Introduction
In zenuwletsels, worden de proximale en distale zenuwstompen vaak voorkomen directe aanpassing van de zenuw bundels door de laesie 1-2. Gewoonlijk worden axon stukken uit sterk geordende en uitgelijnd bundels van axonen, die complexe netwerken van connectiviteit vormen. Echter, zenuwregeneratie is een chaotisch proces te wijten aan slecht georganiseerde axon uitlijning 3-4. Derhalve voldoende regenererende axons die de laesie overbruggen genereren, is het noodzakelijk om goed georganiseerd axonale uitlijning induceren. Bovendien, demyelinisatie begeleidt zenuwbeschadigingen als gevolg van de dood van de myelinating cellen op het letsel plaats. Sinds demyelinisatie sterk schaadt de geleidende capaciteit van de overlevende axonen, behandelingen gericht demyelinisatie of het bevorderen van remyelinisatie zijn belangrijk voor functioneel herstel na zenuwletsel 5. Dus het doel van dit protocol is om een technische benadering die deze twee aspecten worden behandeld illustrerenvan zenuwregeneratie.
Oppervlak anisotropie, die wordt gedefinieerd als het verschil, gemeten langs verschillende assen in een materiaal fysische of mechanische eigenschappen, is toegepast op celuitlijning, groei en migratie 6-7 beïnvloeden. Naast topografie, zijn er andere methoden om anisotropie induceren. Eerder onderzochten we oppervlak anisotropie geïnduceerd door statische mechanische voorrek poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) membraan. De theorie van "kleine deformatie super opgelegd grote" voorspelde dat de effectieve stijfheid van de cellen zin in de gerekte richting afwijkt van de loodrechte richting, en dit verschil in effectieve stijfheid door anisotropie 8 oppervlak. Mesenchymale stamcellen (MSCs) gekweekt op een voorgerekt PDMS membraan kunnen de anisotropie zin door het oppervlak actief trekken en daardoor uitlijnen in de voorgerekte richting 9. Ook een anisotrope oppervlak arising Uit mechanisch voorgerekt oppervlak beïnvloedt de uitlijning, alsmede groei en myelinisatie van dorsale wortel ganglion (DRG) axonen 10. Hier hebben we een protocol voor het induceren oppervlak anisotropie op een statische voorgerekt PDMS substraat axon regeneratie 10 te verbeteren.
Om axon uitlijning, topologische kenmerken met de gewenste patronen te lokken, naar verluidt contact begeleiding bieden door middel van uitgelijnde vezels en kanalen 6,11-12 werd aangetoond dat axon uitlijning 11,13 vergemakkelijken. Meldde echter technieken voor het induceren axon uitlijning met topologische kenmerken, zoals vezels, zenders en patroonvorming, konden verlengen en verhoging van de dikte van de axonen. Daarentegen geleidelijke mechanisch rekken tot axon aanpassing in de verstrekrichting met langere en dikkere axonen die toe met de grootte van het rek 14. Echter, voorzien van een motor aangedreven apparaat in vivo is niethaalbaar. Daarentegen statische voorgerekte geïnduceerde anisotropie eenvoudiger en gemakkelijker kunnen worden opgenomen in toekomstige ontwerpen scaffold voor in vivo toepassingen.
In dit protocol wordt een statische voorgerekt celcultuur gebruikt oppervlak anisotropie induceren zonder topologische kenmerken. De voor uitgerekte kweeksysteem bestaat uit een PDMS membraan, een rekbaar frame en een stretching fase, waarna het membraan op het frame is bevestigd en een vooraf bepaalde magnitude rek wordt aangebracht op het podium strekken. Vers geïsoleerde DRG neuronen gekweekt op het voorgerekte oppervlak maximaal 21 dagen gecontroleerd op axon uitlijning en dikte. Vervolgens Schwann-cellen (SC) tezamen gekweekt met de uitgelijnde axonen gecontroleerd op myelinisatie. Door de integratie voorreksysteem oppervlak geïnduceerde anisotropie konden we celuitlijning-differentiatie en axon-groei uitlijning van MSC's en DRG neuronen 9-10 respectievelijk verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor de isolatie van de cellen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Michigan State University.
