Introduction
在神经损伤，近端和远端神经断端经常由神经束的直接调整防止由于病灶部位1-2。通常情况下，轴突束是由轴突高度有序的排列和捆绑，形成连通的复杂网络。然而，神经再生是由于缺乏组织轴突3-4对准一个混乱的过程。因此，为了产生足够数量的再生该桥接病灶部位的轴突，有必要以诱导良好的组织轴突对齐。此外，伴随脱髓鞘由于在损伤部位的髓鞘细胞的死亡神经损伤。由于脱髓鞘强烈损害神经轴突尚存的导电能力，靶向治疗脱髓鞘或促进髓鞘是神经损伤后5功能恢复显著。因此，这个协议的目的是为了说明工程方法，解决这两个问题神经再生。
面各向异性，当沿着不同的轴测量，在材料的物理或机械性能被定义为一个差，已经应用影响细胞对准，生长和迁移6-7。除了地形，还有其他的方法来诱导各向异性。先前，我们研究了通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜的机械静态预拉伸诱导的表面的各向异性。 “强加于大小变形超级”的理论预测，将细胞在拉伸方向感测有效刚度与垂直方向不同，并且在有效刚度这种差异是由于表面各向异性8。间充质干细胞（MSC）上的预拉伸的PDMS膜培养能够通过积极地拉动面，其结果，以感测的各向异性，在预拉伸方向9对齐。同样地，各向异性表面芳从一个机械预拉伸的表面伊辛影响对准，以及生长和髓鞘形成背根神经节的（DRG）轴突10。在这里，我们提供了一个静态预拉伸PDMS基板上诱导表面各向异性以增强轴突再生10的协议。
为了激发轴突对齐，用需要的模式拓扑特征，通过报道排列的纤维和渠道6,11-12提供联系指导，被证明有利于轴突排列11,13。但是，报道了通过拓扑特征，如纤维，频道和图案化诱导轴突对准技术，无法延长并增加轴突的厚度。与此相反，逐步机械拉伸导致更长和更厚的轴突与该拉伸14的幅度增大拉伸方向轴突对齐。然而， 在体内的结合有动力的电机装置不可行。与此相反，静态预拉伸引起的各向异性是不太复杂，并且可以更容易地并入未来支架设计用于体内应用。
在这个协议中，静态预拉伸细胞培养系统用于诱导表面各向异性无拓扑特征。预拉伸培养系统由PDMS膜，可拉伸帧和拉伸阶段，随后该膜被固定到框架和预定的拉伸幅度施加在拉伸阶段。预拉伸表面上培养了21天新鲜分离的DRG神经元中轴突对准和厚度进行监测。接着，雪旺细胞（SC）上的对准轴突为髓鞘监测共培养。通过采用预拉伸诱导表面各向异性，我们能够提高MSC和背根神经节9-10，分别对准细胞分化和轴突对齐增长。
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Protocol
对于细胞的分离所有的程序是由机构动物护理和使用委员会在密歇根州立大学获得批准。
1.预拉伸各向异性表面的制备
- 混合10：基和固化剂的1溶液，将混合物倒入一个组织培养皿（直径12cm）。用4900毫克碱和490毫克的固化剂的总交联混合物。
- 保持在真空下的凝胶混合物20分钟以除去气泡。
- 放置在烘箱中的凝胶混合物过夜固化在60℃下。
- 的PDMS膜固化之后，使用等离子体清洁/刻蚀系统在165毫托3分钟和O 2的65sccm的流处理表面用氧等离子体。
- 切下一块从盘矩形薄膜（5×3.5厘米），而被认识到是哪一方氧处理，确保氧治疗面朝上，并固定到拉伸框架。放置在一个框架拉伸阶段并通过在阶段转动旋钮直到它达到10％伸长均匀伸展;在较长轴9（或某些其他预定拉伸伸长率可以从拉伸阶段被直接读出）。拧紧框架上的螺钉固定伸展。
- 取下阶段框架。确保膜表面是干燥，无粉尘，然后将硅氧烷室在膜允许腔室的粘性侧紧紧附至膜。
注：硅胶室提供了一个良好的保持在PDMS膜细胞培养基。该装置的设计示于图1。 - 消毒用UV表面10分钟。
- 加入1 ml聚-L-赖氨酸（PLL）（在磷酸盐缓冲盐水0.01％），以在腔室中与PDMS表面，等离子处理的6小时内，在37℃下孵育2小时以播种DRG神经元之前。这增强细胞附着。
- 准备标准生长培养基的DRG神经元。
- 之前的隔离，高压灭菌的隔离设备和过滤器的试剂。添加5毫升隔离缓冲成一个6孔板的一个孔中，并将板在冰上。通过加入1毫升的胶原酶A（500U /毫升）至9毫升0.05％胰蛋白酶-EDTA（1毫克/毫升）制备出10毫升离解培养基中，筛选用0.22微米的过滤器，并置于冰上的解决方案。
