Introduction
Dans les lésions nerveuses, les proximale et distale nerveuses souches sont souvent empêchés de réalignement direct des faisceaux nerveux en raison du site de la lésion 1-2. Normalement, les secteurs de l'axone sont composés de faisceaux hautement ordonnés et alignés d'axones qui forment des réseaux complexes de connectivité. Cependant, la régénération nerveuse est un processus chaotique due à l' alignement de l' axone mal organisé 3-4. Par conséquent, afin de générer un nombre suffisant de régénération d'axones qui relient le site de la lésion, il est nécessaire d'induire un alignement axonale bien organisé. En outre, la démyélinisation accompagne les lésions nerveuses dues à la mort des cellules myélinisantes au site de la lésion. Depuis démyélinisation affecte fortement la capacité conductrice des axones survivants, traitements ciblant la démyélinisation ou la promotion de la remyélinisation sont importantes pour la récupération fonctionnelle après lésion du nerf 5. Ainsi, l'objectif de ce protocole est d'illustrer une approche d'ingénierie qui répond à ces deux questionsde la régénération nerveuse.
Anisotropie de surface, qui est définie comme une différence, lorsqu'elle est mesurée le long d' axes différents, des propriétés physiques ou mécaniques d'un matériau, a été appliqué pour influencer l' alignement des cellules, la croissance et la migration 6-7. En plus de la topographie, il existe d'autres méthodes pour induire une anisotropie. Auparavant, nous avons étudié l'anisotropie de surface induite par mécanique pré-étirement statique de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) membrane. La théorie de la "petite super déformation imposée sur une grande" prédit que la rigidité effective des cellules détectent dans le sens étiré diffère de la direction perpendiculaire, et cette différence de rigidité effective est due à la surface anisotropie 8. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur une membrane PDMS pré-étiré sont capables de détecter l'anisotropie en tirant sur la surface active et en conséquence, d' aligner la direction pré-étiré 9. De même, une surface ar anisotropiqueising à partir d' une surface pré-étiré mécanique affecte l'alignement, ainsi que la croissance et la myélinisation du ganglion de la racine dorsale (DRG) axones 10. Ici , nous fournissons un protocole destiné à induire une anisotropie de surface sur un substrat pré-étiré statique PDMS pour améliorer la régénération axonale 10.
Pour obtenir l' alignement des axones, des caractéristiques topologiques avec des motifs souhaités, rapporté à fournir des conseils de contact à travers des fibres et des canaux 6,11-12 alignés, ont été démontrées pour faciliter l' alignement des axones 11,13. Cependant, les techniques permettant d'induire un alignement des axones par les caractéristiques topologiques, telles que des fibres, des canaux et des motifs rapportés, ont été incapables d'allonger et d'augmenter l'épaisseur des axones. En revanche, progressive étirage mécanique a conduit à l' alignement des axones dans la direction d'étirement avec axones longs et plus épais que l' augmentation de l'amplitude du tronçon 14. Cependant, incorporant un dispositif de moteur alimenté in vivo est pasfaisable. En revanche, statique anisotropie induite pré-étiré est moins compliqué et peut être plus facilement incorporé dans les futures conceptions d'échafaudage pour des applications in vivo.
Dans ce protocole, un système de culture de cellules pré-étiré statique est utilisé pour induire une anisotropie de surface sans caractéristiques topologiques. Le système de culture pré-étiré est constitué d'une membrane PDMS, un cadre extensible et un étage d'étirage, après quoi la membrane est fixée sur le châssis et un tronçon de grandeur prédéterminée est appliquée à l'étape d'étirage. neurones DRG fraîchement isolées en culture sur la surface pré-étiré jusqu'à 21 jours sont contrôlés pour l'alignement et de l'épaisseur axone. Par la suite, les cellules de Schwann (SC) co-cultivées avec les axones alignés sont surveillés pour la myélinisation. En incorporant de pré-étirement induite surface anisotropie , nous avons pu améliorer la cellule alignement différenciation et axone alignement de croissance des cellules souches mésenchymateuses et les neurones DRG 9-10, respectivement.