1. Voorbereiding van de Pre-gespannen Anisotropische Surface
- Meng een 10: 1 oplossing van base en uithardingsmiddel en giet het mengsel in een weefselkweekplaat (12 cm diameter). Gebruik 4900 mg base en 490 mg verharder voor het totale verknopingsmengsel.
- Houd de gel mengsel onder vacuüm gedurende 20 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Plaats de gel mengsel in de oven gedurende de nacht uitharden bij 60 ° C.
- Na het PDMS membraan kuren, behandel het oppervlak met zuurstofplasma met behulp van een plasma cleaning / etsen voor 3 min bij 165 mTorr en 65 sccm stroom van O2.
- Knip een stuk rechthoekige membraan (5 x 3,5 cm) van de schotel, terwijl ze bewust welke kant-zuurstof behandeld, zorg ervoor dat de zuurstof behandelde zijde naar boven en zet op een stretching frame. Plaats het frame op een stretching fase en gelijkmatig strekken door de knop op het podium totdat 10% rek bereikt (of een andere vooraf bepaalde rek, de rek kan worden afgelezen uit de rekken fase) in de langere as 9. Bevestig het traject door de schroeven op het frame.
- Verwijder het frame van het podium. Zorg ervoor dat het membraanoppervlak is droog en vrij van stof, plaats dan een silicone kamer op het membraan waardoor de kleverige kant van de kamer om stevig te hechten aan het membraan.
Opmerking: De siliconen kamer kan ook voor het vasthouden van het celmedium de PDMS membraan. Het apparaat apparatuur is getoond in figuur 1. - Steriliseer het oppervlak met UV gedurende 10 min.
- Voeg 1 ml poly-L-lysine (PLL) (0,01% in fosfaat gebufferde zoutoplossing) aan de PDMS oppervlak binnen de kamer binnen 6 h plasmabehandeling en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C vóór de DRG neuronen zaaien. Dit vergroot celhechting.
- Bereid standaard groeimedium voor de DRG neuronen.
- Voorafgaand aan de isolatie, de isolatie autoclaaf apparatuur en reagentia filter. Voeg 5 ml van isolatie buffer in een putje van een 6-well plaat, en leg de plaat op het ijs. Bereid 10 ml dissociatie medium door toevoeging van 1 ml collagenase A (500 U / ml) aan 9 ml 0,05% trypsine-EDTA (1 mg / ml), filtreer de oplossingen met een 0,22 urn filter en plaats op ijs.
- Gebruik 11:50 5-7 oude Sprague-Dawley ratten dagen voor de isolatie. Spuit de pups met 75% isopropanol, en offeren door onthoofding.
- Knip de huid bovenliggende het ruggenmerg van de achterkant en verwijder eventueel overtollige weefsel rond de wervelkolom. Onder een chirurgische vergrootglas met de chirurgische spotjes, levert de eerste incisie van de hals en een snede langs de wervelkolom aan beide zijden met een schaar. Maak de ruggengraat van het lichaam van de pups en verwijder de overtollige spieren. Dan, met een schaar langs de lon te snijdenG as van de wervelkolom en het gebruik pincet om de wervelkolom volledig openen en extraheren de spinale cord.Remove de tip van een pipet om een grotere opening voor het overbrengen van de DRG's met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren.
- Met behulp van een fijne pincet, verwijder de ganglion van het bot zak en het verzamelen van ongeveer 10-16 DRG van beide kanten. Snijd de zenuwwortels en de overdracht van de ganglia van de ijskoude isolatie buffer.
- De tip van een pipet om een grotere opening voor het overbrengen van de DRG's met isolatie buffer in een steriele 15 ml buis te creëren. Na de chemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Laat de weefsels naar de bodem van de buis en verwijder de isolatie buffer geplaatst en voeg 10 ml dissociatie medium in de buis.
