Introduction
Em lesões nervosas, os cotos proximal e distal do nervo são muitas vezes impedidos de realinhamento direta dos fascículos nervosos devido ao local da lesão 1-2. Normalmente, intervalos de axônios são compostos por feixes altamente ordenadas e alinhadas de axônios, que formam complexas redes de conectividade. No entanto, a regeneração do nervo é um processo caótico devido ao alinhamento axônio mal organizado 3-4. Por isso, para gerar um número suficiente de regeneração de axónios que preenchem o local da lesão, é necessário para induzir o alinhamento axonal bem organizada. Além disso, a desmielinização acompanha lesões nervosas devido à morte das células mielinizantes no local da lesão. Desde desmielinização prejudica fortemente a capacidade condutora de sobreviver axônios, os tratamentos visam desmielinização ou promover remielinização são significativos para a recuperação funcional após a lesão do nervo 5. Assim, o objetivo deste protocolo é para ilustrar uma abordagem de engenharia que aborda estas duas questõesda regeneração do nervo.
Anisotropia de superfície, que é definido como a diferença, quando medida ao longo de eixos diferentes, nas propriedades físicas ou mecânicas de um material, tem sido aplicado para influenciar alinhamento de células, o crescimento, a migração e 6-7. Além de topografia, existem outros métodos para induzir a anisotropia. Anteriormente, foi investigada anisotropia superfície induzida por processos mecânicos de pré-alongamento estático de poli-dimetil-siloxano (PDMS) de membrana. A teoria da "Super pequena deformação imposta em grande" previu que a rigidez efectiva das células sentir na direcção esticada difere da direcção perpendicular, e esta diferença de rigidez efectiva é devido à superfície de anisotropia 8. As células estaminais mesenquimais (MSCs) cultivadas numa membrana pré-esticado PDMS são capazes de detectar a anisotropia puxando de forma activa à superfície e, como resultado, alinham na direcção pré-esticado 9. Da mesma forma, uma superfície AR anisotrópicaisinger a partir de uma superfície pré-esticado mecânica afeta o alinhamento, assim como o crescimento e a mielinização do gânglio da raiz dorsal (DRG) axônios 10. Aqui nós fornecemos um protocolo para a indução de anisotropia de superfície sobre um substrato pré-estirado estática PDMS para melhorar a regeneração do axônio 10.
Para obter o alinhamento axônio, características topológicas com padrões desejados, relatou para fornecer orientação contato através de fibras e canais 6,11-12 alinhados, foram demonstrados para facilitar o alinhamento axônio 11,13. No entanto, relataram técnicas para induzir alinhamento axónio através características topológicas, tais como fibras, e canais de modelação, não foram capazes de prolongar e aumentar a espessura dos axónios. Em contraste, gradual estiramento mecânico levou ao alinhamento axónio na direcção do estiramento, com axónios compridas e espessas, que aumentaram com a magnitude do troço 14. No entanto, com dispositivo de motor movido in vivo não éfactível. Em contraste, anisotropia induzida pré-esticado estática é menos complicado e pode ser mais facilmente incorporados em futuros desenhos de andaime para aplicações in vivo.
Neste protocolo, um sistema de cultura de células pré-esticado estático é usado para induzir a anisotropia superfície sem características topológicas. O sistema de cultura de pré-esticado é constituído por uma membrana de PDMS, um quadro esticável e uma etapa de alongamento, após o que a membrana é fixada sobre a armação e um troço magnitude predeterminada é aplicada sobre a fase de alongamento. neurónios DRG isoladas de fresco de cultura na superfície pré-esticado por até 21 dias são monitorados para o alinhamento axónio e espessura. Posteriormente, as células de Schwann (SCs) co-cultivadas com os axônios alinhados são monitorados para a mielinização. Ao incorporar pré-estiramento induzido anisotropia superfície fomos capazes de aumentar a célula Alinhamento de diferenciação e axônio Alinhamento de crescimento de MSCs e neurônios DRG 9-10, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos para o isolamento das células foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual de Michigan.
1. Preparação de pré-esticado superfície anisotrópica
- Misturar a 10: solução de base e um agente de cura e verter a mistura em um prato de cultura de tecidos (12 cm de diâmetro). Use 4,900 mg de base e 490 mg de agente de cura para a mistura total de reticulação.
- Manter a mistura de gel sob vácuo durante 20 min para remover as bolhas de ar.
- Coloque a mistura de gel no forno de cura durante a noite a 60 ° C.