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Protocol
Toutes les procédures pour l'isolement des cellules ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à Michigan State University.
1. Préparation des pré-étiré Surface anisotrope
- Mélanger 10: 1 solution de base et l'agent de durcissement et de verser le mélange dans une boîte de culture tissulaire (12 cm de diamètre). Utilisez 4,900 mg de base et 490 mg d'agent de durcissement pour le mélange de réticulation totale.
- Maintenir le mélange de gel sous vide pendant 20 minutes pour éliminer les bulles d'air.
- Placer le mélange de gel dans le four pour un durcissement pendant une nuit à 60 ° C.
- Après les cures de membrane PDMS, traiter la surface avec un plasma d'oxygène à l' aide d' un système de nettoyage / de gravure par plasma pendant 3 min à 165 mTorr et 65 flux de sccm d'O 2.
- Coupez un morceau de membrane rectangulaire (5 x 3,5 cm) de l'antenne, tout en étant conscient de quel côté est l'oxygène traité, assurez-vous du côté de l'oxygène traité est orientée vers le haut et le fixer sur un cadre d'étirage. Placez le cadre sur un étirement scène et étirer uniformément en tournant le bouton sur la scène jusqu'à ce qu'il atteigne 10% d' allongement (ou d' un autre tronçon prédéterminé; l'allongement peut être lue directement à partir du stade d' étirage) dans l'axe plus 9. Fixer le tronçon en serrant les vis sur le cadre.
- Retirez le cadre de la scène. Vérifiez que la surface de la membrane est sèche et exempte de poussière, puis placer une chambre de silicone sur la membrane permettant le côté collant de la chambre d'attacher solidement à la membrane.
Remarque: La chambre de silicone fournit un puits pour retenir le milieu de cellules sur la membrane PDMS. La conception du dispositif est représenté sur la figure 1. - Stériliser la surface avec des UV pendant 10 min.
- Ajouter 1 ml de poly-L-lysine (PLL) (0,01% dans un tampon phosphate salin) à la surface du PDMS intérieur de la chambre, dans les 6 heures de traitement par plasma et laisser incuber pendant 2 heures à 37 ° C avant l'ensemencement des neurones DRG. Cela améliore la fixation des cellules.
- Préparer un milieu de croissance standard pour les neurones DRG.
- Préalablement à l'isolement, dans un autoclave de l'équipement et des réactifs d'isolement de filtre. Ajouter 5 ml de tampon d'isolement dans un puits d'une plaque à 6 puits, et placez la plaque sur la glace. Préparer 10 ml de milieu de dissociation en ajoutant 1 ml de collagénase A (500 U / ml) à 9 ml de 0,05% de trypsine-EDTA (1 mg / ml), on filtre la solution avec un filtre 0,22 pm et placer sur de la glace.
- Utiliser dix à douze 5-7 rats Sprague-Dawley "jours pour l'isolement. Vaporiser les chiots avec 75% d'isopropanol, et le sacrifice par décapitation.
- Coupez la peau recouvrant la moelle épinière de l'arrière et retirez tout excès de tissu autour de la colonne vertébrale. Sous une loupe chirurgicale avec les lumières de tache chirurgicales sur, faire la première incision du cou, puis une coupe le long de la colonne vertébrale sur les deux côtés avec des ciseaux. Détachez la colonne vertébrale du corps des chiots et enlever l'excès de muscles. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le long de la long axe de la colonne vertébrale et de l'utilisation des pinces pour ouvrir la colonne vertébrale complètement et extraire la moelle cord.Remove la pointe d'une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d'isolement dans un tube de 15 ml stérile.
- L'utilisation d'une belle paire de pinces à épiler, retirez le ganglion de la poche de l'os et de recueillir environ 10 - 16 DRG des deux côtés. Couper les racines nerveuses et transférer les noyaux dans le tampon d'isolement glacée.