- 使用十到十二5 - 天的Sprague-Dawley大鼠7为隔离。喷用75％异丙醇的幼仔，并且通过断头牺牲。
- 切去皮肤覆盖从背面脊髓和移除脊柱周围的任何多余的组织。在手术放大镜手术射灯上，从颈部做切口第一，然后沿两边用剪刀脊柱一截。从分离幼仔的尸体脊柱和去除多余的肌肉。然后，用剪刀沿经度切脊椎和使用镊子克轴完全打开脊椎和吸管抽取脊髓cord.Remove尖端创建用于隔离缓冲病种付费转移到无菌的15毫升管一个更大的开口。
- 用细镊子，取出骨口袋里的神经节，并收集大约10 - 双方16 DRG。修剪神经根和神经节转移到冰冷的分离缓冲液。
- 从吸管取出提示创建用于隔离缓冲病种付费转移到无菌的15毫升管一个更大的开口。化学解离后，离心神经节在900 XG和4℃5分钟。
- 让组织沉降到试管底部并轻轻取出顶部的隔离缓冲器和加入10 mL离解培养基进入管。
- 孵育在解离介质的解剖组织在一个37℃的水浴中1小时，同时摇动管每5 - 10分钟。
- 后化学离解，离心机在900 XG的神经节和4℃5分钟。
- 除去上清液并重新悬浮在10ml的标准生长培养基和涡流沉淀。
- 离心离解的细胞作为第2.9指示一次。
- 除去上清液，再暂停于12ml标准培养基和旋涡的沉淀。
3. DRG的文化对预拉伸面
- 之前接种细胞，从室移除PLL方案，并用无菌水和空气干燥冲洗PDMS表面。
- 重新悬浮细胞后，让1的悬浮液组 - 2分钟，以允许碎屑沉降到管底部。添加1.5毫升细胞悬浮液到各伸展腔，并在37℃下孵育5％的CO 2。
- 为了消除神经胶质细胞，在第1天在体外 （DIV），加入10微升（或15微升）氟脱氧2尿苷和尿苷（FDU-U）股票soluti混合物上（见材料数据表 ）至各孔中。 7小时后，更换新鲜标准生长培养基这种介质和放置预拉伸培养装置在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2。
- 在细胞培养期间（2 - 3周），通过用新鲜培养基置换一半的用过的培养基改变媒体每两天。注意：培养2周拉伸未拉伸的表面上后，纯化的SC被添加到腔室和一个星期（步骤4.7）中培养。
4.预拉伸表面雪旺细胞（SCS）与DRG神经元共培养
- 由坎帕纳博士的研究小组先前描述的15种姓隔离。
- 简单地说，从1日龄的小狗隔离旺。收集和分离坐骨神经在化学（胰蛋白酶EDTA和胶原酶A）和机械（18号针头/ 10 ml注射器）15。
- 种子离解的细胞分化成多聚-D-赖氨酸（PDL）共ated T25烧瓶中，并培养在37℃，5％ 的 CO 2。在第5天，用抗Thy 1.1抗体和兔补体纯化通过抗体选择的细胞，并传代培养纯化的细胞通路2 - 4含Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清使用培养基（FBS）的，1％青霉素/链霉素（佩恩/链霉素），21微克/ ml牛垂体提取物（BPE），和4μM的毛喉素。
- 取下的SC培养基，加入5 ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA到烧瓶中。孵育所述细胞在37℃在5％CO 2的2 - 3分钟。
- 检查用10X物镜，看他们是否从烧瓶抬起，然后加入5毫升培养培养基中，并与在烧瓶中的细胞混合在光学显微镜下观察细胞。
- 将细胞悬浮液添加到15ml离心管中并离心，在200 xg离心和20℃5分钟。
- 去除上清，悬浮颗粒的7ml标准DRG增长MEDIA。
- 取10微升细胞悬液到0.5 ml离心管，用10微升台盼蓝的混合，再算上用使用10X物镜光学显微镜下血球细胞数。通过加入DRG生长培养基稀释细胞悬浮液，以每毫升5,000个细胞。
- 从DRG文化在拉伸室中取出0.5毫升培养基中，将0.5ml SC悬浮于DRG文化。
- 培养在37℃和5％的CO 2。更改细胞1周媒体每两天通过用DRG新鲜标准生长培养基替换一半的用过的培养基。 1周共培养后，过程中的细胞通过免疫组织化学10。
