Introduction
In lesioni nervose, i monconi prossimali e distali del nervo sono spesso impedito di riallineamento diretta di fascicoli nervosi a causa del sito della lesione 1-2. Normalmente, tratti di assoni sono composti da fasci altamente ordinate e allineate di assoni, che formano reti complesse di connettività. Tuttavia, la rigenerazione dei nervi è un processo caotico a causa di allineamento degli assoni mal organizzato 3-4. Pertanto, per generare un numero sufficiente di rigenerare assoni che colmano il sito della lesione, è necessario per indurre ben organizzato allineamento assonale. Inoltre, demielinizzazione accompagna lesioni nervose a causa di morte delle cellule mielinizzanti presso il luogo di ferita. Dal momento che demielinizzazione compromette fortemente la capacità conduttiva di sopravvivere assoni, i trattamenti di targeting demielinizzazione o che promuovono la rimielinizzazione sono significativi per il recupero funzionale dopo lesione del nervo 5. Così l'obiettivo di questo protocollo è quello di illustrare un approccio ingegneristico che affronta questi due problemidi rigenerazione nervosa.
Anisotropia di superficie, che è definito come la differenza, quando misurata lungo assi diversi, in proprietà fisiche e meccaniche di un materiale, è stato applicato per influenzare l'allineamento cellulare, la crescita e la migrazione 6-7. Oltre alla topografia, ci sono altri metodi per indurre anisotropia. In precedenza, abbiamo studiato anisotropia superficie indotta dalla meccanica statica pre-tratto di poli-dimetil-silossano (PDMS) membrana. La teoria del "piccolo super-deformazione imposta su grandi", prevede che la rigidezza efficace le cellule percepiscono nella direzione allungata differisce dalla direzione perpendicolare, e questa differenza di rigidità efficace è dovuto alla superficie anisotropia 8. Cellule staminali mesenchimali (MSC) coltivate su una membrana pre-stirato PDMS sono in grado di percepire l'anisotropia tirando attivamente la superficie e, di conseguenza, allineare in direzione prestirato 9. Analogamente, una superficie ar anisotropoising da una superficie pre-stirato meccanico colpisce l'allineamento, così come la crescita e la mielinizzazione dei gangli delle radici dorsali (DRG) assoni 10. Qui forniamo un protocollo per indurre anisotropia di superficie su un substrato di PDMS pre-stirato statico per migliorare la rigenerazione degli assoni 10.
Per suscitare l'allineamento degli assoni, le caratteristiche topologiche con i modelli desiderati, segnalato per fornire una guida contatto attraverso fibre allineate e canali 6,11-12, sono stati dimostrato di facilitare l'allineamento degli assoni 11,13. Tuttavia, le tecniche per indurre l'allineamento assone attraverso le caratteristiche topologiche, come fibre, canali e patterning riportato, erano in grado di allungarsi e aumentare lo spessore degli assoni. Al contrario, graduale stiramento meccanico portato all'allineamento assone nella direzione di stiro con assoni più lunghi e più spessi che aumentano con la grandezza del tratto 14. Tuttavia, incorporante un dispositivo motore alimentato in vivo non èfattibile. Al contrario, statica anisotropia indotta prestirato è meno complicato e può essere più facilmente incorporato in futuri disegni ponteggi per applicazioni in vivo.
In questo protocollo, un sistema di coltura cellulare prestirato statico viene utilizzato per indurre anisotropia superficie senza caratteristiche topologiche. Il sistema di coltura prestirato è composto da una membrana PDMS, un telaio estensibile e una fase di stretching, dopo di che la membrana è fissata sul telaio ed una grandezza tratto predeterminato viene applicato sulla scena stretching. Appena isolate neuroni DRG coltivate sulla superficie prestirato che fino a 21 giorni sono monitorati per l'allineamento assone e spessore. Successivamente, le cellule di Schwann (SC) co-coltura con gli assoni allineati vengono monitorati per mielinizzazione. Incorporando pre-stiro indotta anisotropia superficie siamo stati in grado di migliorare l'allineamento delle cellule-differenziazione e assone allineamento crescita delle cellule staminali mesenchimali e neuroni DRG 9-10, rispettivamente.