- Retirer la pointe d'une pipette pour créer une plus grande ouverture pour transférer les DRG avec un tampon d'isolement dans un tube de 15 ml stérile. Après la dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min.
- Laissez les tissus se déposent au fond du tube et retirez délicatement le tampon d'isolement sur le dessus et ajouter 10 ml de milieu de dissociation dans le tube.
- Incuber les tissus disséqués dans le milieu de dissociation dans un bain d'eau à 37 ° pendant 1 heure en agitant le tube tous les 5 - 10 min.
- Aprèsla dissociation chimique, centrifuger les ganglions à 900 x g et 4 ° C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de médias de croissance standard et vortex.
- Centrifuger les cellules dissociées comme indiqué à la section 2.9 une fois de plus.
- Retirer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 12 ml de milieu de croissance standard et vortex.
3. Culture de DRG sur la surface pré-étiré
- Avant l'ensemencement des cellules, enlever les solutions PLL de la chambre et rincer la surface de PDMS avec de l'eau stérile et l'air sec.
- Après remise en suspension des cellules, laisser l'ensemble de la suspension pendant 1 - 2 min pour permettre aux débris de se déposer au fond du tube. Ajouter 1,5 ml de suspension cellulaire dans chaque chambre d'étirage et incuber à 37 ° C sous 5% de CO 2.
- Pour éliminer les cellules gliales, à 1 jour in vitro (DIV), ajouter 10 pi (ou 15 pi) mélange de fluoro-2 désoxy-uridine et uridine (FDU-U) Stock solutisur (Voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Après 7 heures, remplacer ce milieu avec un milieu de croissance standard frais et placer le dispositif de culture pré-étiré dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Au cours de la période de culture cellulaire (2 - 3 semaines), changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec du milieu frais. Nota: Après culture sur les surfaces tendus et détendus pendant 2 semaines, SCs purifiés sont ajoutés à la chambre et mises en culture pendant une semaine (étape 4.7).
4. Co-culture de cellules de Schwann (SC) avec DRG Neurones sur la surface pré-étiré
- Isoler SCs tel que décrit par le groupe du Dr Campana 15 auparavant.
- En bref, isoler le SCs d'un vieux chiot 1 jour. Recueillir et dissocier les nerfs sciatiques à la fois chimiquement (trypsine-EDTA et collagénase A) et mécaniquement (18 aiguille de calibre / 10 ml seringue) 15.
- Ensemencer les cellules dissociées en poly-D-lysine (PDL) coATED flacon T25 et à la culture à 37 ° C sous 5% de CO 2. Le jour 5, purifier les cellules grâce à la sélection d'anticorps en utilisant Anti-thy 1.1 anticorps et complément de lapin et de sous-culture les cellules purifiées au passage 2 - 4. moyen Utilisation de culture contenant du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 1% de pénicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 pg / ml Extrait pituitaire bovin (BPE) et 4 uM forskoline.
- Retirer le milieu de culture à partir de la CS et ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans le ballon. Incuber les cellules à 37 ° C sous 5% de CO2 pendant 2-3 min.
- Vérifiez les cellules au microscope optique en utilisant un objectif 10X pour voir si elles élèvent du flacon, puis ajouter 5 ml de milieu de culture et mélanger avec les cellules dans le flacon.
- Ajouter la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et on centrifuge à 200 x g et à 20 ° C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et resuspendre le culot dans 7 ml de med de croissance DRG normeia.
- Prendre 10 pl de suspension cellulaire dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation, mélanger avec 10 pi de bleu trypan, puis compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre en microscopie optique en utilisant un objectif 10X. Diluer la suspension cellulaire 5.000 cellules par ml par addition de milieu de croissance DRG.
- Retirer 0,5 ml de milieu de la culture DRG dans la chambre étirée et ajouter 0,5 ml de SC suspension à la culture de DRG.
