Introduction
In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle 1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung 3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzungen durch Tod der myelinisierende Zellen an der Verletzungsstelle. Da Demyelinisierung stark beeinträchtigt die leitende Kapazität Axone zu überleben, Behandlungen Targeting Demyelinisierung oder Remyelinisierung fördern sind bedeutsam für die funktionelle Erholung nach einer Nervenverletzung 5. So ist das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Engineering-Ansatz zu verdeutlichen, die diese beiden Fragen behandeltder Nervenregeneration.
Oberflächenanisotropie, die als Differenz definiert, wenn sie entlang verschiedenen Achsen gemessen, in einem Material der physikalischen oder mechanischen Eigenschaften, wurde angewendet Zellausrichtung zu beeinflussen, das Wachstum und die Migration 6-7. Neben Topographie, gibt es andere Methoden Anisotropie zu induzieren. Bisher untersuchten wir Oberflächenanisotropie durch mechanische statische Vorstreckung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Membran induziert. Die Theorie der "kleinen super Verformung auf großen auferlegt" vorausgesagt , daß die effektive Steifigkeit der Zellen in der gedehnten Richtung erfassen von der senkrechten Richtung abweicht, und diese Differenz der effektiven Steifigkeit aufgrund Anisotropie 8 an die Oberfläche. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) , kultiviert auf einem vorgedehnten PDMS - Membran können die Anisotropie zu erfassen , indem aktiv die Oberfläche gezogen und als Ergebnis, richten in der vorgedehnten Richtung 9. In ähnlicher Weise eine anisotrope Oberflächen arising von einer mechanischen Oberflächenvorgedehnten wirkt sich auf die Ausrichtung, 10 Axone sowie das Wachstum und die Myelinisierung von dorsal root ganglion (DRG). Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion Oberflächenanisotropie auf einer statischen vorgedehnten PDMS Substrat 10 Axonregeneration zu verbessern.
Zu axon Ausrichtung, topologische Merkmale mit gewünschten Mustern hervorzurufen, berichtet Kontaktführung durch die ausgerichteten Fasern zu schaffen und Kanäle 6,11-12 wurden nachgewiesen axon Ausrichtung 11,13 erleichtern. Jedoch zum Induzieren axon Ausrichtung durch topologische Merkmale Techniken berichtet, wie Fasern, Kanäle und Strukturieren, waren nicht imstande, zu verlängern und um die Dicke der Axone erhöhen. Im Gegensatz dazu Reckung mechanischen graduellen zu axon Ausrichtung in Dehnungsrichtung geführt mit längeren und dickeren Axone , die mit der Größe der Dehnung 14 erhöht. Jedoch ist eine angetriebene Motor Vorrichtung in vivo nicht enthältmöglich. Im Gegensatz dazu ist statisch vorgedehnten induzierte Anisotropie weniger kompliziert und leichter in Zukunft Gerüst Entwürfe für in vivo - Anwendungen integriert werden können.
In diesem Protokoll wird eine statische vorgedehnten Zellkultursystem wird verwendet Oberflächenanisotropie ohne topologische Eigenschaften zu induzieren. Die vorgedehnten Kultursystem besteht aus einem PDMS-Membran zusammengesetzt ist, einem dehnbaren Rahmen und einer Streckstufe, wobei die Membran an dem Rahmen befestigt ist und eine vorbestimmte Strecke Größe auf der Streckstufe zugeführt wird. Frisch isolierte DRG auf der vorgedehnten Oberfläche kultivierten Neuronen für bis zu 21 Tage für axon Ausrichtung und Dicke überwacht. Anschließend Schwann-Zellen (SCs) co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone werden Myelinisierung überwacht. Vorstreckung induzierte Oberflächenanisotropie Durch die Integration konnten wir Ausrichtung der Zellen-Differenzierung und Axon Ausrichtung Wachstum von MSCs und DRG - Neuronen 9-10 bzw. zu verbessern.
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Protocol
Alle Verfahren zur Isolierung der Zellen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Michigan State University genehmigt.
1. Herstellung von vorgespannter anisotroper Oberfläche
- Mischen Sie eine 10: 1-Lösung von Base und Härter und gießen Sie die Mischung in eine Gewebekulturschale (12 cm Durchmesser). Verwenden Sie 4.900 mg Base und 490 mg Mittel für die gesamte Vernetzungs Mischung härtet.
