Introduction
En las lesiones nerviosas, los muñones proximal y distal del nervio a menudo no pueden realineación directa de fascículos nerviosos debido a la zona de la lesión 1-2. Normalmente, los tractos de axones se componen de haces altamente ordenados y alineados de los axones, que forman redes complejas de conectividad. Sin embargo, la regeneración nerviosa es un proceso caótico debido a la alineación del axón mal organizada 3-4. Por lo tanto, para generar un número suficiente de regeneración de los axones que unen el sitio de la lesión, es necesario para inducir la alineación axonal bien organizado. Además, desmielinización acompaña a lesiones del nervio debido a la muerte de las células mielinizantes en el sitio de la lesión. Desde desmielinización deteriora fuertemente la capacidad conductora de sobrevivir a los axones, los tratamientos dirigidos desmielinización o promueven la remielinización son significativos para la recuperación funcional tras la lesión del nervio 5. Así, el objetivo de este protocolo es ilustrar un enfoque de ingeniería que se ocupa de estas dos cuestionesde la regeneración nerviosa.
Anisotropía de superficie, que se define como la diferencia, cuando se mide a lo largo de diferentes ejes, en las propiedades físicas o mecánicas de un material, se ha aplicado a influir en la alineación celular, el crecimiento y la migración 6-7. Además de la topografía, hay otros métodos para inducir anisotropía. Anteriormente, se investigó la anisotropía inducida por la superficie mecánica de pre-estiramiento estático de membrana de poli-dimetil-siloxano (PDMS). La teoría de la "pequeña súper deformación impuesta a gran" predijo que la rigidez efectiva de las células sentido en la dirección estirada difiere de la dirección perpendicular, y esta diferencia en la rigidez efectiva se debe a la anisotropía 8 la superficie. Las células madre mesenquimales (MSCs) cultivadas en una membrana de pre-estirado PDMS son capaces de detectar la anisotropía tirando activamente la superficie y, como resultado, alinear en la dirección de pre-estirado 9. Del mismo modo, un ar superficie anisotrópicaising de una superficie pre-estirado mecánico afecta a la alineación, así como el crecimiento y la mielinización de ganglio de la raíz dorsal (DRG) axones 10. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de la anisotropía de superficie sobre un sustrato pre-estirado estática PDMS para mejorar la regeneración de axones 10.
A fin de obtener la alineación del axón, características topológicas con patrones deseados, reportado por brindar orientación contacto a través de las fibras y los canales 6,11-12 alineados, se demostró para facilitar la alineación axón 11,13. Sin embargo, informó técnicas para la inducción de la alineación del axón a través de características topológicas, tales como fibras, los canales y los patrones, no fueron capaces de alargar y aumentar el grosor de los axones. Por el contrario, gradual estiramiento mecánico llevó a alineación axón en la dirección de estiramiento con axones más largos y más gruesos que el aumento de la magnitud del tramo 14. Sin embargo, la incorporación de un dispositivo de motor alimentado in vivo no esfactible. En contraste, la anisotropía inducida por el pre-estirado estática es menos complicado y se puede incorporar más fácilmente en los futuros diseños de andamios para aplicaciones in vivo.
En este protocolo, un sistema de cultivo de células pre-estirado estático se utiliza para inducir anisotropía superficie sin características topológicas. El sistema de cultivo pre-estirado se compone de una membrana de PDMS, un marco estirable y una etapa de estiramiento, después de lo cual la membrana se fija sobre el marco y una magnitud tramo predeterminado se aplica en la etapa de estiramiento. recién aisladas DRG neuronas cultivadas en la superficie pre-estirado hasta por 21 días son monitoreados para la alineación del axón y grosor. Posteriormente, las células de Schwann (SC) co-cultivadas con los axones alineados están supervisados por la mielinización. Mediante la incorporación inducida de pre-estirado anisotropía superficie hemos sido capaces de mejorar la alineación de células-diferenciación y axón alineación-crecimiento de MSCs y las neuronas DRG 9-10, respectivamente.