- Culture des cellules pendant 1 semaine à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer les médias tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu usé avec un milieu de croissance standard frais pour DRG. Après 1 semaine de co-culture, processus , les cellules par immunohistochimie 10.
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Representative Results
Le système de culture de cellules pré-étiré promu l' alignement de l' axone 10 DRG. neurones DRG ont été cultivées sur des surfaces pré-étirées et non étirées pendant 12 jours. Les axones ont été colorées pour β-III-tubuline pour démontrer leur alignement. La figure 2 compare l' orientation des axones sur les PDMS pré-étirées et non étirées substrats après 12 jours de culture. Les axones DRG alignés parallèlement à la direction d'étirage, alors qu'ils présentaient un alignement aléatoire et forment un réseau interconnecté sur le substrat de PDMS non étiré.
En plus d'induire l'alignement de l'axone, anisotropie pré-étirement induit amélioré la fasciculation des axones. Les axones alignés sur les faisceaux axonales surface étirée formés, qui différaient du réseau axonal connecté observées sur la surface non étirée. Ces faisceaux fasciculaires sur la surface pré-étiré ressemblaient tr tissu nerveuxagit in vivo. La figure 3 montre axones des neurones DRG sur les surfaces pré-étirés et non étirés après 21 jours de culture. Comme la figure 3 illustre, les axones sur le substrat pré-étiré regroupées ensemble pour former des faisceaux, qui semblaient similaires à tracts fasciculaires. Ceci a suggéré la surface pré-étiré est capable de promouvoir une croissance extensive des axones dans la direction de pré-étirement, qui jouent un rôle important dans l'amélioration de la régénération du tissu nerveux.
Pour évaluer la myélinisation, SC ont été co-cultivées avec les axones alignés. Après la culture des neurones DRG sur les surfaces tendus et détendus pendant 2 semaines, on a ajouté SCs purifié dans la chambre et cultivées pendant encore une semaine. Sur la figure 4, les axones de la co-culture sont colorées avec β-III tubuline (vert), et la HFP sont colorées avec P0 (rouge). P0 est un marqueur de l'âge mûr et SCs est également un composant de la gaine de myéline,ainsi que considéré comme un indicateur de la myélinisation. Il y a une co-localisation significative du vert et du rouge sur la surface pré-étiré, suggérant SCs attachés aux axones sur la surface tendue, mais pas sur la surface non étiré, où les taches vertes et rouges sont répartis de façon aléatoire. Les surfaces pré-étiré amélioré l'alignement de l'axone, la formation des voies fascicular-like, et l'attachement de SCs aux axones régénérés, tous essentiels pour la myélinisation.
Figure 1:. Schéma de la procédure de pré-étirage (a) Un morceau de membrane PDMS est clipsé sur deux bandes de la trame qui peuvent coulisser. Le cadre du dispositif est d'environ 7 "x 5"; les accolades sont environ 5 "x 1; les pinces sur les accolades sont environ 3" x .25 ", et la coupe est d'environ 1,5" de diamètre large ouverture, 1 "fond ouvert, et environ 0,25 & #34; grand. (B) Placez le cadre sur le stade d' étirage, tournez le rouleau pour appliquer 10% d' allongement, puis fixer les positions des bandes en serrant les vis. (C) Retirez le cadre de l'étape d' étirement, et joindre une chambre de silicium sur la membrane. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Axon Alignement sur les pré-tendus et détendus Surface images fluorescentes de neurones DRG ensemencées sur le (a) la surface pré-étiré statique pendant 12 jours, par rapport à des cellules de DRG ensemencées sur la (b) surface non étirée pendant 12 jours.. Axones alignées dans la direction d'avancement pré-étiré, tandis que les axones alignés de manière aléatoire sur la surface de contrôle non étiré. Axons ont été colorées avec l' anticorps primaire tubuline anti-souris β-III, et imagés avec microscope confocal en utilisant un objectif 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Axon Epaisseur croissance sur Allongé vs non étiré PDMS Substrat images de contraste de phase d'axones DRG sur (a) étiré et (b) les surfaces non étirées après 21 jours.. Axones sur la surface étirée formé des faisceaux plus épais, tandis que sur la surface non étiré les axones formés réseau interconnecté axonale. Les images ont été prises avec un microscope à contraste de phase inversée en utilisant un objectif 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir alVersion Arger de ce chiffre.