- Halten Sie die Gelmischung unter Vakuum für 20 min Luftblasen zu entfernen.
- Legen Sie das Gel-Gemisch in dem Ofen über Nacht Aushärtung bei 60 ° C.
- Nachdem die Membran aushärtet PDMS, Behandlung der Oberfläche mit Sauerstoffplasma eine Plasmareinigung / Ätzsystem für 3 min bei 165 mTorr und 65 sccm Fluss von O 2 verwendet wird .
- Schneiden Sie ein Stück von rechteckigen Membran (5 × 3,5 cm) von der Schale, während bewusst zu sein, welche Seite mit Sauerstoff behandelt wird, stellen Sie sicher, dass der Sauerstoff behandelte Seite nach oben zeigt und fixieren auf einem Spannrahmen. Platzieren Sie den Rahmen auf ein durch Drehen des Knopfes auf der Bühne Streckstufe und gleichmäßig dehnen , bis sie 10% Dehnung erreicht (oder eine andere vorgegebene Strecke, kann die Dehnung direkt von der Streckstufe gelesen werden) in der längeren Achse 9. Befestigen Sie die Strecke durch die Schrauben am Rahmen befestigen.
- Entfernen Sie den Rahmen von der Bühne. Sicherstellen, dass die Membran-Oberfläche ist trocken und frei von Staub, legen Sie dann eine Silikonkammer auf die Membran der klebrigen Seite der Kammer können an die Membran zu befestigen fest.
Hinweis: Die Silikon-Kammer bietet eine gut zum Halten des Zellmedium auf der PDMS-Membran. Die Vorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt. - Sterilisieren der Oberfläche mit UV für 10 min.
- 1 ml Poly-L-lysin (PLL) (0,01% in phosphatgepufferter Salzlösung) mit der PDMS-Oberfläche innerhalb der Kammer, innerhalb von 6 Stunden der Plasmabehandlung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, bevor die DRG Neurone Animpfen. Dies fördert die Zellhaftung.
- Bereiten Sie Standard-Wachstumsmedium für die DRG-Neuronen.
- Vor der Isolierung, autoklaviert die Isolations Ausrüstung und Filter Reagenzien. 5 ml Isolationspuffer in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, und legen Sie die Platte auf Eis. Herstellung von 10 ml der Dissoziation Medium durch 1 ml Kollagenase A Zugabe (500 U / ml) zu 9 ml von 0,05% Trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtriert die Lösung mit einem 0,22 um-Filter und auf Eis.
- Verwenden Sie zehn bis zwölf fähig 5 - 7 Tage alten Sprague-Dawley Ratten für die Isolierung. Sprühen Sie die Welpen mit 75% Isopropanol und opfern durch Enthauptung.
- Schneiden Sie die Haut über dem Rückenmark von hinten weg und entfernen Sie das überschüssige Gewebe rund um die Wirbelsäule. Unter einem chirurgischen Lupe mit den chirurgischen Scheinwerfer auf, machen den ersten Schnitt aus dem Hals und dann ein Schnitt entlang der Wirbelsäule auf beiden Seiten mit einer Schere. Nehmen Sie die Wirbelsäule aus dem Körper der Welpen und die überschüssigen Muskeln zu entfernen. Dann mit einer Schere entlang der lon zu schneideng Achse der Wirbelsäule und mit Hilfe einer Pinzette die Wirbelsäule vollständig zu öffnen und das Rücken cord.Remove die Spitze aus einer Pipette extrahieren, um eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube.
- Mit einem feinen Pinzette, entfernen Sie das Ganglion aus dem Knochentasche und sammeln etwa 10-16 DRG von beiden Seiten. Schneiden Sie die Nervenwurzeln und übertragen die Ganglien auf dem eiskalten Isolationspuffer.
- Die Spitze aus einer Pipette eine größere Öffnung für die Übertragung der DRGs mit Isolationspuffer in ein steriles 15 ml Tube. Nach der chemischen Dissoziation Zentrifuge die ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min.
- Lassen Sie das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen und sanft den Isolationspuffer oben entfernen und 10 ml Dissoziation Medium in das Röhrchen hinzufügen.
- Inkubieren Sie die sezierten Gewebe im Dissoziation Medium in einem Wasserbad 37 ° C 1 Stunde für während der Schlauch alle 5 Schütteln - mindestens 10.