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Protocol
Todos los procedimientos para el aislamiento de las células fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Michigan.
1. Preparación de pre-estirado superficial anisotrópico
- Mezclar un 10: 1 solución de base y agente de curado y se vierte la mezcla en una placa de cultivo tisular (12 cm de diámetro). Utilice 4,900 mg de base y 490 mg de agente de curado de la mezcla total de reticulación.
- Mantener la mezcla de gel a vacío durante 20 min para eliminar las burbujas de aire.
- Colocar la mezcla de gel en el horno para el curado durante la noche a 60 ° C.
- Después de que los curas de membrana de PDMS, tratar la superficie con plasma de oxígeno usando un sistema de limpieza / ataque con plasma durante 3 minutos a 165 mTorr y 65 sccm flujo de O2.
- Cortar un trozo de membrana rectangular (5 x 3,5 cm) desde el plato, mientras que ser consciente de qué lado está tratado con oxígeno, asegúrese de que el lado tratado con oxígeno esté orientada hacia arriba y fijar sobre un marco de estiramiento. Coloque el marco en una estiramiento etapa y de manera uniforme estirar girando la perilla en el escenario hasta que llega a 10% de alargamiento (o algún otro tramo predeterminado; el alargamiento se puede leer directamente desde la etapa de estiramiento) en el eje más largo 9. Fijar el tramo apretando los tornillos en el marco.
- Retire el marco de la etapa. Asegúrese de que la superficie de la membrana esté seca y libre de polvo, a continuación, colocar una cámara de silicona sobre la membrana que permite el lado pegajoso de la cámara para fijar firmemente a la membrana.
Nota: La cámara de silicona proporciona un pozo para retener el medio de células en la membrana de PDMS. El diseño del dispositivo se muestra en la Figura 1. - Esterilizar la superficie con UV durante 10 min.
- Añadir 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% en solución salina tamponada con fosfato) a la superficie de PDMS dentro de la cámara, dentro de 6 h de tratamiento con plasma y se incuba durante 2 horas a 37 ° C antes de la siembra de las neuronas DRG. Esto mejora la unión celular.
- Preparar medio de crecimiento estándar para las neuronas DRG.
- Antes de la aislamiento, autoclave el equipo de aislamiento y los reactivos de filtro. Añadir 5 ml de tampón de aislamiento en un pocillo de una placa de 6 pocillos, y se coloca la placa en hielo. Preparar 10 ml de medio de disociación mediante la adición de 1 ml de colagenasa A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtrar las soluciones con un filtro de 0,22 micras y el lugar en el hielo.
- Utilice diez a doce de 5 - 7 días de edad ratas Sprague-Dawley para el aislamiento. Pulverizar las crías, con un 75% de isopropanol, y el sacrificio por decapitación.
- Cortar la piel que recubre la médula espinal de la parte posterior y eliminar cualquier exceso de tejido alrededor de la columna vertebral. Bajo una lupa quirúrgica con las luces del punto quirúrgicas en, hacer la primera incisión en el cuello y luego un corte a lo largo de la columna vertebral en ambos lados con unas tijeras. Separar la espina dorsal del cuerpo de los cachorros y eliminar el exceso de músculos. A continuación, utilice unas tijeras para cortar a lo largo de la long eje de las pinzas de la columna vertebral y utilizar para abrir completamente la columna vertebral y extraer la médula cord.Remove la punta de una pipeta para crear una abertura más grande para la transferencia de los GRD con tampón de aislamiento en un tubo estéril de 15 ml.
- El uso de un buen par de pinzas, extraer el ganglio del bolsillo hueso y recoger aproximadamente 10-16 DRG de ambos lados. Recortar las raíces nerviosas y la transferencia de los ganglios al tampón de aislamiento enfriado con hielo.