- Após a cura da membrana PDMS, tratar a superfície com plasma de oxigénio utilizando um sistema de limpeza / gravação por plasma durante 3 min a 165 mTorr 65 e fluxo sccm de O2.
- Corte um pedaço de membrana rectangular (5 × 3,5 cm) do prato, ao ser consciente de que lado é tratada com oxigênio, verifique se o lado tratado com oxigênio é voltado para cima e fixar em um quadro de alongamento. Coloque o quadro em uma alongamento fase e esticar uniformemente girando o botão na fase até atingir 10% de alongamento (ou algum outro extensível pré-determinado, o alongamento pode ser lida directamente a partir da fase de alongamento), em relação ao maior eixo 9. Corrigir o estiramento, apertando os parafusos da moldura.
- Retire a armação do palco. Certifique-se de superfície da membrana é seca e livre de poeira, em seguida, coloque uma câmara de silicone para a membrana permitindo que o lado adesivo da câmara para prender firmemente à membrana.
Nota: A câmara de silicone fornece um poço para reter o meio de células na membrana de PDMS. O design do dispositivo é mostrado na Figura 1. - Esterilizar a superfície com UV durante 10 min.
- Adicionar 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% em tampão fosfato salino) para a superfície de PDMS no interior da câmara, dentro de seis horas de tratamento com plasma e incubar durante 2 horas a 37 ° C antes de semear os neurónios DRG. Isto aumenta a fixação das células.
- Prepare meio de crescimento padrão para os neurônios do GRD.
- Antes do isolamento, autoclave o equipamento e os reagentes de isolamento de filtro. Adicionar 5 ml de tampão de isolamento para um poço de uma placa de 6 poços, e colocar a placa em gelo. Preparar 10 ml de meio de dissociação por adição de 1 ml de colagenase A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtra-se as soluções com um filtro de 0,22 um e colocar em gelo.
- Use dez a doze 5-7 velhos ratos Sprague-Dawley 'dias para o isolamento. Pulverize os filhotes com 75% isopropanol, e sacrifício por decapitação.
- Cortar a pele que recobre a medula espinhal da parte de trás e remover qualquer excesso de tecido em torno da coluna. Sob uma lupa cirúrgica com as luzes do ponto cirúrgicos em, fazer a primeira incisão do pescoço e, em seguida, um corte ao longo da coluna em ambos os lados com uma tesoura. Retire a coluna vertebral do corpo dos filhotes e remover os músculos em excesso. Em seguida, use uma tesoura para cortar ao longo da long eixo da coluna vertebral e utilizar uma pinça para abrir completamente a coluna vertebral e extrair o cord.Remove a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml.
- Usando um belo par de pinças, retire o gânglio do bolso óssea e recolher cerca de 10-16 DRG de ambos os lados. Aparar as raizes nervosas e transferir os gânglios para o tampão de isolamento arrefecido em gelo.
- Remover a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml. Após a dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
- Deixe os tecidos assentar no fundo do tubo suavemente e remover o tampão de isolamento na parte superior e adicionar 10 ml de meio de dissociação para dentro do tubo.
- Incubar os tecidos dissecados no meio de dissociação, em um banho de água a 37 ° C durante 1 h enquanto se agita o tubo a cada 5-10 min.
- Depois dea dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de crescimento standard e vortex.
- Centrifugar as células dissociadas como indicado na secção 2.9, mais uma vez.
- Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 12 ml de meio de crescimento standard e vortex.
3. Cultura do DRG na superfície pré-esticado
- Antes de semear as células, as soluções remover PLL a partir da câmara e lavar a superfície de PDMS com água estéril e seca ao ar.
- Depois de re-suspender as células, deixar que o conjunto de suspensão de 1 - 2 minutos para permitir que os detritos assentem no fundo do tubo. Adicionar 1,5 ml de suspensão de células em cada câmara de estiramento e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Para eliminar as células gliais, com 1 dia in vitro (DIV), adicionar 10 ul (ou 15 ul) de uma mistura de 2-fluoro-desoxi uridina e uridina (FDU-L) da solutiem (Ver Tabela de Materiais) para cada poço. Após 7 h, substituir este meio com meio de crescimento fresco padrão e colocar o dispositivo de cultura pré-esticado numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Durante o período de cultura de células (2 - 3 semanas), alterar o suporte de dois em dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio fresco. Nota: Após cultura nas superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificados são adicionados à câmara e cultivadas durante mais uma semana (fase 4.7).