- Nachdie chemische Dissoziation, zentrifugieren Sie das ganglia bei 900 xg und 4 ° C für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel.
- Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen, wie in Abschnitt 2.9 noch einmal angezeigt.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml Standardwachstumsmedien und Wirbel.
3. Kultur der DRG auf vorgespannter Fläche
- Vor der Zellen Aussaat, die PLL-Lösungen aus der Kammer zu entfernen und die PDMS-Oberfläche mit sterilem Wasser und der Luft trocknen zu spülen.
- Nachdem die Zellen wieder suspendiert, lassen Sie die Suspension Set mit 1 - 2 Minuten die Trümmer zu ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. 1,5 ml der Zellsuspension in jede Streckkammer und Inkubieren bei 37 ° C bei 5% CO 2.
- Gliazellen, die am 1. Tag in vitro (DIV), mit 10 & mgr; l (oder 15 & mgr; l) Mischung aus Fluor-2-deoxy Uridin und Uridin (FDU-U) Lager soluti Zur Beseitigungauf (siehe Tabelle der Materialien) zu gut jeder. Nach 7 Stunden, ersetzen Sie dieses Medium mit frischem Standardwachstumsmedium und legen Sie die vorgestreckten Kulturvorrichtung in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2.
- Während der Zellkulturperiode (2 - 3 Wochen), ändern Sie die Medien alle zwei Tage um die Hälfte des verbrauchten Medium durch frisches Medium ersetzt. Anmerkung: Nach Kultivierung auf den gedehnten und ungedehnten Flächen für 2 Wochen, gereinigt SCs werden zu der Kammer und eine weitere Woche kultiviert (Schritt 4.7).
4. Co-Kultur von Schwann-Zellen (SC) mit DRG Neurone auf vorgespannter Fläche
- Isolieren SCs wie von Dr. Campana Gruppe zuvor 15 beschrieben.
- Kurz gesagt, die SCs aus einem 1 Tage alten Welpen zu isolieren. Sammeln und die Ischiasnerven distanzieren sowohl chemisch (Trypsin-EDTA und Kollagenase A) und mechanisch (18 - Gauge - Nadel / 10 - ml - Spritze) 15.
- Seed die dissoziierten Zellen in Poly-D-Lysin (PDL) coated T25 - Kolben und die Kultur bei 37 ° C bei 5% CO 2. Am 5. Tag reinigen die Zellen durch Antikörper Auswahl Anti-thy 1,1 Antikörper und Kaninchen-Complement verwenden und die gereinigten Zellen Passage 2 Subkultur - 4. Verwenden Kulturmedium, das Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 1% Penicillin / Streptomycin (Penn / Strep), 21 & mgr; g / ml Rinderhypophysenextrakt (BPE) und 4 & mgr; M Forskolin.
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus der SCs und 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in den Kolben. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C bei 5% CO 2 für 2 - 3 min.
- Überprüfen Zellen unter dem Lichtmikroskop ein 10X-Objektiv verwendet, um zu sehen, ob sie aus dem Kolben heben, fügen Sie dann 5 ml Kulturmedium und mischen sich mit den Zellen in den Kolben.
- Fügen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 200 xg und 20 ° C für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 7 ml Standard-DRG Wachstum media.
- Nehmen Sie sich 10 ul Zellsuspension in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau und dann auf die Zellzahl bestimmen eine Hämozytometer unter der optischen Mikroskopie unter Verwendung eines 10X-Objektiv verwendet wird. Verdünne die Zellsuspension zu 5000 Zellen pro ml durch DRG Wachstumsmedium hinzugefügt wird.
- Entfernen Sie 0,5 ml Medium aus der DRG-Kultur in der gestreckten Kammer und mit 0,5 ml SC Suspension auf die DRG-Kultur.
- Kultur die Zellen für 1 Woche bei 37 ° C und 5% CO 2. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage nach der DRG die Hälfte des verbrauchten Mediums mit frischem Standardwachstumsmedium ersetzt. Nach 1 Woche Co-Kultur, verarbeiten die Zellen durch Immunhistochemie 10.