- Incubeer de ontleed weefsel in de dissociatie medium in een 37 ° C waterbad gedurende 1 uur onder schudden de buis elke 5-10 minuten.
- Nachemische dissociatie Centrifugeer de ganglia bij 900 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml kweekmedium en vortex.
- Centrifugeer de gescheiden cellen als vermeld in paragraaf 2.9 nogmaals.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer de pellet in 12 ml van de standaard groei media en vortex.
3. Culture of DRG op pre-stretched Surface
- Voorafgaand aan de cellen zaaien, de PLL oplossingen uit de kamer en spoel de PDMS oppervlak met steriel water en lucht drogen.
- Na resuspenderen van de cellen, laat de suspensie ingesteld voor 1-2 minuten om de te laten bezinken naar de bodem van de buis. Voeg 1,5 ml celsuspensie in elk rek kamer en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2.
- Om gliacellen te elimineren, op 1 dag in vitro (DIV), voeg 10 ul (of 15 pi) mengsel van fluor-2 deoxy-uridine en uridine (FDU-U) stock solutiop (zie tabel van Materialen) aan elk putje. Na 7 uur, de plaats van dit medium door vers standaard groeimedium en plaats de voorgerekte kweekinrichting in een 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Tijdens de celkweek periode (2-3 weken), veranderen de media om de twee dagen door het vervangen van de helft van het verbruikte medium door vers medium. Let op: Na het kweken op de uitgerekte en zonder rek oppervlakken voor 2 weken, worden gezuiverd SC's toegevoegd aan de kamer en gedurende een week (stap 4.7).
4. Co-kweek van Schwann-cellen (SC) met DRG neuronen op pre-stretched Surface
- Isoleer SC's zoals beschreven door Dr. Campana de groep eerder 15.
- In het kort, isoleren van de SCS van een 1 dag oud pup. Verzamelen en distantiëren de nervus zenuwen zowel chemisch (trypsine-EDTA en Collagenase A) en mechanisch (18 gauge naald / 10 ml spuit) 15.
- Het zaad van de gescheiden cellen in poly-D-lysine (PDL) coated T25 kolf en kweek bij 37 ° C in 5% CO2. Op dag 5, zuiveren de cellen door selectie antilichaam Anti- thy 1,1 antilichaam en konijn complement en subcultuur de gezuiverde cellen passage 2 - 4. Gebruik kweekmedium dat Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) , 1% penicilline / streptomycine (Penn / Strep), 21 ug / ml runderhypofyse-extract (BPE) en 4 uM forskoline.
- Verwijder het kweekmedium van de SC en voeg 5 ml 0,05% trypsine-EDTA in de kolf. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2 - 3 min.
- Controleer cellen onder de optische microscoop met een 10X objectief te zien of ze verheffen uit de kolf, voeg 5 ml kweekmedium en meng met de cellen in de kolf.
- Voeg de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 7 ml standaard DRG groei medIA.
- Neem 10 pi celsuspensie in een 0,5 ml microcentrifugebuis, mengen met 10 pi van trypan blauw, en tel het aantal cellen met een hemocytometer onder de optische microscoop met een 10X objectief. Verdun de celsuspensie tot 5000 cellen per ml door toevoeging DRG groeimedia.
- Verwijder 0,5 ml van medium uit de DRG cultuur in de uitgerekte kamer en voeg 0,5 ml SC suspensie aan de DRG cultuur.
- Kweken van de cellen gedurende 1 week bij 37 ° C en 5% CO 2. Verandering de media om de twee dagen door vervanging halve verbruikte medium met vers standaard groeimedium voor DRG. Na 1 week co-cultuur werkwijze de cellen door immunohistochemie 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De pre-uitgerekt celcultuur gepromoot DRG axon uitlijning 10. DRG neuronen werden gekweekt op voorgerekt en zonder rek oppervlakken 12 dagen. De axonen werden gekleurd voor β-III-tubuline om hun uitlijning te tonen. Figuur 2 vergelijkt axon oriëntatie op het pre-uitgerekte en zonder rek PDMS substraten na 12 dagen van de cultuur. De DRG axonen evenwijdig aan de gerekte richting, terwijl ze toonden willekeurige uitlijning en vormden een fijnmazig netwerk op de niet-uitgerekte PDMS substraat.