4. Co-cultura de células de Schwann (SCS) com DRG neurônios na superfície pré-esticado
- Isolar SCs como descrito por grupo previamente 15 do Dr. Campana.
- Resumidamente, isolar o SCs de um filhote de cachorro 1 dia de idade. Coletar e dissociar o nervo ciático tanto química (tripsina-EDTA e colagenase A) e mecanicamente (18 gauge agulha / seringa de 10 ml) 15.
- Semear as células dissociadas em poli-D-lisina (PDL) coATED balão T25 e a cultura a 37 ° C em 5% de CO 2. No dia 5, purificar as células através de selecção de anticorpos utilizando anti-thy 1,1 de anticorpo e complemento de coelho e subcultura das células purificadas a passagem 2 - 4. média Utilização de cultura contendo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS) , 1% de penicilina / estreptomicina (pen / Strep), 21 ug / ml de pituitária de bovino Extracto (BPE), e 4 | iM Forskolin.
- Remover o meio de cultura a partir do SC, e adicionam-se 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para o balão. Incubar as células a 37 ° C em CO2 5% durante 2-3 min.
- Verificar as células ao microscópio óptico usando uma objectiva de 10X para ver se eles levantam a partir do frasco, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e misturar com as células do frasco.
- Adicionar a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg e 20 ° C durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 7 ml med crescimento DRG padrãoI a.
- Tomar 10 ul de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, misturar com 10 uL de azul de tripano, e depois contar o número de células utilizando um hemocitómetro sob microscopia óptica utilizando uma objectiva de 10X. Dilui-se a suspensão de células a 5000 células por ml pela adição de meio de crescimento DRG.
- Retirar 0,5 mL de meio de cultura a partir do DRG na câmara esticada e adicionar 0,5 ml de suspensão de SC para a cultura de DRG.
- Cultura as células durante 1 semana a 37 ° C e 5% de CO 2. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio de crescimento padrão fresco para DRG. Após co-cultura uma semana, o processo as células por imuno-histoquímica 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O sistema de cultura de células pré-esticado promovido DRG alinhamento 10 axónio. neurónios DRG foram cultivadas em superfícies pré-esticado e não estiradas durante 12 dias. Os axónios foram corados para β-III-tubulina para demonstrar o seu alinhamento. A Figura 2 compara a orientação axonal nas PDMS pré-esticado e não estiradas substratos após 12 dias de cultura. Os axónios DRG alinhados paralelamente à direcção esticada, enquanto que eles mostraram alinhamento aleatório e formaram uma rede interligada sobre o substrato de PDMS não estirada.
Em adição à indução de alinhamento axónio, anisotropia induzida pré-esticar melhorada a fasciculação de axónios. Os axônios alinhados sobre os feixes de axônios superfície esticada formados, o que difere da rede axonal conectado observados na superfície não esticada. Estes pacotes fasciculares na superfície pré-estirado assemelhava tr tecido nervosoatos in vivo. A Figura 3 mostra os axônios dos neurônios DRG em superfícies pré-esticado e não estiradas após 21 dias de cultura. Como a Figura 3 ilustra, os axônios no substrato pré-estirado agregadas em conjunto para formar pacotes, que apareceu semelhante ao trato fasciculares. Isto sugeriu a superfície pré-estirado era capaz de promover o crescimento extensivo axónio na direcção do pré-estiramento, que são importantes para intensificar a regeneração do tecido nervoso.
Para avaliar a mielinização, SCs foram co-cultivados com os axónios alinhadas. Após cultura das neurónios DRG sobre as superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificadas foram adicionadas à câmara e cultivadas durante uma semana. Na Figura 4, os axónios da co-cultura são coradas com β-III-tubulina (verde), e as SCs são coradas com P0 (vermelho). P0 é um marcador de SCs madura e é também um componente da bainha de mielina,bem como considerada um indicador de mielinização. Não é co-localização significativa do verde e vermelho na superfície pré-esticado, sugestivo de SCs associadas aos axónios na superfície esticada, mas não sobre a superfície não estirado, onde as manchas verdes e vermelhas são distribuídos de forma aleatória. As superfícies pré-esticado reforçada alinhamento axônio, a formação do trato fascicular-like, e fixação dos SCs para os axônios regenerados, todos críticos para a mielinização.