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Representative Results
Die vorgedehnten Zellkultursystem DRG axon Ausrichtung gefördert 10. DRG-Neuronen wurden auf vorgestreckten und ungereckten Oberflächen für 12 Tage. Die Axone wurden für β-III-Tubulin gefärbt ihre Ausrichtung zu zeigen. 2 vergleicht axon Ausrichtung auf den vorgestreckten und ungestreckte PDMS Substrate nach 12 Tagen Kultur. Die DRG Axone parallel zur Streckrichtung ausgerichtet sind, während sie zufällige Ausrichtung zeigte und bildeten ein miteinander verbundenes Netzwerk auf dem ungereckten PDMS Substrat.
Zusätzlich zu Axon Ausrichtung zu induzieren, Vorstreckung induzierte Anisotropie verbessert die fasciculation von Axonen. Die ausgerichteten Axonen auf den gestreckten Fläche gebildet axonalen Bündeln, die von dem angeschlossenen Netzwerk axonalen unterschied beobachtet auf der ungereckten Oberfläche. Diese faszikulären Bündel auf der vorgestreckten Oberfläche ähnelte Nervengewebe trwirkt in vivo. 3 zeigt Axone der DRG - Neuronen auf vorgestreckten und ungestreckte Oberflächen nach 21 Tagen Kultur. Wie in Abbildung 3 veranschaulicht, aggregiert die Axone auf dem vorgedehnten Substrat zusammen Bündel zu bilden, die zu faszikuläre Bahnen ähnlich erschien. Dies legte nahe, die vorgedehnten Oberfläche der Lage war, in der Richtung der Vorstreckung umfangreiche axon Wachstum zu fördern, die bei der Verbesserung der Regeneration von Nervengewebe wichtig sind.
Zur Beurteilung der Myelinisierung, SCs wurden co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone. Nach dem Kultivieren der DRG Neuronen auf der verstreckten und unverstreckten Flächen für 2 Wochen, wurden gereinigt SCs zu der Kammer hinzugefügt und kultiviert für eine weitere Woche. In 4 sind die Axone der Co-Kultur mit β-III-Tubulin (grün) gefärbt, und die SCs sind gefärbt mit P0 (rot). P0 ein Marker für reife SCs ist und ist auch ein Bestandteil der Myelinscheide,sowie ein Indikator für die Myelinisierung betrachtet. Es ist von Bedeutung Kolokalisation von Grün und Rot auf dem vorgedehnten Oberfläche, andeutend SCs zu den Axonen auf der gedehnten Oberfläche anbringen, aber nicht auf der ungereckten Oberfläche, wo die grünen und roten Flecken zufällig verteilt sind. Die vorgestreckten Oberflächen Axon Ausrichtung verbessert, faszikulären artigen Trakt Bildung und Anbringung von SCs zu den regenerierten Axone, die alle von entscheidender Bedeutung für die Myelinisierung.
Abb . 1: Schematische für die Pre-Stretch - Verfahren (a) Ein Stück PDMS - Membran wird auf zwei Streifen des Rahmens befestigt , die verschiebbar sind. Der Rahmen der Vorrichtung beträgt ca. 7 "x 5"; Die Streben sind etwa 5 "x 1; die Klammern an den Klammern sind etwa 3" x 0,25 "und die Tasse ist etwa 1,5" Durchmesser breit oben offen, 1 "offenen Boden und etwa 0,25 & #34; hoch. (B) Platzieren Sie den Rahmen auf die Streckstufe, drehen Sie die Walze 10% Dehnung anwenden, und fixieren Sie dann die Positionen der Streifen durch Anziehen der Schrauben. (C) Entfernen Sie den Rahmen aus der Streckstufe und befestigen Sie eine Siliziumkammer auf die Membran. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Alignment Axon auf vorgestreckt und Unstretched Oberflächenfluoreszenzbilder von DRG Neuronen ausgesät auf dem (a) statische vorgedehnten Oberfläche für 12 Tage, verglichen mit DRG - Zellen ausgesät auf dem (b) ungestreckten Fläche für 12 Tage.. Axone im vorgedehnten Richtung ausgerichtet sind, während Axone zufällig auf der ungereckten Steuerfläche ausgerichtet ist. Axons wurden mit anti-Maus - β-III - Tubulin primären Antikörper und mit konfokalen Mikroskop abgebildet , um eine 10X - Objektiv verwendet wird . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Axon Dickenwachstum auf Stretched vs. Unstretched PDMS Substrat Phasenkontrastbilder von DRG Axone auf (a) gestreckt und (b) ungereckten Oberflächen nach 21 Tagen.. Axone auf der gestreckten Fläche gebildet dickeres Bündel, während auf der Oberfläche ungestreckten die Axone miteinander verbunden axonalen Netzwerk gebildet. Die Bilder wurden mit inverser Phasenkontrastmikroskop mit einem 10X - Objektiv genommen. Bitte klicken Sie hier al anzuzeigenarger Version dieser Figur.
