Introduction
בפגיעות עצבים, גדמי הפרוקסימלי ועצב דיסטלי מנועים לעתים קרובות מן ההתכנסות ישירה של fascicles עצב בשל באתר הנגע 1-2. בדרך כלל, קטעי האקסון מורכבים הורה מאוד ומיושר צרורות של אקסונים, המהווים רשתות מורכבות של קישוריות. עם זאת, התחדשות של עצבים היא תהליך כאוטי עקב יישור האקסון מאורגן היטב 3-4. לכן, כדי ליצור כמות מספקת של התחדשות אקסונים כי לגשר על אתר הנגע, יש צורך להשרות יישור אקסונלית מאורגן היטב. בנוסף, פגיעה במיאלין מלווה פציעות עצב בשל מות התאים myelinating במקום הפציעה. מאז demyelination מאוד פוגע קיבולת המוליך לשרוד אקסונים, טיפולי מיקוד demyelination או קידום מיאלין מחדש הם משמעותיים עבור התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית 5. לכן המטרה של פרוטוקול זה היא להמחיש גישה הנדסית מטפלת בשני נושאים אלושל התחדשות של עצבים.
אנאיזוטרופיה Surface, אשר מוגדרת כהבדל, כאשר נמדדו לאורך צירים שונים, בתוך התכונות הפיסיקליות או מכאניות של חומר, יושמה להשפיע יישור תא, צמיחה, והגירת 6-7. בנוסף טופוגרפיה, ישנן שיטות אחרות כדי לגרום אנאיזוטרופיה. בעבר, חקרנו אנאיזוטרופיה משטח המושרה על ידי מראש מתיחה סטטית מכני של פולי-דימתיל-siloxane (PDMS) קרום. התאוריה של "סופר עיוות קטן המוטל על גדול" חזתה כי הנוקשות היעילות התאים לחוש בכיוון נמתח נבדלו בכיוון ניצב, וההבדל הזה נוקשות יעילות הוא בשל שטח אנאיזוטרופיה 8. בתאי גזע mesenchymal (MSCs) בתרבית על קרום מראש נמתח PDMS מסוגלים לחוש את אנאיזוטרופיה ידי משיכת משטח פעיל וכתוצאה מכך, ליישר בכיוון מראש נמתח 9. באופן דומה, ar משטח איזוטרופיאייסינג ממשטח מראש נמתח מכני משפיע על יישור, כמו גם צמיחה myelination של גנגליון השורש הגבי (DRG) אקסונים 10. כאן אנו מספקים פרוטוקול גרימת אנאיזוטרופיה השטח על מצע PDMS מראש נמתח סטטי כדי לשפר התחדשות האקסון 10.
כדי לעורר יישור האקסון, תכונות טופולוגי עם דפוסים רצויים, דיווח על מנת לספק הדרכת קשר באמצעות סיבים מיושרים וערוצים 6,11-12, הודגמו כדי להקל יישור האקסון 11,13. עם זאת, דיווח טכניקות גרימת יישור האקסון באמצעות תכונות טופולוגי, כגון סיבים, ערוצי דפוסים, לא הצליח להאריך ולהגדיל את העובי של אקסונים. לעומת זאת, הדרגתי מכאני מתיחה הוביל יישור האקסון לכיוון המתיח עם אקסונים ארוך ועבה כי גדל עם הגודל של המתיחה 14. עם זאת, כולל התקן מנוע מופעל vivo אינואפשרי. לעומת זאת, אנאיזוטרופיה סטטי מושרה מראש נמתחת היא פחות מסובכת ויכולה להיות משולבת יותר בקלות לתוך עיצובי פיגום בעתיד ליישומי in vivo.