Figura 1:. Esquemático para o procedimento de pré-estiramento (a) Um pedaço de membrana PDMS é cortada em duas tiras de quadro que podem deslizar. A estrutura do dispositivo é de cerca de 7 "x 5"; as chaves são cerca de 5 "x 1; os grampos nas cintas são cerca de 3" x 25 ", eo copo é cerca de 1,5" de diâmetro superior aberta, 1 "fundo aberto, e cerca de 0,25 & #34; alto. (B) Colocar o quadro para a fase de alongamento, girar o rolo para aplicar 10% de alongamento, e, em seguida fixar as posições das tiras, apertando os parafusos. (C) Retire a armação do estágio de alongamento, e anexar uma câmara de silício sobre a membrana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alinhamento Axon na superfície pré-esticado e não estiradas imagens fluorescentes de neurónios DRG semeadas no (a) de superfície pré-esticado estática durante 12 dias, em comparação com células inoculadas na DRG (b) da superfície não esticada durante 12 dias.. Axônios alinhados na direção pré-esticado, enquanto os axônios alinhadas aleatoriamente na superfície de controle não esticada. Axons foram coradas com anticorpo primário tubulina anti-rato β-III, e fotografada com microscópio confocal usando uma objetiva de 10X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento Espessura Axon na esticada vs. não esticada PDMS Substrato imagens de contraste de fase de axônios DRG no (a) esticada e (b) superfícies não estiradas após 21 dias.. Axônios na superfície esticado formado feixes mais espessos, enquanto que na superfície não esticada dos axónios formado axonal rede inter-ligada. As imagens foram tiradas com microscópio de contraste de fase inversas usando uma objetiva de 10X. Por favor clique aqui para ver alversão Arger desta figura.
Figura 4:. SCS com Alinhado DRG axônios co-cultivadas em esticada vs não estiradas PDMS Substratos Após cultura nas superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificadas foram adicionadas à câmara e cultivadas durante uma semana. (A) β-III-tubulina (verde) para coloração de axónios na superfície esticada; (B) sobreposição de β-III-tubulina (verde), P0 (vermelho) de coloração sobre a superfície esticada; (C) β-III-tubulina (verde) para coloração de axónios na superfície não esticada; (D) sobreposição de β-III-tubulina (verde), P0 (vermelho) de coloração sobre a superfície não estirada. Na superfície pré-esticado, as manchas vermelhas e verdes colocalize, sugerindo a SCs são anexados a e provavelmente myelinating os axônios. Por não esticadasuperfície, as manchas vermelhas e verdes são distribuídos aleatoriamente, sugerindo as SCs não estão associadas aos axónios. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Para induzir o alinhamento axónio na superfície pré-esticado, existem dois passos essenciais: 1) a membrana PDMS tem de ser plana e de espessura homogénea; e 2) células gliais deve ser removido a partir do DRG. Depois de misturar os PDMS e agente de reticulação e cura em um forno, o gel PDMS reticulado deve ser mantido no topo de uma bancada plana e manuseadas com cuidado para evitar qualquer inclinação. O tratamento com plasma de oxigénio da membrana PDMS deve ser seguido dentro de 6 horas por revestimento de PLL, uma vez que a hidrof ilicidade da superfície (necessária para a ligação de células) após tratamento com plasma atenua com o tempo. Uma vez que o tratamento com plasma é aplicada a um lado da membrana, deve ser tomado cuidado após o descascamento do PDMS fora do prato para assegurar o lado correcto é colocado na armação, isto é, a superfície tratada a plasma deve ser voltada para cima para que as células anexar.
Os DRGs estão localizados no interior dos bolsos de osso que se alinham ao lado da coluna vertebral. Uma vez que a cor da vértebra é em brancofilhotes jovens, é difícil distinguir os DRGs da vértebra. Neste caso, é importante colocar a coluna vertebral perto da luz local. Sob a luz, os DRGs ficar transparente enquanto o osso permanece branco e opaco. É importante manter o tampão de dissecção em gelo e a um pH fisiológico, uma vez que o pH influencia a viabilidade das células neurais. Os tecidos isolados são muito viscosos e tendem a ficar com a ponta da pipeta ao transferir para um tubo de centrífuga. Assim, o corte da ponta da pipeta para gerar uma abertura maior facilita a transferência.