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Protocol
Tutte le procedure per l'isolamento delle cellule sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa presso la Michigan State University.
1. Preparazione di pre-allungato anisotropico Surface
- Mescolare un 10: 1 soluzione di base e catalizzatore e versare il composto in un piatto di coltura di tessuti (12 cm di diametro). Utilizzare 4.900 mg base e 490 mg di catalizzatore per la miscela totale reticolazione.
- Mantenere la miscela gel sotto vuoto per 20 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
- Mettere il composto gel nel forno per polimerizzazione durante la notte a 60 ° C.
- Dopo le cure membrana PDMS, trattare la superficie con plasma di ossigeno utilizzando un sistema di pulizia / attacco in plasma per 3 min a 165 mTorr e 65 sccm flusso di O 2.
- Tagliare un pezzo di membrana rettangolare (5 × 3,5 cm) dal piatto, pur essendo consapevoli che parte è l'ossigeno-trattati, assicurarsi che il lato di ossigeno trattato rivolto verso l'alto e fissare su un telaio di stretching. Posizionare il telaio su una allungamento fase e uniformemente allungare ruotando la manopola sulla scena fino a raggiungere il 10% di allungamento (o qualche altro tratto predeterminato, l'allungamento può essere letta direttamente dalla fase stretching) in asse maggiore 9. Fissare il tratto serrando le viti sul telaio.
- Rimuovere il telaio dal palco. Assicurarsi che la superficie della membrana è asciutto e privo di polvere, quindi posizionare una camera di silicone sulla membrana che permette la parte adesiva della camera per fissare saldamente alla membrana.
Nota: La camera di silicone fornisce un pozzo per trattenere il mezzo cellulare sulla membrana PDMS. Il design del dispositivo è mostrato in Figura 1. - Sterilizzare la superficie con UV per 10 min.
- Aggiungere 1 ml Poly-L-lisina (PLL) (0,01% in tampone fosfato isotonico) alla superficie PDMS all'interno della camera, entro 6 ore di trattamento al plasma e incubare per 2 ore a 37 ° C prima della semina neuroni DRG. Questo migliora l'adesione cellulare.
- Preparare terreno di coltura standard per i neuroni DRG.
- Prima l'isolamento, l'apparecchiatura autoclave isolamento e reagenti filtranti. Aggiungere 5 ml di tampone isolamento in un pozzetto di un 6-pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio. Preparare 10 ml di terreno di dissociazione aggiungendo 1 ml di collagenasi A (500 U / ml) in 9 ml di 0,05% tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtrare le soluzioni con un filtro da 0,22 um e posto sul ghiaccio.
- Utilizzare dieci a dodici 5 - 7 ratti Sprague-Dawley giorni 'per l'isolamento. Spruzzare i cuccioli con il 75% di isopropanolo, e il sacrificio per decapitazione.
- Tagliare via la pelle sovrastante il midollo spinale dal retro e rimuovere il tessuto in eccesso intorno alla spina dorsale. Sotto una lente di ingrandimento chirurgica con i faretti chirurgici su, fare la prima incisione dal collo e poi un taglio lungo la colonna vertebrale su entrambi i lati con le forbici. Rimuovere il rachide dal corpo dei cuccioli e rimuovere i muscoli eccesso. Quindi, usare le forbici per tagliare lungo la long asse della colonna vertebrale e di uso delle pinzette per aprire la colonna vertebrale completamente ed estrarre il midollo cord.Remove la punta da una pipetta per creare una maggiore apertura per il trasferimento dei DRG con tampone di isolamento in una provetta sterile 15 ml.
- Usando un bel paio di pinzette, rimuovere il ganglio dalla tasca ossea e raccogliere circa 10 - 16 DRG da entrambi i lati. Tagliare le radici nervose e trasferire gangli al buffer isolamento ghiacciato.