בפרוטוקול זה, מערכת תרבית תאים טרום נמתח סטטי משמש לגרום אנאיזוטרופיה משטח ללא תכונות טופולוגי. מערכת ההתרבות נמתח מראש מורכב קרום PDMS, מסגרת stretchable ובמה מתיחה, ואז הממברנה מקובע המסגרת בסדר גודל למתוח מראש מוחל על הבמה המתיחה. טרי מבודד נוירונים DRG מתורבת על פני השטח טרום נמתח עד 21 ימים מנוטרים ליישור ועובי האקסון. כתוצאה מכך, תאי שוואן (SCS) שיתוף תרבותי עם אקסונים המיושרים מנוטרים עבור מעטפת המיאלין. על ידי שילוב אנאיזוטרופיה משטח המושרה מראש למתוח הצלחנו לשפר התא יישור-בידול האקסון יישור-צמיחה של MSCs ונוירונים DRG 9-10, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים עבור בידוד של תאים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת שטח אניזוטרופי טרום נמתח
- מערבבים 10: 1 פתרון של הבסיס סוכן ריפוי ויוצקים את התערובת לתוך צלחת בתרבית רקמה (12 ס"מ קוטר). השתמש 4,900 בסיס מ"ג ו -490 מ"ג סוכן ריפוי עבור תערובת crosslinking הכולל.
- לשמור את תערובת ג'ל תחת ואקום במשך 20 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- מניחים את התערובת ג'ל בתנור ריפוי לילה בשעה 60 ° C.
- לאחר מרפא קרום PDMS, לטיפול פני השטח עם פלזמה חמצן באמצעות מערכת ניקוי פלזמה / תחריט 3 דקות ב 165 mTorr ו -65 זרימת SCCM של O 2.
- חותכים חתיכה של קרום מלבני (5 × 3.5 ס"מ) מצלחת, בעת היותו מודע באיזה צד הוא שטופלו בחמצן, לוודא בצד שטופלו חמצן הוא פונה כלפי מעלה ולתקן על מסגרת מתיחה. מניח את המסגרת על מתיחה הבמה למתוח באופן שווה על ידי סיבוב הכפתור על הבמה עד שהוא מגיע 10 התארכות% (או כמה למתוח שנקבע מראש אחרים; התארכות ניתן לקרוא ישירות מהבמה מתיחה) ב 9 ציר זמן ארוך יותר. תקן את המתיחה על ידי הידוק הברגים על המסגרת.
- הסר את המסגרת מהבמה. ודא פני השטח קרום יבש ונקי אבק, ולאחר מכן למקם בתא סיליקון על הממברנה ומאפשר הצד הדביק של החדר לצרף בחוזקה הממברנה.
הערה: תא סיליקון מספק גם עבור שמירה על המדיום הסלולרי על הממברנה PDMS. עיצוב המכשיר מוצג באיור 1. - לעקר את פני השטח עם UV למשך 10 דקות.
- הוסף 1 מ"ל פולי- L- ליזין (PLL) (0.01% ב בופר פוספט) אל פני השטח PDMS בתוך החדר, בתוך 6 שעות של טיפול פלזמה דגירה במשך שעה 2 ב 37 ° C לפני זריעת נוירונים DRG. זה משפר מצורף תא.
- כן בינוני צמיחה סטנדרטי עבור נוירונים DRG.
- לפני הבידוד, חיטוי ציוד בידוד מכשור לאספקת מים. הוסף 5 מ"ל של חיץ בידוד לתוך אחד טוב של צלחת 6-היטב, ומניחים את הצלחת על קרח. הכן 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה על ידי הוספת 1 מ"ל של collagenase (500 U / ml) עד 9 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1 מ"ג / מ"ל), לסנן הפתרונות עם מסנן 0.22 מיקרומטר ומניחים על קרח.
- משתמש בו עשרה כדי שתים עשרה 5 - '7 ימים ישנות חולדות Sprague-Dawley עבור הבידוד. רסס את הגורים עם 75% isopropanol, ולהקריב על ידי עריפת ראש.
- לחתוך את העור שמעל חוט השדרה מהחלק האחורי להסיר את כל רקמה עודפת סביב עמוד השדרה. תחת זכוכית מגדלת כירורגית עם האורות במקום כירורגית על, לבצע את החתך הראשון מהצוואר ואז חתך אחד לאורך עמוד השדרה משני הצדדים עם מספריים. לנתק את עמוד השדרה מהגוף של הגורים ולהסיר את השרירים העודפים. לאחר מכן, להשתמש במספריים לחתוך לאורך לוןציר גרם של פינצטה השדרה ושימוש כדי לפתוח את עמוד השדרה לגמרי ולחלץ את השדרה cord.Remove קצה מן פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי.
- באמצעות פינצטה בסדר, להסיר את גנגליון מכיס העצם ולאסוף כ -10 - 16 DRG משני הצדדים. חתוך את שורשי העצבים ולהעביר את הגרעינים למאגר בידוד קר כקרח.