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Representative Results
预拉伸的细胞培养系统促进DRG轴突对准10。 DRG神经元中培养到预拉伸和未拉伸的表面12天。轴突染色为β-III微管蛋白，以证明其对准。 图2轴突取向后培养12天的预拉伸和未拉伸的PDMS基底进行比较。背根神经节轴突对齐平行于拉伸方向的，而他们表现出随机取向并形成未拉伸的PDMS衬底上的互连网络。
除了诱导轴突排列，预拉伸引起的各向异性增强轴突震颤。对拉伸的表面上形成轴突束对准的轴突，其从连接的轴突网络不同的未拉伸的表面上观察到。预拉伸表面上的这些束状束类似于神经组织TR在行为体内 。 图3显示了在培养21天前的拉伸，拉伸表面DRG神经元轴突。 如图3示出，聚集在一起的预拉伸衬底上的轴突以形成束，其中出现了类似束状大片。此建议预拉伸表面是能够促进广泛轴突生长在预拉伸的方向，这是在增强的神经组织的再生重要。
为了评估髓鞘，雪旺均与对准轴突共培养。培养2周拉伸未拉伸的表面上的DRG神经元之后，纯化旺加入到腔室和一个星期中培养。在图4中 ，共培养的轴突沾满β-III微管蛋白（绿色），以及雪旺与P0（红色）染色。 P0为成熟的SC的标志物，也是髓鞘的组分，以及考虑髓鞘的指标。有绿色和红色显著共定位的预拉伸表面上，暗示旺附着到轴突拉伸表面上的，但不能在未拉伸的表面，其中在绿色和红色的污渍是随机分布的。预拉伸的表面增强轴突对准，束状状道的形成，和SCS到再生轴突的附着，所有关键为髓鞘形成。
图1：原理图的预拉伸过程 （a）所有 PDMS膜被夹在那些滑动帧的两条。该装置的框架是约7“×5”;括号约为5“×1;对括号夹具大约3”×25“，和杯是约1.5”直径的宽开口的顶部，1“开放的底部，以及约0.25＆＃34;高。 （ 二 ）将帧上的拉伸阶段中，将滚筒转动申请10％伸长，然后通过拧紧螺丝固定条带的位置。 （ 三 ）从伸展台上卸下框架，并附硅腔到膜。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 轴突对齐上预拉伸和未拉伸的表面接种的（ 一 ）静态预拉伸表面上12天的DRG神经元，与接种（b）的未拉伸表面上12天的DRG细胞相比的荧光图像。轴突在预拉伸方向上排列，而轴突未拉伸控制表面上随机排列。轴突小号沾满抗鼠β-III微管蛋白主要抗体，并使用10X物镜共聚焦显微镜成像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 轴突生长厚度在拉伸与无拉伸PDMS基板 （ 一 ）拉伸及（b）在未拉伸的表面21天DRG轴突的相位对比图像。拉伸表面上的轴突形成厚束，而相对于未拉伸表面上的轴突形成相互连接的轴突网络。图像用使用10X物镜反演相衬显微镜拍摄。 请点击此处查看人arger版本这个数字。
图 4： 共培养与对齐的DRG轴突旺上拉伸与未拉伸的PDMS基质中培养2周的拉伸和未拉伸的表面上后，纯化旺加入到腔室和一个星期中培养。 （ 一 ）β-III微管蛋白（绿色）染色拉伸表面上的轴突; （ 二 ）β-III微管蛋白的重叠（绿色）拉伸表面上，P0（红色）染色; （ 三 ）β-III微管蛋白（绿色）染色未拉伸的表面上的轴突; β-III微管蛋白（绿色）（ 四 ）覆盖未拉伸的表面上，P0（红色）染色。上的预拉伸的表面，红色和绿色的污渍共定位，表明的SC连接到并可能髓鞘的轴突。在未拉伸表面上，红色和绿色的污渍是随机分布的，这表明在SCS不附着到轴突。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
为了诱导对预拉伸的表面轴突对准，存在两个关键步骤：1）的PDMS膜必须是平坦的和均匀的厚度;和2）的神经胶质细胞，必须从DRG中移除。混合的PDMS和交联剂并在烘箱中固化后，交联的PDMS凝胶应保持在平坦的工作台上，并仔细处理，以免任何倾斜。的PDMS膜的氧等离子处理之后，应当锁相环涂层6小时内，由于表面的等离子体处理后的亲水性（细胞附着必需）衰减随时间。因为在等离子体处理被施加到膜的一侧，必须小心剥离PDMS断菜后可采取以确保正确的侧被放置在框架上，也就是说，在等离子体处理后的表面应朝上为细胞重视。