In aanvulling op het induceren van axon uitlijning, pre-stretch-geïnduceerde anisotropie verbeterde de Fasciculatie van axonen. De uitgelijnde axonen op de uitgerekte oppervlak gevormde axonale bundels, die verschilden van de aangesloten axonale netwerk waargenomen op het oppervlak zonder rek. Deze fasciculair bundels op de voorgerekte oppervlak leek zenuwweefsel tracts in vivo. Figuur 3 toont axonen van de DRG neuronen van vooraf gespannen en zonder rek oppervlakken na 21 dagen kweek. Zoals figuur 3 toont, de axonen op de voorgerekte substraat samen geaggregeerd bundels, die vergelijkbaar contracten fasciculair verschenen vormen. Dit suggereerde de voorgerekte oppervlak kon uitgebreid axon groei bevorderen in de richting van de voorrek, die belangrijk zijn in het verbeteren regeneratie van zenuwweefsel zijn.
Om myelinisering beoordelen, SC's waren co-gekweekt met de uitgelijnde axonen. Na kweken van de DRG neuronen van de uitgerekte en zonder rek oppervlakken voor 2 weken, werden gezuiverd SC aan de kamer toegevoegd en gedurende nog een week. In figuur 4 zijn de axonen van de co-cultuur gekleurd met β-III tubuline (groen), en SC worden gekleurd met P0 (rood). P0 is een marker van volwassen SC en is ook een onderdeel van de myelineschede,en als een indicator van myelinisatie. Er is significante co-lokalisatie van groen en rood op de voorgerekte oppervlak, suggereren SC verbonden aan de axonen op het uitgerekte oppervlak, maar niet op de niet-uitgerekte oppervlak waar de groene en rode vlekken willekeurig verdeeld. De pre-uitgerekt vlakken verbeterd axon uitlijning, fasciculair-formatie darmkanaal, en bevestiging van SC aan de geregenereerde axonen, alle kritische voor myelinisatie.
Figuur 1:. Schema voor de voorrek Procedure (a) Een stuk PDMS membraan geklemd twee stroken van het frame verschuifbaar zijn. Het gestel van de inrichting is ongeveer 7 "x 5"; de beugels zijn ongeveer 5 "x 1, de klemmen op de beugels zijn ongeveer 3" x 0,25 ", en de beker is ongeveer 1,5" diameter wijd open dak, 1 "open bodem, en ongeveer 0,25 & #34; lang. (B) Plaats het frame op het strekken podium, draait de rol om 10% rek te passen, en vervolgens vast te stellen de posities van de stroken door de schroeven. (C) Verwijder het frame van het uitrekken podium, en bevestig een silicium kamer op het membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Axon passing aan vooraf uitgerekt en rek Oppervlakte fluorescerende beelden van DRG neuronen gezaaid op de (a) statische voorgerekt oppervlak gedurende 12 dagen, vergeleken met DRG cellen gezaaid op de (b) niet uitgerekte oppervlak gedurende 12 dagen.. Axonen uitgelijnd in de voorgerekte richting, terwijl axons willekeurig uitgelijnd onverstrekte stuurvlak. axons werden gekleurd met anti-muis β-III tubuline primaire antilichaam en afgebeeld met confocale microscoop met een 10X objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Axon dikte Groei op gespannen versus rek PDMS substraat fasecontrastbeelden van DRG axons op (a) gestrekt en (b) niet uitgerekte oppervlakken na 21 dagen.. Axonen op de uitgerekte oppervlak gevormde dikkere bundels, terwijl op de niet-uitgerekte oppervlak van de axonen vormde elkaar verbonden axonale netwerk. Beelden werden genomen met behulp van inversed fase contrast microscoop met een 10X objectief. Klik hier om al te bekijkenArger versie van deze figuur.