- Rimuovere la punta da una pipetta per creare una maggiore apertura per il trasferimento dei DRG con tampone di isolamento in una provetta sterile 15 ml. Dopo la dissociazione chimica, centrifugare i gangli a 900 xg e 4 ° C per 5 min.
- Lasciate che i tessuti si depositano sul fondo della provetta e rimuovere delicatamente il buffer di isolamento sulla parte superiore e aggiungere 10 ml di terreno di dissociazione nel tubo.
- Incubare i tessuti sezionati nel mezzo di dissociazione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 1 ora agitando il tubo ogni 5 - 10 min.
- Dopola dissociazione chimica, centrifugare i gangli a 900 xg e 4 ° C per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreni di crescita standard e vortice.
- Centrifugare le cellule dissociate come indicato nel paragrafo 2.9, ancora una volta.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 12 ml di mezzi di crescita standard e vortice.
3. Cultura di DRG sulla superficie Pre-allungato
- Prima di semina delle cellule, rimuovere le soluzioni PLL dalla camera e risciacquare la superficie PDMS con acqua sterile e asciugare all'aria.
- Dopo ri-sospensione le cellule, lasciare che il set sospensione per 1 - 2 min per permettere i detriti di depositarsi sul fondo della provetta. Aggiungere 1,5 ml di sospensione cellulare in ciascuna camera elasticizzato e incubare a 37 ° C in 5% CO 2.
- Per eliminare le cellule gliali, a 1 giorno di vitro (DIV), aggiungere 10 ml (o 15 ml) miscela di fluoro-2-deossi uridina e uridina (FDU-U) stock solutisu (Vedi Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto. Dopo 7 ore, sostituire questo mezzo con mezzo di crescita standard di fresco e posizionare il dispositivo di pre-stirato cultura in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Durante il periodo di coltura cellulare (2 - 3 settimane), cambiare i media ogni due giorni, sostituendo la metà del mezzo trascorso con terreno fresco. Nota: Dopo coltura sulle superfici tese e non deformato per 2 settimane, SC purificati vengono aggiunti alla camera e coltivate per un'altra settimana (passo 4.7).
4. La co-coltura di cellule di Schwann (SCS) con DRG neuroni sulla superficie Pre-allungato
- Isolare SC come descritto dal gruppo del Dr. Campana in precedenza 15.
- In breve, isolare la SC da un 1 giorno di età cucciolo. Raccogliere e dissociare i nervi sciatico sia chimicamente (tripsina-EDTA e Collagenasi A) e meccanicamente (18 gauge / siringa da 10 ml) 15.
- Seme le cellule dissociate in poli-D-lisina (PDL) copallone ated T25 e la cultura a 37 ° C al 5% di CO 2. Il giorno 5, purificare le cellule attraverso la selezione di anticorpi con Anti-thy 1.1 anticorpi e complemento di coniglio e sottocultura le cellule purificate al passaggio 2 - 4. mezzo di Utilizzo di coltura contenente Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 10% di siero fetale bovino (FBS) , 1% penicillina / streptomicina (Penn / Strep), 21 mg / ml Bovine Pituitary Extract (BPE), e 4 micron Forskolin.
- Rimuovere il terreno di coltura dalla SC, e aggiungere 5 ml 0,05% tripsina-EDTA nel pallone. Incubare le cellule a 37 ° C al 5% di CO 2 per 2 - 3 min.
- Controllare cellule sotto il microscopio ottico utilizzando un obiettivo 10X per vedere se essi sollevano dal pallone, quindi aggiungere 5 ml di terreno di coltura e mescolare con le cellule nel pallone.
- Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 xg e 20 ° C per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 7 ml di DRG serie med crescitaia.
- Prendere 10 ml di sospensione cellulare in una provetta da 0,5 ml, mescolare con 10 ml di trypan blu, e poi contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro al microscopio ottico con un obiettivo 10X. Diluire la sospensione cellulare a 5.000 cellule per ml aggiungendo terreni di crescita DRG.
- Rimuovere 0,5 ml di terreno dalla coltura DRG nella camera allungata e aggiungere 0,5 ml di sospensione SC alla cultura DRG.