Abb . 4: cokultiviert SCs mit Aligned DRG Axone auf Stretched vs. Unstretched PDMS Substrate Nach Kultivierung auf den gedehnten und ungedehnten Flächen für 2 Wochen, wurden gereinigt SCs zu der Kammer hinzugefügt und kultiviert für eine weitere Woche. (A) β-III-Tubulin (grün) Färbung für Axone auf der Oberfläche gestreckt; (B) Überlagerung von β-III-Tubulin (grün), P0 (rot) -Färbung auf der gedehnten Oberfläche; (C) β-III-Tubulin (grün) Färbung für Axone auf der ungereckten Oberfläche; (D) Überlagerung von β-III-Tubulin (grün), P0 (rot) -Färbung auf der ungereckten Oberfläche. Auf der vorgestreckten Oberfläche, die roten und grünen Flecken colokalisieren, was darauf hindeutet, die SCs sind an und die Axone wahrscheinlich myelinisierenden. Auf der ungerecktenOberfläche, die roten und grünen Flecken sind zufällig verteilt, die SCs was darauf hindeutet, sind die Axone nicht angebracht. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die Hydrophilie der Oberfläche (erforderlich für die Zellanheftung) nach der Plasmabehandlung mit der Zeit abschwächt. Da die Plasmabehandlung auf eine Seite der Membran aufgebracht wird, muss darauf geachtet werden, nachdem die PDMS Abschälen der Schale gemacht werden, um die richtige Seite zu gewährleisten, auf dem Rahmen angeordnet ist, ist, dass die Plasma-behandelte Oberfläche für die Zellen nach oben zeigen sollte Anhängen an.
Die DRGs sind innerhalb der Knochentaschen befinden, die neben der Wirbelsäule auszurichten. Da die Farbe des Wirbels ist weiß injunge Welpen, ist es schwierig, die DRGs vom Wirbel zu unterscheiden. In diesem Fall ist es wichtig, die Wirbelsäule nahe dem Punktlicht zu setzen. Unter dem Licht, drehen sich die DRGs transparent, während die Knochen weiß und undurchsichtig bleibt. Es ist wichtig, die Dissektion Puffer auf Eis und bei einem physiologischen pH-Wert zu halten, da der pH-Wert der Lebensfähigkeit der neuralen Zellen beeinflusst. Die isolierten Geweben sind sehr viskos und neigen dazu, die Pipettenspitze zu haften, wenn in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. So schneiden Sie die Spitze der Pipette eine größere Öffnung erleichtert die Übertragung zu erzeugen.
In einigen Protokollen gibt es einen weiteren Zentrifugationsschritt mit den isolierten Gewebe erforderlich, bevor die Dissoziationspuffers Zugabe. Anstelle dieser Schritt erfordert unser Protokoll das Gewebe in der Dissektion Puffer für ein paar Minuten absetzen, die den zusätzlichen Zentrifugationsschritt reduziert, die sonst würde die Lebensfähigkeit und die Dichte der Zellen beeinflussen. Die Zelldichte ist auch abhängigvon der Anzahl der Welpen geopfert, und damit ist wichtig, eine gleichbleibende Anzahl von Welpen jedes Mal zu halten. Es gibt auch Gliazellen, die zusammen mit den DRG-Neuronen isoliert sind, wodurch ein Mitoseinhibitor, FDU-U, wird zu dem Kulturmedium bei 1 DIV das Wachstum der Gliazellen zu unterdrücken. Dies wird häufig verwendet, um Gliazellen während der frühen Wachstumsphase der Neuronen hemmen, obwohl einige Protokolle eine Kombination aus arabinofuranosylcytidine (AraC) und FDU-U bevorzugen. Die molare Konzentration von FDU-U hinzugefügt, um die Kultur in den verschiedenen Protokollen variiert, abhängig von der Dichte der isolierten Zellen. Wir fanden die mitotischen Inhibitor mehrfach hinzugefügt werden können (bei der Konzentration der in Schritt 3.3) je nach Bedarf (wenn Gliazellen vorhanden sind), während der gesamten DRG Kultur. Es ist im allgemeinen nicht eine große Menge (mehr als 15 & mgr; l) zu einem bestimmten Zeitpunkt, da es beeinflusst die Befestigung der DRG-Neuronen hinzuzufügen empfohlen.