所述的DRG位于骨口袋即沿着脊柱对齐内部。由于椎骨的颜色是白色年轻幼仔，难以从椎骨区分的DRG。在这种情况下，以放置接近斑点光脊柱是重要的。根据亮，按病种付费，而骨依然白色不透明变成透明。重要的是要保持在冰上，在生理pH解剖缓冲器中，由于pH值影响神经细胞的生存力是重要的。分离的组织是非常粘稠的，而且往往转移到一个离心管中，当粘到枪头。从而切割吸管的非常尖，以产生一个较大的开口便于传输。
在某些协议，有添加解离缓冲液之前与离体组织所需的一个更离心步骤。代替这一步，我们的协议要求的组织中的解剖缓冲器沉降几分钟，这减少了额外离心步骤，否则将影响细胞的生存力和密度。细胞密度也取决于上幼仔的数量处死，并且因此重要的是要在每次保持幼仔的一致数目。也有与该DRG神经元，从而有丝分裂抑制剂，FDU-U，加入到培养基中以1 DIV抑制神经胶质细胞的生长沿分离胶质细胞。这通常用于在神经元的生长前期以抑制神经胶质细胞，但也有一些协议喜欢arabinofuranosylcytidine（阿糖胞苷），并FDU-U的组合。加入FDU-U的摩尔浓度到培养中的不同的协议不同，取决于分离的细胞的密度。我们发现有丝分裂抑制剂可以添加多次（在步骤3.3中指定的浓度），如需要（如果胶质细胞存在），其全部DRG培养期间。它一般不建议在，因为它影响到DRG神经元的连接任何给定的时间添加大量（超过15微升）。
等离子体处理提高面传热Ë亲水性和PLL涂料提供了充电表面轴突启动附件。根据在参考文献中，等离子体处理诱导亲水性将衰减随着时间的推移，在干燥条件16-17下。然而PDMS将经受与水的液体的条件下缓慢反应，并会从是疏水亲水18逐渐变化。因此，尽管等离子处理衰减随着时间的推移，它不应该影响我们的结果。对于PLL涂层，根据从供应商的产品信息，如果放在有利的条件下它是多年来稳定。一旦细胞附着在锁相环涂层，它们一般不会分离。此外，在PLL涂层有助于与初始附着，并随着细胞生长它们分泌细胞外基质（ECM）蛋白质，其进一步帮助他们保持锚定于表面19。未来的设计改进可能包括嵌入肽进入PD交联时的MS的网络，这将消除在等离子体处理和PLL涂层的步骤。
该协议，在此，描述了产生表面各向异性成功诱导轴突排列，生长和髓鞘形成的工程方法。该方法可通过两种方式进行实验展开。首先，将各向异性表面可以应用在培养创建神经组织，并在体外神经束然后可以在体内被移植。第二，表面各向异性的概念可以纳入，可以在体内被用来增强从损伤部位和髓鞘形成从主机的SC的再生轴突的取向移植支架的设计。相比这需要多个和复杂的装置20-22，以及在加入的生长因子的其他方法，我们的平台是相对简单和容易应用，并且仅依赖于预拉伸，以提高这两种轴突阿里gnment和髓鞘形成，而不需要生长因子的加法。此外，我们已在两个MSC和DRG神经元这很容易被应用于其它类型的细胞的实验设计测试预拉伸的这一概念。采用目前的设计，以调查对2维表面轴突生长，但是在未来的设备可以被升级为使3- dimenstional细胞培养物的测试。在神经修复和移植未来的应用可以纳入预拉伸到从含有控释药物性质沿交联的肽可生物降解的天然或合成材料制成的可移植的支架。
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Acknowledgments
笔者想感谢埃里克·瓦斯科对他的援助在PDMS基板的准备，墉王滨海马塔博士在密歇根大学实验室进行有益的建议和DRG隔离的培训博士和马克Tuszynski博士和博士为有益的建议和协议为SC隔离。W.玛丽·坎帕纳在加州大学圣地亚哥分校。这项研究是由美国国家科学基金会（CBET 0941055和CBET 1510895），美国国立卫生研究院（R21CA176854，R01GM089866和R01EB014986）的部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
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