Figuur 4:. Co-gekweekt SC met Aligned DRG Axons op gespannen vs. rek PDMS Substrates Na het kweken op de uitgerekte en zonder rek oppervlakken voor 2 weken, gezuiverd SC's werden naar de kamer toegevoegd en gekweekt voor nog een week. (A) β-III tubuline (groen) kleuring op axonen op de gestrekte oppervlak; (B) Overlay van β-III tubuline (groen), P0 (rode) vlekken op het uitgerekte oppervlak; (C) β-III tubuline (groen) kleuring op axonen op de gerekte oppervlak; (D) Overlay van β-III tubuline (groen), P0 (rode) vlekken op het oppervlak zonder rek. Op de pre-gestrekt oppervlak, de rode en groene vlekken colocaliseren, suggereert de SC zijn bevestigd aan en waarschijnlijk myeliniserende de axonen. Op onverstrekteoppervlak, worden de rode en groene vlekken willekeurig verdeeld, wat suggereert dat de SC niet aan de axonen. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om axon aanpassing aan voorgerekt oppervlak induceren, zijn er twee belangrijke stappen: 1) het PDMS membraan moet vlak en vormt een homogene dikte; en 2) gliacellen moeten van de DRG verwijderd. Na mengen van de PDMS en crosslinker en uitharding in een oven, moet de verknoopte PDMS gel op een vlakke werktafel bewaard en voorzichtig behandeld om eventuele kantelen te vermijden. De zuurstof plasmabehandeling van het PDMS membraan worden gevolgd door 6 uur PLL-bekleding, aangezien de hydrofiliciteit van het oppervlak (vereist voor celhechting) na plasmabehandeling vermindert de tijd. Aangezien de plasmabehandeling wordt aangebracht op één zijde van het membraan, moet erop worden gelet na afpellen van het PDMS van de schotel naar de juiste kant garanderen is geplaatst op het frame, dat wil zeggen het plasma behandelde oppervlak moet worden gericht op de cellen bevestigen aan.
De DRG's bevinden zich in het bot zakken die lijn langs de wervelkolom. Aangezien de kleur van de wervel is witjonge honden, is het moeilijk om de DRG onderscheiden van de wervel. In dit geval is het belangrijk om de rug vlakbij de spotlights plaatsen. Onder het licht, de DRG draaien transparant, terwijl het bot wit en ondoorzichtig blijft. Het is belangrijk om de dissectie buffer op ijs en bij een fysiologische pH te houden, aangezien de pH beïnvloedt de levensvatbaarheid van de neurale cellen. De geïsoleerde weefsels zijn zeer viskeus en hebben de neiging vast te houden aan de pipet tip bij het overbrengen naar een centrifugebuis. Zo snijden het uiterste puntje van de pipet voor het genereren van een grotere opening bevordert de overdracht.
In sommige protocollen, is er nog een centrifugatie stap vereist met de geïsoleerde weefsels voordat u de dissociatie buffer. In plaats van deze stap ons protocol vereist dat het weefsel zich in de dissectie buffer gedurende enkele minuten, waarbij de extra centrifugatiestap die anders de levensvatbaarheid en dichtheid van de cellen zou beïnvloeden vermindert. De celdichtheid is ook afhankelijkhet aantal jongen opgeofferd, en is dus belangrijk om een consistent aantal jongen telkens handhaven. Er zijn ook gliale cellen die zijn geïsoleerd met de DRG neuronen, dus een antimitoticum, FDU-U, toegevoegd aan het kweekmedium op 1 DIV om de groei van de gliacellen onderdrukken. Dit wordt vaak gebruikt om gliacellen remmen tijdens de eerste groeiperiode van de neuronen, hoewel sommige protocollen voorkeur een combinatie van arabinofuranosylcytidine (AraC) en FDU-U. De molaire concentratie van FDU-U toegevoegd aan de kweek varieert in de verschillende protocollen, afhankelijk van de dichtheid van de geïsoleerde cellen. We vonden de antimitoticum kan meerdere malen worden toegevoegd (bij hetzij de in stap 3,3), indien nodig (indien gliale cellen aanwezig zijn), gedurende de gehele kweek DRG. In het algemeen wordt aanbevolen om een grote hoeveelheid (meer dan 15 pl) op een bepaald moment omdat het invloed op de hechting van de DRG neuronen voegen.