Die Plasmabehandlung verbessert surface Hydrophilie und die PLL-Beschichtung bietet eine geladene Oberfläche für Axone Befestigung einzuleiten. Gemäß Referenzen in der Literatur wird die Plasmabehandlung induzierte Hydrophilie im Laufe der Zeit zu dämpfen, unter trockenen Bedingungen 16-17. PDMS wird jedoch eine langsame Reaktion mit Wasser unter flüssigem Bedingungen unterzogen und von hydrophob zu hydrophilen 18 allmählich ändern. Daher, auch wenn die Plasmabehandlung mit der Zeit abschwächt, sollte es nicht unsere Ergebnisse auswirken. Für die PLL-Beschichtung entsprechend der Produktinformationen des Lieferanten ist es über Jahre stabil unter günstigen Bedingungen, wenn gesetzt. Sobald die Zellen auf die PLL-Beschichtung befestigen, werden sie in der Regel nicht lösen. Zusätzlich hilft die PLL - Beschichtung mit der anfänglichen Befestigung und als die Zellen wachsen sie extrazelluläre Matrix (ECM) Proteine sezernieren , die sie auf die 19 Oberfläche verankert helfen zu bleiben. Zukünftige Designverbesserungen könnten Peptide in die PD imbeddingMS-Netzwerk während der Vernetzung, die die Plasmabehandlung und PLL-Beschichtungsschritte eliminieren würde.
Das Protokoll, hier beschrieben, ein Engineering-Ansatz, der Oberflächenanisotropie erzeugt, um erfolgreich Axon Ausrichtung, das Wachstum und die Myelinisierung induzieren. Der Ansatz kann experimentell auf zwei Arten erweitert werden. Erstens könnte die anisotrope Oberflächennervengewebe in Kultur zu schaffen , angewendet werden, und die in - vitro - Nervenbahnen dann in vivo transplantiert werden konnte. Zweitens könnte das Konzept der Oberfläche Anisotropie in die Gestaltung von transplantierbaren Gerüste eingebracht werden , die in vivo verwendet werden könnte , um die Ausrichtung der regenerierenden Axone von der Verletzungsstelle und die Myelinisierung von den Wirts SCs zu verbessern. Im Vergleich zu anderen Ansätzen , die 20-22 multiple und komplizierte Vorrichtungen erfordern, sowie die Zugabe von Wachstumsfaktoren, ist unsere Plattform relativ einfach und leicht anzuwenden und stützt sich nur auf Vorstreckung sowohl Axon zu verbessern alignment und Myelinisierung ohne dass Wachstumsfaktor hinaus. Darüber hinaus haben wir dieses Konzept der Vordehnung im experimentellen Design auf beiden MSCs und DRG Neurone getestet, die leicht auf andere Zelltypen angewendet werden könnte. Das aktuelle Design wurde verwendet, um Axon Wachstum auf 2-dimensionalen Oberflächen zu untersuchen, aber in Zukunft könnte das Gerät die Prüfung von 3-dimenstional Zellkulturen zu ermöglichen, aufgerüstet werden. Zukünftige Anwendungen in Nervenreparatur und Transplantation könnte integrieren Vorstreckung in die transplantierbaren Gerüste aus biologisch abbaubaren natürlichen oder synthetischen Materialien vernetzten Peptide zusammen mit kontrollierter Freisetzung Droge Eigenschaften.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Eric Vasco für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der PDMS-Substrate, Dr. Shiyong Wang in Dr. Marina Mata Labor an der University of Michigan für hilfreiche Anregungen und Ausbildung des DRG-Isolation und Dr. Mark Tuszynski und Dr. danken W. Marie Campana an der UC San Diego. für hilfreiche Anregungen und das Protokoll für die SC-Isolation. Diese Studie wurde teilweise von der National Science Foundation (CBET 0.941.055 und CBET 1.510.895), das National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 und R01EB014986) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
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