- Coltivare le cellule per 1 settimana a 37 ° C e 5% di CO 2. Modificare i media ogni due giorni, sostituendo la metà del mezzo trascorso con terreno di coltura standard di fresco per DRG. Dopo 1 settimana co-coltura, le cellule processo di immunoistochimica 10.
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Representative Results
Il sistema di coltura pre-stirato cellule promosso DRG allineamento assone 10. neuroni DRG sono stati coltivati su superfici pre-stirato e non deformato per 12 giorni. Gli assoni sono state colorate per β-III-tubulina per dimostrare la loro allineamento. La figura 2 confronta orientamento assone sulle PDMS pre-stirato e non deformato substrati dopo 12 giorni di coltura. Gli assoni DRG allineati parallelamente alla direzione allungata, che hanno mostrato allineamento casuale e formano una rete interconnessa sul substrato PDMS non deformato.
Oltre a indurre l'allineamento degli assoni, anisotropia pre-stiro indotto migliorato la fascicolazione degli assoni. Gli assoni allineati sui fasci assonale superficie allungata formata, che differivano dalla rete assonale collegato osservati sulla superficie non deformato. Questi bundle fascicolari sulla superficie prestirato assomigliavano nervoso tr tessutoagisce in vivo. La figura 3 mostra gli assoni dei neuroni DRG su superfici pre-stirato e non deformato dopo 21 giorni di coltura. Come mostra la Figura 3 illustra, gli assoni sul substrato prestirato aggregate insieme per formare fasci, che sembravano simili a tratti fascicolari. Questo suggerisce la superficie pre-stirato era in grado di promuovere la crescita estensiva dell'assone in direzione del pre-stiramento, che sono importanti nel migliorare la rigenerazione del tessuto nervoso.
Per valutare mielinizzazione, SC sono stati co-coltura con gli assoni allineati. Dopo coltura neuroni DRG sulle superfici tese e non deformato per 2 settimane, SC purificati sono stati aggiunti alla camera e coltivate per un'altra settimana. Nella Figura 4, gli assoni del co-coltura sono colorate con β-III-tubulina (verde), e SCS sono macchiati di P0 (rosso). P0 è un marker di maturo SC ed è anche un componente della guaina mielinica,come pure considerata un indicatore di myelination. Vi è significativo co-localizzazione di verde e rosso sulla superficie pre-stirato, suggestivo di SC inerenti alle assoni sulla superficie allungata, ma non sulla superficie non deformato in cui le macchie di verde e rosso sono distribuiti in modo casuale. Le superfici pre-stirato migliorata allineamento assone, la formazione del tratto fascicular-like, e l'attaccamento della SCS ai assoni rigenerati, tutti critici per la mielinizzazione.
Figura 1:. Schema per la procedura di pre-stretch (a) Un pezzo di membrana PDMS è ritagliato su due strisce di cornice che sono scorrevoli. La struttura del dispositivo è di circa 7 "x 5"; le parentesi graffe sono circa 5 "x 1; i morsetti sulle parentesi graffe sono circa 3" x 25 ", e la coppa è di circa 1,5" di diametro superiore spalancata, 1 "fondo aperto, e circa 0,25 & #34; alto. (B) Posizionare il telaio sul palco stretching, ruotare il rullo per applicare 10% di allungamento, e quindi fissare le posizioni delle strisce serrando le viti. (C) Rimuovere il telaio dalla fase di stretching, e allegare una camera di silicio sulla membrana. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Axon allineamento sulla superficie pre-allungato e non deformato immagini fluorescenti di neuroni DRG seminate sulla (a) superficie di pre-stirato statico per 12 giorni, rispetto alle cellule DRG seminate sulla (b) superficie non deformato per 12 giorni.. Gli assoni allineati nella direzione pre-stirato, mentre gli assoni allineati in modo casuale sulla superficie di controllo non deformato. Axons sono state colorate con anti-topo β-III tubulina anticorpo primario, e ripreso con microscopio confocale utilizzando un obiettivo 10X. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Axon Spessore crescita su Stretched vs. Unstretched PDMS substrato immagini a contrasto di fase di assoni DRG su (a), allungato e (b) le superfici unstretched dopo 21 giorni.. Assoni sulla superficie allungata formata fasci spessi, mentre sulla superficie unstretched assoni formano rete assonale interconnessi. Le immagini sono state scattate con microscopio a contrasto di fase inversed utilizzando un obiettivo 10X. Clicca qui per vedere alVersione Arger di questa figura.