- הסר את טיפ פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר להעברת DRGs עם חיץ בידוד לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי. לאחר הניתוק הכימי, צנטריפוגה הגרעינים ב 900 XG ו -4 C ° למשך 5 דקות.
- תנו רקמות ליישב לתחתית של התחתית ובעדינות להסיר את החיץ בידוד על גבי ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה לתוך הצינור.
- דגירת הרקמות הגזורות במדיום דיסוציאציה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 תוך רעד הצינור כל 5 - 10 דקות.
- לאחרהדיסוציאציה, צנטריפוגות כימיים הגרעינים ב 900 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant מחדש להשעות הגלולה ב 10 מיליליטר תקשורת צמיחה סטנדרטית מערבולת.
- צנטריפוגה תאים ניתקו כמצוין בסעיף 2.9 שוב.
- הסר את supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 12 מיליליטר של תקשורת מערבולת צמיחה הסטנדרטית.
3. תרבות של DRG על משטח טרום נמתח
- לפני זריעת התאים, להסיר את פתרונות PLL מהאולם לשטוף את המשטח PDMS עם יבש מים ואוויר סטרילי.
- לאחר בדיקה חוזרת של השעיית תאים, תיתן את הסט ההשעיה עבור 1 - 2 דקות, כדי לאפשר את הפסולת כדי ליישב לתחתית של התחתית. הוסף 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לתוך תא למתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- כדי לחסל ותאי גלייה, ב 1 יום במבחנה (DIV), להוסיף 10 μl (או 15 μl) תערובת של soluti המניות fluoro-2 deoxy-uridine ו uridine (FDU-U)על (ראה טבלה של חומרים) זה טוב. לאחר 7 שעות, להחליף בינוני עם מדיום גידול רגיל טרי מצמיד את התקן התרבות טרום נמתח באינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2.
- בתקופת תרבית תאים (2 - 3 שבועות), לשנות את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום חדש. הערה: לאחר culturing על המשטחים נמתחים unstretched עבור 2 שבועות, גיל מטוהרים מתווספים הקאמרי בתרבית למשך שבוע נוסף (שלב 4.7).
4. משותף תרבות של תאי שוואן (SCS) עם DRG נוירונים על פני שטח טרום נמתחו
- לבודד גיל כפי שתואר על ידי הקבוצה של ד"ר קמפנה בעבר 15.
- בקצרה, לבודד את הגיל מאז שהיה גור קטן בן 1 יום. האיסוף לנתק את העצבים הנשה הוא כימי (טריפסין-EDTA ו- A Collagenase) מכאני (18 מחט מד / 10 מזרק מיליליטר) 15.
- זרעי התאים ניתקו לתוך פולי- D- ליזין (PDL) במשותףבקבוק ותרבות T25 ated ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. ביום 5, לטהר את התאים דרך בחירת נוגדנים באמצעות אנטי-עמך 1.1 נוגדן ארנב להשלים תת התאים המטוהרים למעבר 2 - 4. בינוני השתמש תרבות המכיל בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור עוברי (FBS) פניצילין, 1% / סטרפטומיצין (פן / סטרפטוקוקוס), 21 מיקרוגרם / מ"ל שור יותרת המוח חלץ (BPE), ו -4 מיקרומטר Forskolin.
- הסר בינוני תרבות מן גיל, ולהוסיף 5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על 2 - 3 דקות.
- בדוק התאים תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X כדי לראות אם הם להרים מהבקבוק, ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של מדיום תרבות ומערבבים עם התאים את הבקבוק.
- מוסיפים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 200 ו -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 7 מ"ל med צמיחה DRG תקןIA.
- קח 10 μl של השעיה התא לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, לערבב עם 10 μl של trypan כחול, ולאחר מכן לספור את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות המטרה 10X. לדלל את השעית תא 5,000 תאים לכל מיליליטר ידי הוספת תקשורת צמיחת DRG.
- הסר 0.5 מ"ל של מדיום מתרבות DRG בתא נמתח ולהוסיף 0.5 מ"ל של השעיה SC לתרבות DRG.