Plasma behandeling verbetert surface hydrofiliciteit en de PLL-coating zorgt voor een geladen oppervlak voor axonen om bevestiging te starten. Volgens verwijzingen in de literatuur, de plasmabehandeling geïnduceerde hydrofiliciteit verzwakken tijd onder droge omstandigheden 16-17. Toch PDMS zal een langzame reactie met water onder vloeibare omstandigheden ondergaan en zal geleidelijk veranderen van hydrofoob naar hydrofiel 18. Daarom hoewel de plasmabehandeling verzwakt tijd zal dit niet onze resultaten beïnvloeden. Voor de PLL coating volgens de productinformatie van de leverancier is stabiel jaar, onder gunstige omstandigheden geplaatst. Zodra de cellen hechten op de PLL-bekleding, dat deze doorgaans niet los. Bovendien, de PLL-bekleding helpt bij de initiële hechting en de cellen groeien ze extracellulaire matrix (ECM) eiwitten die ze verder helpen verankerd blijven aan het oppervlak 19. Toekomstige verbeteringen in het ontwerp kan onder meer inbedding peptiden in de PDMS netwerk tijdens verknoping, waarbij de plasmabehandeling en PLL coatingstappen zouden wegnemen.
Het protocol, hierin beschreven een technische benadering die gegenereerd oppervlak anisotropie om succesvol te induceren axon uitlijning, groei en myelinisatie. De benadering kan experimenteel worden uitgebreid op twee manieren. Ten eerste kan de anisotrope oppervlak worden toegepast zenuwweefsels creëren cultuur, en de in vitro zenuwbanen kan vervolgens worden getransplanteerd in vivo. Ten tweede zou het begrip oppervlak anisotropie in het ontwerp van transplanteerbare steigers die in vivo kan worden gebruikt om de uitlijning van de regenererende axonen van de verwonding en myelinisatie van de host SC verbeteren worden opgenomen. Vergeleken met andere benaderingen die verschillende en ingewikkelde apparaten 20-22, alsmede de toevoeging van groeifactoren vereisen, ons platform is relatief eenvoudig en gemakkelijk toepasbaar en voert alleen voorrek zowel axon ali verbeterengnment en myelinisatie zonder dat groeifactor toevoeging. Verder hebben we dit concept voorrek getest proefopzet zowel MSCs en DRG neuronen die gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere celtypen. Het huidige ontwerp werd gebruikt om axon groei op 2-dimensionale oppervlakken te onderzoeken, maar in de toekomst het apparaat kan worden opgewaardeerd tot het testen van 3-dimenstional celculturen mogelijk. Toekomstige toepassingen in zenuw reparatie en transplantatie kon pre-stretch te nemen in het transplanteren steigers gemaakt van biologisch afbreekbare natuurlijke of synthetische materialen die verknoopt peptiden samen met gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Eric Vasco bedanken voor zijn hulp bij de voorbereiding van het PDMS substraten, Dr. Shiyong Wang in het lab van Dr. Marina Mata aan de Universiteit van Michigan voor nuttige tips en training van de DRG isolatie, en Dr. Mark Tuszynski en Dr. . W. Marie Campana bij UC San Diego voor nuttige tips en protocol voor de SC isolement. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Science Foundation (CBET 0.941.055 en CBET 1.510.895), het National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 en R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
