas analíticas e não são populares acompanhado por grandes dificuldades. É importante para obter resultados precisos para a análise química porque os resultados são a base do modelo de construção. Neste estudo, o RSD (desvio padrão relativo) das medições de HPLC foi de cerca de 1%. É também necessário para seguir o processo de base, por exemplo, como mostrado na Figura 1, para a construção de modelos praticamente aplicáveis.
métodos simples e rápidos em vez de HPLC pode ser aplicado para as análises químicas. O conteúdo total de açúcar e acidez pode ser medido, respectivamente, com um refractómetro(Medidor de Brix) e um medidor de pH. O método diferencial de pH 16,17 é aplicável para a medição do teor total de antocianina. A aplicação dos métodos simples fazer a construção de modelos muito mais fácil embora a precisão dos valores previstos pelos modelos pode ser mais baixa do que aqueles previstos pelos modelos construídos a partir das medições por HPLC ilustrada aqui. No entanto, a precisão dos modelos construídos com base em análises químicas simples podem ser praticamente aplicáveis nos locais de produção e processos de circulação porque as altas precisões nem sempre são necessários lá. Os métodos para as análises químicas, por isso, devem ser selecionados de acordo com as precisões necessárias para os modelos a serem construídas.
Embora algumas frutas, como maçã e laranja são vendidos geralmente com teores de açúcar garantidos e acidez, blueberries não foram vendidos com qualidades garantidas. Como resultado, a qualidade dos mirtilos comerciais faznão parecem estáveis, pelo menos, no Japão; por vezes, blueberries de baixa qualidade são vendidos em mercados. Os métodos analíticos não destrutivos por espectroscopia NIR mostrado aqui é esperado para permitir que, em princípio, a expedição e venda de blueberries com qualidades garantidas.
Finalmente, existem limitações deste método. Em primeiro lugar, tal como mencionado acima, a construção de modelos de previsão é bastante problemático. Além disso, o modelo de previsão deve ser construída para cada local e cada ano de cultivo porque a diferença nas quantidades de componentes coexistentes (que dependem do local e o ano de cultivo) afecta a precisão da predição. Portanto, algum esforço é necessário para a manutenção de modelos de previsão. Em segundo lugar, embora tenhamos mostrado que a espectroscopia de infravermelho próximo é, em princípio, aplicável para a verificação de mirtilos qualidade, os equipamentos e técnicas mostradas aqui são usados apenas em laboratório e não se aplica às unidades de produção sejacausar uma verificação rápida de grandes quantidades de bagas em locais de produção é impossível. desenvolvimento prático de equipamentos e desenvolvimento de modelos de calibração robustos adequados para uso em locais de produção e processos de circulação adequada são as direções futuras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FT-NIR spectrophotometer | Bruker Optics GmbH | MPA | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31 | For sugar analysis |
| 223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31 | Refractive Index Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31 | For organic acid analysis |
| 228-45018-31, 228-45010-31, 223-04500-31 | Ultraviolet-Visible Detector | ||
| High-Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation | 228-45041-91, 228-45018-31, 228-45000-31 | For anthocyanin analysis |
| 228-45012-31, 228-45119-31, 228-45005-31 | Photodiode Array Detector | ||
| 228-45009-31 | |||
| pH meter | Mettler-Toledo | 30019028 | S220, Automatic temperature compensation |
| Ultra-pure water treatment equipment | ORGANO Corporation | ORG-ULXXXM1; PRA-0015-0V0 | PURELAB ultra; PURELITE |
| Biomedical Freezers | SANYO | 2-6780-01 | MDF-U338 |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic healthcare Co.,Ltd. | KM-DU73Y1 | -80 °C |
| Vacuum lyophilizer | IWAKI GLASS Co.,Ltd | 119770 | DRC-3L; FRD-82M |
| Homoginizer | Microtec Co., Ltd. | Physcotron | |
| Ultracentrifuge | Hitachi Koki Co.,Ltd | S204567 | CF15RXII |
| Mini-centrifuge | LMS CO.,LTD. | KN3136572 | MCF-2360 |
| Centrifuge | Kokusan Co.,Ltd | 2-5534-01 | H-103N |
| Filter Paper | Advantec | 1521070 | 5B, Eqivalent to Whatman 40 |
| Sep-Pak C18 column | Waters Corporation Milford | WAT020515 | |
| Sep-Pak CM column | Waters Corporation Milford | WAT020550 | |
| Sep-Pak QMA column | Waters Corporation Milford | WAT020545 | |
| Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore Corporation | R2SA18503 | PVDF, 0.45 μm |
| Microtube | As One Corporation | 1-1600-02 | PP, 2 ml |
| Syringe Filter | GE Healthcare CO.,LTD. | 6788-1304 | PP, 0.45 μm |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 194-00011 | Reagent-grade |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 049-31165 | Reagent-grade |
| Fructose | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 123-02762 | Reagent-grade |
| Citric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 036-05522 | Reagent-grade |
| Malic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 355-17971 | Reagent-grade |
| Succinic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 190-04332 | Reagent-grade |
| Quinic acid | Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company | 10176328 | Reagent-grade |
| Phosphoric acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 162-20492 | HPLC-grade |
| Trifluoroacetic acid | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 208-02746 | Reagent-grade |
| Methanol | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 131-01826 | Reagent-grade |
| Acetonitrile | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 015-08633 | HPLC-grade |
| Grade cyanidin-3-O-glucoside chloride | Wako Pure Chemical Industries,Ltd | 306-37661 | HPLC-grade |
| Software for analyses | Bruker Optics GmbH | OPUS ver. 6.5 | |
| Softoware for preprocessing | Microsoft | Excel powered by Visual Basic for Applications | |
| Software for construction of models | Freemat 4.0 | http://freemat.sourceforge.net/ |
References
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