- התרבות התאים במשך שבוע 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שנה את התקשורת בכל יומיים על ידי החלפת מחצית בינונית בילה עם מדיום הגידול רגיל טרי DRG. לאחר 1 בשבוע שיתוף תרבות, תהליך התאים על ידי אימונוהיסטוכימיה 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת תרבית תאים טרום נמתח קדמה יישור האקסון DRG 10. נוירונים DRG היו בתרבית על משטחים מראש נמתח unstretched במשך 12 ימים. האקסונים היו מוכתמים עבור β-III טובולין להפגין יישור שלהם. איור 2 משווה אוריינטציה האקסון על מצעים PDMS מראש נמתח unstretched לאחר 12 ימים של תרבות. אקסונים DRG מיושרים במקביל לכיוון הנמתח, ואילו הם הראו יישור אקראי יצרו רשת המקושרים ביניהם על פני מצע PDMS unstretched.
בנוסף גרימת יישור האקסון, אנאיזוטרופיה המושרה מראש למתוח הגבירה את fasciculation של אקסונים. האקסונים מיושרים על משטח נמתח חבילות אקסונלית נוצרו, אשר שונה מרשת אקסונלית המחוברת שנצפו על פני שטח unstretched. חבילות fascicular אלה על פני השטח טרום נמתח דמה tr רקמת העצביםמעשים in vivo. איור 3 מראה אקסונים של נוירונים DRG על משטחים מראש נמתח unstretched לאחר 21 ימים של תרבות. כפי שניתן לראות בתרשים 3 מדגים, אקסונים על פני המצע מראש נמתח מצטבר יחד כדי ליצור חבילות, שהופיעו דומה שטחי fascicular. זה הציע את השטח מראש נמתח הצליח לקדם את צמיחת האקסון נרחב בכיוון של למתוח מראש, אשר חשובים בשיפור התחדשות של רקמת העצבים.
כדי להעריך myelination, הגיל היה שיתוף תרבותי עם אקסונים המיושרים. לאחר culturing נוירונים DRG על המשטחים נמתחים unstretched עבור 2 שבועות, גיל מטוהרים נוסף לתא ותרבותי במשך שבוע נוסף. באיור 4, האקסונים של תרבות שיתוף מגואלות β-III טובולין (ירוק), ואת גיל מגואלות P0 (אדום). P0 הוא סמן של גיל הבוגרת היא גם מרכיב של מעטפת המיאלין,וכן נחשב כאינדיקטור של מעטפת המיאלין. יש לוקליזציה שיתוף משמעותי של ירוק ואדום על פני השטח טרום נמתח, רמיזות של גיל הנלוות אקסונים על פני השטח מתוח, אבל לא על פני השטח unstretched שבו כתמים ירוקים ואדומים מופצים באופן אקראי. המשטחים מראש נמתח משופרים יישור האקסון, fascicular דמוי היווצרות בדרך, וצירוף גיל אקסונים מחדש, דבר הקריטי עבור מעטפת המיאלין.
איור 1:. סכמטי לעניין הליך קדם-מתיחה (א) פיסת הממברנה PDMS הוא הועתק על שתי רצועות של המסגרת כי הם slidable. המסגרת של המכשיר היא כ 7 "x 5"; את הפלטה עומדת 5 "x 1; מלחציים על הפלטה עומדים 3" x .25 ", ואת הכוס על 1.5" עליון בקוטר רחב פתוח, 1 "תחתי פתוח, וכ 0.25 & #34; גָבוֹהַ. (ב) מניח את המסגרת לבמה המתיחה, מסובב את הגליל כדי להחיל 10 התארכויות%, ולאחר מכן לתקן את עמדותיהם של הרצועות ידי הידוק הברגים. (ג) הסר את מסגרת משלב מתיחות, ולצרף תא סיליקון על הממברנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אקסון המערך על-נמתח Pre ו- Surface Unstretched תמונות פלורסנט של נוירונים DRG זורעים על (א) משטח מראש נמתח סטטי במשך 12 ימים, לעומת תאי DRG זורעים על (ב) משטח unstretched במשך 12 ימים.. האקסונים מיושרים לכיוון מראש נמתח, בעוד אקסונים מיושרים באופן אקראי על משטח שליטת unstretched. אקסוןהים הוכתם נוגדן ראשוני טובולין אנטי עכבר β-III, צלם עם מיקרוסקופ confocal באמצעות מטרת 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אקסון עובי צמיחה על מתוח מול Unstretched PDMS המצע בניגוד שלב תמונות של אקסונים DRG על (א) נמתח (ב) משטחים unstretched לאחר 21 ימים.. אקסונים על המשטח נמתח נוצרו צרורות עבות, בעוד על פני שטח unstretched האקסונים יצרו רשת axonal בין מחוברים. תמונות צולמו באמצעות שלב inversed מיקרוסקופ לעומת באמצעות המטרה 10X. אנא לחץ כאן על מנת לצפות אלגרסת arger של נתון זה.