Em alguns protocolos, não é mais necessário um passo de centrifugação com os tecidos isolados antes da adição do tampão de dissociação. Em vez de este passo, o nosso protocolo exige que os tecidos se estabelecer no buffer de dissecção por um par de minutos, o que reduz a etapa de centrifugação extra que de outra forma teria impacto na viabilidade e densidade das células. A densidade celular também é dependenteno número de filhotes sacrificados, e, portanto, é importante para manter um número consistente de crias de cada vez. Existem também células gliais que estão isoladas juntamente com os neurónios DRG, assim um inibidor mitótico, FDU-L, é adicionado ao meio de cultura a uma DIV para suprimir o crescimento das células gliais. Isto é vulgarmente utilizado para inibir células gliais durante o período inicial de crescimento dos neurónios, apesar de alguns protocolos de preferência uma combinação de arabinofuranosylcytidine (AraC) e FDU-L. A concentração molar de FDU-L adicionado à cultura varia nos diferentes protocolos, dependendo da densidade das células isoladas. Encontramos o inibidor mitótico pode ser adicionada várias vezes (na concentração especificada no passo 3.3), conforme necessário (se as células gliais estão presentes), durante toda a cultura DRG. geralmente não é recomendado adicionar uma grande quantidade (mais de 15 ul) em qualquer dado momento, uma vez que afeta a fixação dos neurônios do GRD.
O tratamento do plasma aumenta surface hidrofilicidade eo revestimento PLL fornece uma superfície cobrado por axônios para iniciar anexo. De acordo com referências na literatura, o tratamento com plasma induzida de hidrofilicidade irá atenuar ao longo do tempo, sob condições secas 16-17. No entanto PDMS vai sofrer uma reação lenta com água em condições de líquidos e irá gradualmente mudar de ser hidrofóbica para hidrofílico 18. Portanto, mesmo que o tratamento com plasma atenua com o tempo, não deve impactar nossos resultados. Para o revestimento de PLL, de acordo com as informações do produto a partir do fornecedor, que é estável ao longo do ano, se colocada sob condições favoráveis. Uma vez que as células de prender para o revestimento de PLL, que geralmente não irá separar. Além disso, o revestimento de PLL ajuda com o acessório inicial, e como as células crescem eles secretam proteínas da matriz extracelular (ECM), que ainda ajudá-los a permanecer ancorada à superfície 19. melhorias no projeto futuro poderiam incluir encaixar peptídeos no PDMS rede durante a reticulação, o que eliminaria o tratamento com plasma e passos de revestimento de PLL.
O protocolo, aqui, descreveu uma abordagem de engenharia que gerou anisotropia superfície para induzir com sucesso alinhamento axônio, crescimento e mielinização. A abordagem pode ser experimentalmente expandida de duas maneiras. Em primeiro lugar, a superfície da anisotrópica pode ser aplicada para criar tecidos nervosos em cultura e in vitro vias nervosas poderia então ser transplantadas in vivo. Em segundo lugar, o conceito de anisotropia superfície poderia ser incorporado no desenho de andaimes transplantáveis que pode ser utilizado in vivo para melhorar o alinhamento dos axónios em regeneração do local da lesão e mielinização das SCs hospedeiras. Em comparação com outras abordagens que exigem múltiplos e complicados dispositivos de 20-22, bem como a adição de fatores de crescimento, a nossa plataforma é relativamente simples e fácil de aplicar, e depende apenas de pré-estiramento para melhorar tanto axônio alignment e mielinização, sem a necessidade de adição de factor de crescimento. Além disso temos testado este conceito de pré-estiramento no delineamento experimental em ambos os MSCs e neurônios DRG que poderiam ser facilmente aplicados a outros tipos de células. A concepção corrente foi utilizada para investigar o crescimento axonal em superfícies 2-dimensional, no entanto, no futuro, o dispositivo poderia ser elevado para permitir o teste das culturas de células 3-dimenstional. As aplicações futuras na reparação de nervos e transplante poderia incorporar pré-estiramento nos andaimes transplantáveis feitos de materiais naturais ou sintéticos biodegradáveis contendo peptídeos reticuladas, juntamente com propriedades medicamentosas de libertação controlada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Eric Vasco por sua ajuda na preparação dos substratos PDMS, Dr. Shiyong Wang no laboratório do Dr. Marina Mata da Universidade de Michigan para sugestões e formação do isolamento DRG votos, e Dr. Mark Tuszynski e Dr . W. Marie Campana na UC San Diego para sugestões úteis e protocolo para o isolamento SC. Este estudo foi apoiado em parte pela National Science Foundation (CBET 0.941.055 e 1.510.895 CBET), o Instituto Nacional de Saúde (R21CA176854, R01GM089866 e R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