- Retire la punta de una pipeta para crear una abertura más grande para la transferencia de los GRD con tampón de aislamiento en un tubo estéril de 15 ml. Después de la disociación química, centrifugar los ganglios a 900 xg y 4 ° C durante 5 min.
- Deje que los tejidos se depositan en el fondo del tubo y suavemente retire el tampón de aislamiento en la parte superior y añadir 10 ml de medio de disociación en el tubo.
- Incubar los tejidos disecados en el medio de disociación en un baño de agua a 37 ° durante 1 hora mientras se agitaba el tubo de cada 5 a 10 min.
- Despuésla disociación química, centrifugar los ganglios a 900 xg y 4 ° C durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de crecimiento estándar y de vórtice.
- Centrifugar las células disociadas como se indica en la sección 2.9, una vez más.
- Eliminar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en 12 ml de medio de crecimiento estándar y vórtice.
3. Cultura de DRG en pre-estirada de superficie
- Antes de sembrar las células, eliminar las soluciones de PLL de la cámara y enjuagar la superficie de PDMS con agua estéril y secar al aire.
- Después de volver a suspender las células, permitir que el conjunto de suspensión para 1-2 min para permitir que los desechos se deposite en el fondo del tubo. Añadir 1,5 ml de suspensión celular en cada cámara de estiramiento y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Para eliminar las células gliales, en el día 1 in vitro (DIV), añadir 10 l (15 l) o mezcla de fluoro-2-desoxi uridina y uridina (FDU-T) stock solutien (Véase la Tabla de Materiales) a cada pocillo. Después de 7 h, reemplazar este medio con medio de crecimiento estándar fresco y colocar el dispositivo de cultivo pre-estirado en una incubadora de 37 ° C con 5% de CO 2.
- Durante el período de cultivo celular (2 - 3 semanas), cambiar los medios de comunicación cada dos días, reemplazando la mitad del medio gastado con medio fresco. Nota: Después de cultivar en las superficies estiradas y no estiradas para 2 semanas, SCs purificados se añaden a la cámara y se cultivaron durante otra semana (paso 4.7).
4. Co-cultivo de células de Schwann (SCS) con DRG neuronas en la pre-estirada de superficie
- Aislar las SC como se describe anteriormente por el grupo del Dr. 15 Campana.
- En resumen, aislar el SC de un cachorro de 1 día. Recoger y disociar los nervios ciáticos tanto química (tripsina-EDTA y colagenasa A) y mecánicamente (calibre 18 agujas / jeringas de 10 ml) 15.
- Sembrar las células disociadas en poli-D-lisina (PDL) coado matraz T25 y el cultivo a 37 ° C en 5% de CO 2. En el día 5, purificar las células a través de la selección de anticuerpos utilizando anti-Thy 1.1 anticuerpo y complemento de conejo y el subcultivo de las células purificadas a paso 2 - 4. medio Uso de cultivo que contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% de suero bovino fetal (FBS) , 1% penicilina / estreptomicina (Penn / Strep), 21 mg / ml bovina pituitaria extracto (BPE), y 4 M forskolina.
- Retire el medio de cultivo de las castas, y añadir 5 ml de 0,05% tripsina-EDTA en el matraz. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO2 durante 2 a 3 min.
- Verificar si las células bajo el microscopio óptico utilizando un objetivo 10X para ver si se levantan del matraz, a continuación, añadir 5 ml de medio de cultivo y se mezcla con las células en el matraz.
- Añadir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg y 20 ° C durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 7 ml de medicina de crecimiento estándar DRGI a.
- Tomar 10 l de suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, se mezcla con 10 l de azul de tripano, y luego contar el número de células utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico utilizando un objetivo 10X. Se diluye la suspensión celular a 5.000 células por ml mediante la adición de medio de crecimiento DRG.
- Retirar 0,5 ml de medio del cultivo de DRG en la cámara de estirado y añadir 0,5 ml de la suspensión SC a la cultura DRG.