איור 4:. שיתוף תרבותי גיל עם מזדהות DRG אקסונים על מתוח מול Unstretched PDMS מצעים לאחר culturing על משטחים נמתח unstretched עבור 2 שבועות, גיל מטוהרים נוספו לתא ותרבותי במשך שבוע נוסף. (א) β-III טובולין (ירוק) מכתים עבור אקסונים על משטח נמתח; (ב) כיסוי של β-III טובולין (ירוק), P0 (אדום) מכתים על פני השטח מתוח; (ג) β-III טובולין (ירוק) מכתים עבור אקסונים על פני השטח unstretched; (ד) כיסוי של β-III טובולין (ירוק), P0 (אדום) מכתים על פני השטח unstretched. על פני השטח טרום נמתח, הכתמים האדומים וירוקים colocalize, דבר המצביע על הגיל מחובר וסביר myelinating האקסונים. על unstretchedשטח, את הכתמים האדומים וירוקים מופצים באופן אקראי, דבר המצביע על הגיל אינם מצורפות האקסונים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לגרום יישור האקסון על משטח מראש נמתח, ישנם שני שלבים קריטיים: 1) קרום PDMS חייב להיות שטוח של עובי אחיד; ו -2) ותאי גלייה חייב יוסר DRG. לאחר ערבוב PDMS ו crosslinker וריפוי בתנור, הג'ל PDMS crosslinked צריך להישמר על גבי ספסל שטוח מטופל בזהירות כדי למנוע הטיה. טיפול פלזמת החמצן של קרום PDMS יש לפעול בתוך 6 שעות על ידי ציפוי PLL, מאז hydrophilicity של פני השטח (חובה עבור התקשרות תא) לאחר טיפול פלזמה פוחת לאורך זמן. מאז טיפול הפלזמה מוחל צד אחד של הקרום, יש להקפיד אחרי קילוף PDMS את המנה כדי להבטיח את הצד הנכון מושם על המסגרת, כלומר, פני השטח שטופל הפלזמה צריך לפנות כלפי מעלה עבור התאים לצרף.
DRGs ממוקם בתוך כיסי העצם ליישר לצד עמוד השדרה. מאז הצבע של גוף החוליה הוא לבןגורים צעירים, קשה להבחין בין DRGs מן החוליה. במקרה זה, חשוב למקם את עמוד השדרה קרוב כתם האור. תחת האור, DRGs להפוך שקופה תוך העצם נשאר לבן ואטום. חשוב לשמור על חיץ לנתיחה על הקרח ב- pH הפיזיולוגי, מאז pH משפיע על יכולת הקיום של תאים עצביים. הרקמות הבודדות הן צמיגות מאוד ונוטות להיצמד קצה פיפטה בעת העברת צינור צנטריפוגות. לפיכך חיתוך קצה מאוד של פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר מקל על ההעברה.
בפרוטוקולים מסוימים, יש צעד צנטריפוגה אחת יותר נדרש עם הרקמות המבודדות לפני הוספת חיץ דיסוציאציה. במקום שלב זה, הפרוטוקול שלנו דורש רקמות להתיישב למאגר לנתיחה במשך כמה דקות, אשר מפחית את צעד צנטריפוגה נוסף שאחרת להשפיע על הכדאיות וצפיפות של התאים. צפיפות התאים תלוי גםעל מספר גורים הקריב, ובכך הוא חשוב לשמור על מספר עקבי של גורים בכל פעם. ישנם גם ותאי גלייה כי מבודד יחד עם נוירונים DRG, ובכך מעכב mitotic, FDU-U, מתווסף בינוני התרבות ב 1 DIV לדכא את הצמיחה של תאי גליה. זה משמש בדרך כלל כדי לעכב תאי גלייה בתקופת הצמיחה המוקדמת של נוירונים, למרות פרוטוקולים מסוימים מעדיפים שילוב של arabinofuranosylcytidine (AraC) ו FDU-U. הריכוז הטוחן של FDU-U הוסיף לתרבות משתנית הפרוטוקולים השונים, בהתאם לצפיפות של התאים הבודדים. מצאנו מעכב mitotic ניתן להוסיף מספר רב של פעמים (בריכוז שצוין בשלב 3.3), לפי הצורך (אם ותאי גלייה נוכחים), במהלך תרבות DRG כולו. הוא בדרך כלל לא מומלץ להוסיף כמות גדולה (מעל 15 μl) בכל זמן נתון מאז זה משפיע על עיקול נכסי נוירונים DRG.