Figura 4:. SC con Allineati DRG assoni co-coltura su Stretched vs. Unstretched PDMS Substrati Dopo coltura sulle superfici tese e non deformato per 2 settimane, SC purificati sono stati aggiunti alla camera e coltivate per un'altra settimana. (A) β-III-tubulina (verde) colorazione per assoni sulla superficie allungata; (B) Overlay di β-III-tubulina (verde), P0 (rosso) colorazione sulla superficie allungata; (C) β-III-tubulina (verde) colorazione per assoni sulla superficie non stirato; (D) Sovrapposizione del β-III-tubulina (verde), P0 (rosso) colorazione sulla superficie non deformato. Sulla superficie pre-stirato, le macchie rosse e verdi colocalize, suggerendo SCS sono attaccati da e probabilmente mielinizzanti gli assoni. Sulla unstretcheddi superficie, le macchie rosse e verdi sono distribuiti in modo casuale, suggerendo SCS non sono attaccati ai assoni. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per indurre l'allineamento assone sulla superficie pre-stirato, ci sono due passaggi critici: 1) la membrana PDMS deve essere piana e di spessore omogeneo; e 2) cellule gliali devono essere rimossi dal DRG. Dopo la miscelazione il PDMS e reticolante e cottura in forno, il gel PDMS reticolato dovrebbe essere mantenuto su un banco piana e maneggiato con cura per evitare qualsiasi inclinazione. Il trattamento al plasma di ossigeno della membrana PDMS dovrebbe essere seguita entro 6 ore mediante rivestimento PLL, poiché l'idrofilia della superficie (necessario per l'adesione delle cellule) dopo il trattamento al plasma attenua nel tempo. Poiché il trattamento al plasma viene applicata ad un lato della membrana, bisogna fare attenzione dopo peeling PDMS fuori del piatto per assicurare il lato corretto è posto sul telaio, cioè, la superficie plasma trattato deve essere rivolto verso l'alto per le celle a allegare a.
I DRG si trovano all'interno delle tasche di osso che si allineano lungo la colonna vertebrale. Poiché il colore della vertebra è biancacuccioli, è difficile distinguere i DRG dalla vertebra. In questo caso, è importante posizionare la colonna vertebrale vicino alla luce del punto. Sotto la luce, i DRG girare trasparente mentre l'osso rimane bianco e opaco. È importante mantenere il buffer dissezione su ghiaccio e ad un pH fisiologico, poiché il pH influenza la vitalità delle cellule neurali. I tessuti isolati sono molto viscoso e tendono ad attaccarsi alla punta della pipetta durante il trasferimento in una provetta da centrifuga. Così tagliare la punta della pipetta per generare una maggiore apertura facilita il trasferimento.
In alcuni protocolli, vi è ancora una fase di centrifugazione desiderato con i tessuti isolati prima di aggiungere il buffer di dissociazione. In luogo di questa fase, il protocollo richiede i tessuti a stabilirsi nel buffer dissezione per un paio di minuti, che riduce la fase di centrifugazione supplementare che altrimenti avrebbe un impatto la vitalità e la densità delle cellule. La densità cellulare è anche dipendenteil numero di cuccioli sacrificati, e quindi è importante mantenere un consistente numero di cuccioli ogni volta. Ci sono anche le cellule gliali che sono isolate insieme ai neuroni DRG, quindi un inibitore mitotico, FDU-U, viene aggiunto al mezzo di coltura a 1 DIV di sopprimere la crescita delle cellule gliali. Questo è comunemente usata per inibire le cellule gliali durante la prima fase della crescita dei neuroni, sebbene alcuni protocolli preferiscono una combinazione di arabinofuranosylcytidine (AraC) e FDU-U. La concentrazione molare di FDU-U aggiunto alla coltura varia nei diversi protocolli, a seconda della densità delle cellule isolate. Abbiamo trovato l'inibitore mitotico può essere aggiunto più volte (alla concentrazione specificato al punto 3.3), a seconda delle necessità (se le cellule gliali sono presenti), durante l'intera cultura DRG. Non è generalmente raccomandato di aggiungere una grande quantità (più di 15 ml) in un dato momento in quanto ha un impatto l'attaccamento dei neuroni DRG.