- Cultivar las células durante 1 semana a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambiar los medios de comunicación cada dos días mediante la sustitución de la mitad del medio gastado con medio de crecimiento estándar fresco para la DRG. Después de 1 semana de co-cultivo, proceso de las células mediante técnicas de inmunohistoquímica 10.
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Representative Results
El sistema de cultivo celular pre-estirada promovido DRG alineación axón 10. DRG neuronas se cultivaron sobre superficies pre-estiradas y sin estirar durante 12 días. Los axones fueron teñidos para β-III-tubulina para demostrar su alineación. La Figura 2 compara la orientación axón en el PDMS pre-estirados y sin estirar sustratos después de 12 días de cultivo. Los axones DRG alineados paralelamente a la dirección de estirado, mientras que mostraron alineación aleatoria y forman una red interconectada en el sustrato PDMS sin estirar.
Además de inducir la alineación axon, la anisotropía de pre-estirado inducido mejoró la fasciculación de los axones. Los axones alineados sobre los haces de axones forman la superficie estirada, que diferían de la red axonal conectado observan en la superficie sin estirar. Estos haces fasciculares sobre la superficie pre-estirada se parecían a tr tejido nerviosoactos en vivo. La Figura 3 muestra los axones de las neuronas DRG en las superficies pre-estiradas y sin estirar después de 21 días de cultivo. Como muestra la Figura 3 ilustra, los axones en el sustrato pre-estirada agregados juntos para formar haces, que parecían similares a extensiones fasciculares. Esto sugirió la superficie pre-estirada fue capaz de promover el crecimiento extensivo del axón en la dirección de la pre-estirado, que son importantes en el aumento de la regeneración del tejido nervioso.
Para evaluar la mielinización, SCs se co-cultivaron con los axones alineados. Después de cultivar las neuronas DRG en las superficies estiradas y no estiradas para 2 semanas, se añadieron SCs purificada a la cámara y se cultivaron durante una semana más. En la Figura 4, los axones del co-cultivo se tiñen con β-III-tubulina (verde), y los CSs se tiñen con P0 (rojo). P0 es un marcador de maduro SC y es también un componente de la vaina de mielina,así como considerado un indicador de la mielinización. Existe un importante co-localización de verde y rojo en la superficie pre-estirado, sugestivo de SCs inherentes a los axones en la superficie estirada, pero no en la superficie sin estirar donde las manchas verdes y rojos están distribuidos al azar. Las superficies de pre-estirado mejorada alineación axón, la formación del tracto fascicular similar, y la unión de las SC a los axones regenerados, todos críticos para la mielinización.
Figura 1:. Esquema para el procedimiento de pre-estirado (a) Un pedazo de membrana de PDMS se recorta en dos tiras de la trama que pueden deslizarse. El bastidor del dispositivo es de aproximadamente 7 "x 5"; los frenos son aproximadamente 5 "x 1; las abrazaderas en los frenos son cerca de 3" x 25 ", y la copa es de aproximadamente 1,5" de diámetro superior abierta, 1 "fondo abierto, y aproximadamente 0,25 & #34; alto. (B) Coloque el marco en la etapa de estiramiento, gire el rodillo para aplicar 10% de alargamiento, y luego fijar las posiciones de las tiras apretando los tornillos. (C) Retire el marco de la etapa de estiramiento, y adjuntar una cámara de silicio sobre la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Alineación de Axon en Pre-estirado y sin estirar Superficie imágenes fluorescentes de las neuronas DRG sembradas en el (a) la superficie pre-estirada estática durante 12 días, en comparación con las células sembradas en el DRG (b) la superficie no estirada durante 12 días.. Los axones alineados en la dirección de pre-estirado, mientras que los axones alineadas al azar sobre la superficie de control sin estirar. Axons se tiñeron con el anticuerpo primario anti-tubulina de ratón β-III, y la imagen con microscopio confocal utilizando un objetivo 10X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Axon Espesor del crecimiento en el estirada vs sin estirar PDMS Sustrato imágenes de contraste de fase de los axones DRG en (a) se estiró y (b) las superficies sin estirar después de 21 días.. Los axones en la superficie estirado forman haces más gruesas, mientras que en la superficie sin estirar los axones forman la red axonal interconectados. Las imágenes fueron tomadas con el microscopio de contraste de fase inversed utilizando un objetivo 10X. Por favor, haga clic aquí para ver la colArger versión de esta figura.