טיפול פלזמה משפר surfachydrophilicity הדואר ואת ציפוי PLL מספק משטח מחויב עבור אקסונים ליזום מצורף. לדברי אזכור בספרות, את hydrophilicity המושרה טיפול פלזמה יהיה להחליש לאורך זמן, בתנאים יבשים 16-17. עם זאת PDMS יעבור תגובה איטית במים בתנאים נוזליים ישתנה בהדרגה מלהיות הידרופובי עד 18 הידרופילי. לכן למרות טיפול הפלזמה פוחת לאורך זמן, זה לא אמור להשפיע על התוצאות שלנו. לקבלת ציפוי PLL, בהתאם למידע המוצר מהספק, הוא יציב לאורך שנים אם להציב בתנאים נוחים. ברגע שהתאים לצרף על ציפוי PLL, הם בדרך כלל לא יהיה לנתק. בנוסף, הציפוי PLL עוזר בצירוף הראשוני, כמו התאים גדלים הם מפרישים תאי מטריקס (ECM) חלבונים אשר עוד לעזור להם להישאר מעוגן אל פני השטח 19. שיפורים בעיצוב העתיד יכול לכלול imbedding פפטידים לתוך PDרשת MS במהלך crosslinking, אשר היה מונע את הטיפול פלזמה צעדים ציפוי PLL.
פרוטוקול, במסמך זה, תיאר גישה הנדסית שנוצר אנאיזוטרופיה השטח כדי לגרום יישור האקסון בהצלחה, צמיחה myelination. הגישה ניתן להרחיב באופן ניסיוני בשתי דרכים. ראשית, פני שטח איזוטרופי יכולים להיות מיושם כדי ליצור רקמות עצבות בתרבות, ואת במבחנת שטח העצב אז יכול להיות מושתל in vivo. שנית, הרעיון של אנאיזוטרופיה משטח יכול להיות משולב לתוך העיצוב של פיגומים להשתלה שיכול לשמש in vivo כדי לשפר את היישור של אקסונים התחדשות מאתר הפגיעה myelination מן SCS המארח. בהשוואה לגישות אחרות הדורשות מספר מכשירים והמסובכים 20-22, כמו גם תוספת של גורמי גדילה, הפלטפורמה שלנו היא יחסית פשוטה וקלה ליישום, והוא מסתמך רק על-למתוח מראש כדי לשפר הן האקסון עלייgnment ואת מעטפת המיאלין ללא צורך בנוסף גורם הגדילה. יתר על כן בדקנו את המושג הזה של למתוח מראש במערך הניסוי משני MSCs ונוירונים DRG אשר יכול בקלות להיות מיושם על סוגי תאים אחרים. העיצוב הנוכחי שימש לחקור צמיחה האקסון על משטחים 2-ממדי, אולם בעתיד המכשיר ניתן לשדרג על מנת לאפשר בדיקה של תרביות תאים 3-dimenstional. יישומים עתידיים תיקון עצב והשתלות יכולים לשלב למתוח מראש לתוך הפיגומים להשתלה עשויים מחומרים טבעיים או סינטטיים מתכלים המכילים פפטידים crosslinked יחד עם תכונות תרופת שחרור מבוקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות אריק ואסקו עזרתו בהכנת מצעים PDMS, ד"ר Shiyong וואנג במעבדה של ד"ר מרינה מאטה באוניברסיטת מישיגן עבור הצעות מועילות והכשרה של בידוד DRG, וד"ר מארק Tuszynski וד"ר . וו מארי קמפנה באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו לקבלת הצעות פרוטוקול מועיל עבור בידוד SC. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0,941,055 ו CBET 1,510,895), המכון הלאומי לבריאות (R21CA176854, R01GM089866, ו R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