Il trattamento al plasma migliora surface idrofilia e il rivestimento PLL fornisce una superficie carica per gli assoni di avviare attaccamento. Secondo riferimenti in letteratura, l'idrofilicità indotta trattamento al plasma attenuerà nel tempo, in condizioni asciutte 16-17. Tuttavia PDMS subirà una reazione lenta con acqua in condizioni di liquidi e cambierà gradualmente dall'essere idrofobica a idrofilica 18. Pertanto anche se il trattamento al plasma attenua nel tempo, non dovrebbe influenzare i nostri risultati. Per il rivestimento PLL, secondo le informazioni prodotto dal fornitore, è stabile per anni se posti in condizioni favorevoli. Una volta che le cellule si attaccano sul rivestimento PLL, in genere non si staccano. Inoltre, il rivestimento PLL aiuta con l'attacco iniziale, e come le cellule crescono secernono matrice extracellulare (ECM) proteine che ulteriormente li aiutano a rimanere ancorata alla superficie 19. miglioramenti del design futuri potrebbero includere imbedding peptidi nel PDrete MS durante la reticolazione, che eliminerebbe il trattamento al plasma e gradini rivestimento PLL.
Il protocollo, qui, ha descritto un approccio ingegneristico che ha generato anisotropia superficie di indurre con successo l'allineamento degli assoni, la crescita e la mielinizzazione. L'approccio può essere sperimentalmente espanso in due modi. In primo luogo, la superficie anisotropo potrebbe essere applicato per creare tessuti nervosi in coltura, e le vie nervose in vitro potrebbe poi essere trapiantate in vivo. In secondo luogo, il concetto di anisotropia superficie potrebbe essere incorporata nella progettazione di scaffold transplantable che potrebbe essere utilizzato in vivo per migliorare l'allineamento degli assoni rigeneranti dal sito della lesione e myelination dalle SCs ospitanti. Rispetto ad altri approcci che richiedono molteplici e complicati dispositivi 20-22, così come l'aggiunta di fattori di crescita, la nostra piattaforma è relativamente semplice e facile da applicare, e si basa solo su pre-stirata per migliorare sia assone alignment e mielinizzazione senza la necessità di aggiunta fattore di crescita. Inoltre abbiamo testato questo concetto di pre-stretch nel disegno sperimentale su entrambe le cellule staminali mesenchimali e neuroni DRG che potrebbe facilmente essere applicate ad altri tipi di cellule. Il progetto attuale è stato utilizzato per studiare la crescita degli assoni su superfici 2-dimensionali, ma in futuro il dispositivo potrebbe essere aggiornato per consentire la sperimentazione di colture cellulari 3-dimenstional. Le future applicazioni di riparazione dei nervi e del trapianto potrebbero incorporare pre-stiro nelle impalcature trapiantabili realizzati con materiali naturali o sintetici biodegradabili contenenti peptidi reticolati insieme a rilascio controllato le proprietà farmacologiche.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Eric Vasco per la sua assistenza nella preparazione dei substrati PDMS, Dr. Shiyong Wang nel laboratorio del Dr. Marina Mata presso l'Università del Michigan per i suggerimenti e la formazione del isolamento DRG utile, e il dottor Mark Tuszynski e il Dr . W. Marie Campana a UC San Diego per i suggerimenti utili e di protocollo per l'isolamento SC. Questo studio è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (CBET 0.941.055 e 1.510.895 CBET), il National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866, e R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