Figura 4:. SCs con Alineados DRG Los axones co-cultivadas en estirada vs. Unstretched PDMS Sustratos Después de cultivar en las superficies estiradas y no estiradas para 2 semanas, se añadieron SCs purificada a la cámara y se cultivaron durante una semana más. (A) β-III-tubulina (verde) para la tinción de los axones en la superficie estirada; (B) Superposición de β-III-tubulina (verde), P0 (rojo) tinción en la superficie estirada; (C) β-III-tubulina (verde) para la tinción de los axones en la superficie sin estirar; (D) de superposición de β-III-tubulina (verde), P0 (rojo) tinción en la superficie sin estirar. En la superficie pre-estirado, las manchas rojas y verdes colocalize, lo que sugiere la SC están unidos a myelinating y es probable que los axones. Por no estiradasuperficie, las manchas rojas y verdes se distribuyen al azar, lo que sugiere la ESO no están unidos a los axones. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para inducir la alineación axón en la superficie pre-estirado, hay dos pasos críticos: 1) la membrana de PDMS debe ser plana y de un espesor homogéneo; y 2) las células gliales se deben retirar de la DRG. Después de mezclar el PDMS y agente de reticulación y curado en un horno, el gel reticulado PDMS debe mantenerse en la cima de banco plano y manejarla con cuidado para evitar cualquier inclinación. El tratamiento con plasma de oxígeno de la membrana de PDMS se debe seguir dentro de 6 h por recubrimiento de PLL, ya que la hidrofilicidad de la superficie (necesario para la unión de las células) después de tratamiento con plasma atenúa con el tiempo. Puesto que el tratamiento con plasma se aplica a un lado de la membrana, se debe tener cuidado después de pelar los PDMS de la antena para asegurar que el lado correcto se coloca en el marco, es decir, la superficie tratada con plasma debe estar hacia arriba para que las células adjuntar a.
Los GRD se encuentran dentro de los bolsillos de hueso que se alinean junto a la columna vertebral. Puesto que el color de la vértebra es de color blanco encachorros jóvenes, es difícil distinguir los GRD de la vértebra. En este caso, es importante colocar la columna vertebral cerca de la luz del punto. Bajo la luz, los GRD transparente vuelta, mientras que los restos óseos blanco y opaco. Es importante mantener el tampón de disección sobre hielo y a un pH fisiológico, ya que el pH influye en la viabilidad de las células neuronales. Los tejidos aislados son muy viscoso y tienden a pegarse a la punta de la pipeta al transferir a un tubo de centrífuga. Por lo tanto el corte de la punta de la pipeta para generar una abertura mayor facilita la transferencia.
En algunos protocolos, existe un paso más centrifugación requerido con los tejidos aislados antes de añadir el tampón de disociación. En lugar de este paso, el protocolo requiere que los tejidos para instalarse en el tampón de disección durante un par de minutos, lo que reduce el paso de centrifugación adicional que de otro modo afectar la viabilidad y la densidad de las células. La densidad celular también dependeen el número de crías sacrificado, y por lo tanto es importante mantener un número constante de crías de cada vez. También son células gliales que están aislados a lo largo de las neuronas DRG, por tanto, un inhibidor mitótico, FDU-T, se añade al medio de cultivo en 1 DIV para suprimir el crecimiento de las células gliales. Esto es comúnmente utilizado para inhibir las células gliales durante el período de crecimiento inicial de las neuronas, aunque algunos protocolos prefieren una combinación de arabinofuranosylcytidine (AraC) y FDU-U. La concentración molar de FDU-U añade al cultivo varía en los diferentes protocolos, dependiendo de la densidad de las células aisladas. Nos pareció que el inhibidor de la mitosis se puede añadir varias veces (a la concentración especificada en el paso 3.3), según sea necesario (si las células gliales están presentes), durante toda la cultura DRG. Por lo general, no se recomienda añadir una gran cantidad (más de 15 l) en un momento dado, ya que afecta a la fijación de las neuronas DRG.