Figure 4:. SCs avec Alignés DRG axones co-cultivées sur Étendu vs. non étiré PDMS Substrats Après culture sur les surfaces tendus et détendus pendant 2 semaines, SCs purifiés ont été ajoutés à la chambre et cultivées pendant une autre semaine. (A) β-III-tubuline (vert) pour la coloration des axones sur la surface étirée; (B) superposition de β-III tubuline (vert), P0 (rouge) , la coloration de la surface étirée; (C) β-III-tubuline (vert) pour la coloration des axones sur la surface non étiré; (D) la superposition de la β-tubuline III (vert), P0 (rouge) , la coloration de la surface non étiré. Sur la surface pré-étiré, les taches rouges et verts colocalisent, suggérant les SCs sont attachés à et probablement myélinisation des axones. Sur la non étiréesurface, les taches rouges et verts sont distribués au hasard, ce qui suggère les SCs ne sont pas attachés aux axones. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour induire l'alignement axone sur la surface pré-étiré, il y a deux étapes essentielles: 1) la membrane PDMS doit être plat et d'épaisseur homogène; et 2) les cellules gliales doivent être retirés de la DRG. Après le mélange des PDMS et réticulant et le durcissement dans un four, le gel de PDMS réticulé doit être conservé sur un dessus de banc plat et manipulé avec précaution pour éviter tout basculement. Le traitement par plasma d'oxygène de la membrane PDMS doit être suivie dans les 6 h par revêtement PLL, étant donné que l'hydrophilie de la surface (nécessaire pour la fixation des cellules) après traitement par plasma atténue au fil du temps. Étant donné que le traitement au plasma est appliqué sur un côté de la membrane, il faut prendre soin après épluchage PDMS de la cuvette pour assurer le bon côté est placé sur le châssis, qui est, la surface traitée au plasma devrait être dirigée vers le haut pour que les cellules attacher à.
Les DRG sont situés à l'intérieur des poches d'os qui alignent le long de la colonne vertébrale. Etant donné que la couleur de la vertèbre est blanchejeunes chiots, il est difficile de distinguer les DRG de la vertèbre. Dans ce cas, il est important de placer la colonne vertébrale à proximité du spot de lumière. Sous la lumière, les DRG tour transparent tandis que l'os reste blanc et opaque. Il est important de garder la mémoire tampon de dissection sur de la glace et à un pH physiologique, étant donné que le pH influe sur la viabilité des cellules neurales. Les tissus isolés sont très visqueux et ont tendance à coller à la pointe de la pipette lors du transfert vers un tube de centrifugeuse. Ainsi coupe la pointe de la pipette pour générer une plus grande ouverture facilite le transfert.
Dans certains protocoles, il y a encore une étape de centrifugation nécessaire avec les tissus isolés avant d'ajouter le tampon de dissociation. Au lieu de cette étape, notre protocole exige que les tissus à régler dans la mémoire tampon de dissection pour un couple de minutes, ce qui réduit l'étape de centrifugation supplémentaire qui serait par ailleurs un impact sur la viabilité et la densité des cellules. La densité cellulaire est également dépendantesur le nombre de petits sacrifiés, et est donc important de maintenir un nombre constant de chiots à chaque fois. Il existe également des cellules gliales qui sont isolées avec les neurones DRG, donc un inhibiteur mitotique, FDU-U, est ajouté au milieu de culture à 1 DIV pour inhiber la croissance des cellules gliales. Ceci est communément utilisé pour inhiber les cellules gliales au cours de la période de croissance rapide des neurones, bien que certains protocoles préfèrent une combinaison de arabinofuranosylcytidine (AraC) et FDU-U. La concentration molaire de l'UPF-U ajouté à la culture varie dans les différents protocoles, en fonction de la densité des cellules isolées. Nous avons trouvé que l'inhibiteur mitotique peut être ajouté à plusieurs reprises (à la concentration spécifiée à l'étape 3.3), le cas échéant (si les cellules gliales sont présents), au cours de la culture entière DRG. Il est généralement recommandé de ne pas ajouter une grande quantité (plus de 15 pi) à un moment donné car elle influe sur la fixation des neurones DRG.