El tratamiento con plasma mejora la superfie hidrofilicidad y el recubrimiento de PLL proporciona una superficie cargada de axones para iniciar archivo adjunto. Según referencias en la literatura, la hidrofilicidad inducida por tratamiento con plasma atenuará con el tiempo, en condiciones secas 16-17. Sin embargo PDMS se someterá a una reacción lenta con agua en condiciones de líquido y cambiará gradualmente de ser hidrófobo para hidrófilo 18. Por lo tanto a pesar de que el tratamiento con plasma atenúa con el tiempo, no debería afectar a los resultados. Para el recubrimiento de PLL, de acuerdo con la información del producto del proveedor, es estable durante años si se coloca en condiciones favorables. Una vez que las células se adhieren sobre el recubrimiento de PLL, por lo general no se separarán. Además, el recubrimiento de PLL ayuda a la unión inicial, y como las células crecen secretan matriz extracelular (ECM), proteínas que ayudan aún más a permanecer anclado a la superficie 19. mejoras en el diseño futuro podrían ser los péptidos se incrustan en el PDMS red durante la reticulación, lo que eliminaría el tratamiento con plasma y etapas de recubrimiento de PLL.
El protocolo, en este documento, se describe un enfoque de ingeniería que genera la anisotropía de superficie para inducir con éxito la alineación axón, el crecimiento y la mielinización. El enfoque se puede ampliar de forma experimental en dos maneras. En primer lugar, la superficie anisotrópica se podría aplicar para crear tejidos nerviosos en cultivo, y las vías nerviosas in vitro podría entonces ser transplantado in vivo. En segundo lugar, el concepto de la anisotropía de superficie podría ser incorporado en el diseño de los andamios trasplantables que podría ser utilizado in vivo para mejorar la alineación de los axones de la regeneración de la zona de la lesión y la mielinización de los SCs de acogida. En comparación con otros enfoques que requieren múltiples y complicados dispositivos 20-22, así como la adición de factores de crecimiento, nuestra plataforma es relativamente simple y fácil de aplicar, y se basa sólo en pre-estiramiento para mejorar tanto axón alignment y mielinización sin la necesidad para la adición del factor de crecimiento. Además, hemos probado este concepto de pre-estiramiento en el diseño experimental en ambos MSC y neuronas DRG que fácilmente se podría aplicar a otros tipos de células. El diseño actual se utilizó para investigar el crecimiento axonal en las superficies de 2 dimensiones, sin embargo, en el futuro, el dispositivo podría ser actualizado para permitir el ensayo de cultivos celulares 3-dimenstional. Las aplicaciones futuras en la reparación del nervio y el trasplante podrían incorporar pre-estirado en los andamios para trasplantes realizados a partir de materiales naturales o sintéticos biodegradables que contienen péptidos reticulados, junto con las propiedades de la droga de liberación controlada.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Eric Vasco por su ayuda en la preparación de los sustratos de PDMS, el Dr. Wang Shiyong en el laboratorio del Dr. Mata Marina de la Universidad de Michigan para sugerencias y la formación del aislamiento DRG votos, y el Dr. Mark Tuszynski y el Dr. . W. Marie Campana en UC San Diego por sus útiles sugerencias y protocolo para el aislamiento SC. Este estudio fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0941055 y 1510895 EBNC), el Instituto Nacional de Salud (R21CA176854, R01GM089866, y R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
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