Le traitement au plasma améliore surface hydrophilie et le revêtement PLL fournit une surface chargée pour axones d'initier la fixation. Selon les références de la littérature, le traitement au plasma induit par le caractère hydrophile atténue au fil du temps, dans des conditions sèches 16-17. Cependant PDMS fera l' objet d' une réaction lente avec de l' eau dans des conditions liquides et va progressivement changer d'être hydrophobe à hydrophile 18. Par conséquent, même si le traitement par plasma atténue au fil du temps, il ne devrait pas avoir une incidence sur nos résultats. Pour le revêtement PLL, selon les informations de produit du fournisseur, il est stable au fil des ans si elles sont placées dans des conditions favorables. Une fois que les cellules se fixent sur le revêtement PLL, ils ne seront généralement pas détacher. En outre, le revêtement PLL aide à la fixation initiale, et que les cellules se développent , elles sécrètent la matrice extracellulaire (ECM) des protéines qui les aident en outre à rester ancré à la surface 19. des améliorations de conception futures pourraient inclure plongement peptides dans le PDMS réseau lors de la réticulation, ce qui éliminerait le traitement au plasma et les étapes de revêtement PLL.
Le protocole, ici, décrit une approche d'ingénierie qui a généré anisotropie de surface avec succès pour induire l'alignement de l'axone, la croissance et la myélinisation. L'approche peut être expérimentalement élargie de deux façons. Tout d' abord, la surface anisotrope pourrait être appliquée pour créer des tissus nerveux en culture et in vitro voies nerveuses peut alors être transplantées in vivo. Deuxièmement, le concept d'anisotropie de surface pourrait être incorporé dans la conception des échafauds transplantables qui pourrait être utilisé in vivo pour améliorer l'alignement des axones du site de la lésion et la myélinisation des Centres d'accueil. Par rapport à d' autres approches qui nécessitent de multiples et complexes dispositifs 20-22, ainsi que l'ajout de facteurs de croissance, notre plate - forme est relativement simple et facile à appliquer, et repose uniquement sur pré-étirement pour améliorer à la fois axone alignment myélinisation et sans la nécessité d'une addition de facteurs de croissance. En outre, nous avons testé ce concept de pré-étirement dans la conception expérimentale sur les deux MSCs et les neurones DRG qui pourraient facilement être appliquées à d'autres types de cellules. La conception actuelle a été utilisée pour étudier la croissance des axones sur les surfaces 2 dimensions, mais dans l'avenir, le dispositif pourrait être mis à jour pour permettre l'essai de cultures cellulaires 3-dimenstional. Les applications futures de réparation du nerf et de la transplantation pourraient incorporer pré-étirement dans les échafauds transplantables fabriqués à partir de matériaux naturels ou synthétiques biodégradables contenant des peptides réticulés ainsi que des propriétés des médicaments à libération contrôlée.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Eric Vasco pour son aide dans la préparation des substrats PDMS, le Dr Shiyong Wang dans le laboratoire du Dr Marina Mata à l'Université du Michigan pour des suggestions et de la formation de l'isolement de DRG utiles, et le Dr Mark Tuszynski et le Dr . W. Marie Campana à l'UC San Diego pour des suggestions utiles et le protocole pour l'isolement de SC. Cette étude a été financée en partie par la National Science Foundation (CBET 0.941.055 et 1.510.895 CBET), l'Institut national de la santé (R21CA176854, R01GM089866 et R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
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