Introduction
В нервных травм, проксимальный и дистальный нервные пни часто предотвращается прямой перестройкой нервных пучках из - за повреждения участка 1-2. Обычно аксонов тракты состоят из упорядоченных и высоко выровненных пучков аксонов, которые образуют сложные сети связи. Тем не менее, регенерация нерва является хаотический процесс из - за плохо организованной выравнивании аксона 3-4. Таким образом, чтобы генерировать достаточное количество регенерирующей аксоны, позволяющего устранить месте повреждения, то необходимо, чтобы побудить хорошо организованной аксонов выравнивания. Кроме того, демиелинизация сопровождает повреждения нерва из-за гибели myelinating клеток в месте повреждения. Так как демиелинизация сильно ухудшает проводящую способность выдерживать аксоны, процедуры , направленные на демиелинизации или способствующие ремиелинизацию являются существенными для функционального восстановления после повреждения нерва 5. Таким образом, цель данного протокола, чтобы проиллюстрировать инженерный подход, учитывающий эти два вопросарегенерации нерва.
Поверхностная анизотропия, которая определяется как разница, при измерении вдоль различных осей, в физических или механических свойств материала , в, был применен влиять выравнивание клеток, рост и миграцию 6-7. В дополнение к топографии, существуют и другие методы, чтобы индуцирующие анизотропию. Ранее мы исследовали поверхностной анизотропии, вызванной механическим статическим предварительной протяжения поли-диметил-силоксановых (PDMS) мембраны. Теория "малой деформации супер , наложенных на большой" предсказал , что эффективная жесткость клетки чувствуют в растянутом направлении отличается от перпендикулярного направления, и эта разница в эффективной жесткости из - за поверхностной анизотропии 8. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , культивируемые на предварительно растянутой мембраны PDMS способны чувствовать анизотропию, активно вытягивать поверхность , и в результате, выравнивать в предварительно растянутой направлении 9. Аналогичным образом, поверхность ар анизотропнаяизинговских от механического предварительно растянутой поверхности влияет на выравнивание, а также роста и миелинизации спинномозговых ганглиев (DRG) аксонов 10. Здесь мы приводим протокол для индукции поверхностной анизотропии на статическом предварительно растянутой подложке PDMS для повышения аксонов регенерации 10.
Для того, чтобы вызвать выравнивание аксонов, топологические особенности с заданными узорами, сообщает предоставить контактную руководство через выровненных волокон и каналов 6,11-12, были продемонстрированы для облегчения выравнивания аксонов 11,13. Тем не менее, сообщалось методы индукции выравнивания аксонов через топологических характеристик, таких как волокна, каналы и структурирование, были неспособны удлиняться и увеличить толщину аксонов. В противоположность этому , постепенное механическое растяжение привело к выравниванию аксонов в направлении растягивания с более длинными и более толстыми аксонами , которые увеличились с величиной перегоне 14. Тем не менее, включение устройства с независимым питанием двигателя в естественных условиях не являетсяпредставляется возможным. В противоположность этому , статическое предварительно растянутой наведенной анизотропии менее сложна и может быть более легко включены в будущие конструкции каркаса для применения в естественных условиях.
В этом протоколе, статический предварительно растянутой система клеточной культуры используется для индукции поверхностной анизотропии без топологических характеристик. Предварительно растянутая система культуры состоит из мембраны PDMS, поддающегося растягиванию рамой и простирающейся стадии, после чего мембрана закреплена на раме, а заданная величина растянуть применяется на стадии вытяжки. Свежевыделенные нейроны DRG культивировали на предварительно растянутой поверхности на срок до 21 дней, отслеживаются для выравнивания и толщины аксона. Впоследствии Шванн клетки (SCS) культивировали совместно с унифицированным аксонов контролируются на миелинизации. Объединив предварительно простирания индуцированной поверхностной анизотропии мы смогли улучшить ячейки выравнивания дифференциации и аксона выравнивания роста MSCs и DRG нейронов 9-10, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для выделения клеток были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете штата Мичиган по.
1. Приготовление предварительно растянутой поверхности анизотропного
- Смешайте 10: раствор основы и отвердителя 1 и вылить смесь в блюдо культуры ткани (диаметром 12 см). С помощью 4900 мг основы и 490 мг отвердителя для общей сшивающего смеси.
- Смесь необходимо хранить гель в вакууме в течение 20 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Поместите смесь геля в печи в течение ночи отверждения при 60 ° C.
- После того, как мембраны лечений PDMS, обработать поверхность с кислородной плазмой с помощью системы очистки / плазменного травления в течение 3 мин при 165 мТорр и 65 куб.см при СТД потока O 2.
- Отрежьте кусок прямоугольной мембраны (5 × 3,5 см) от тарелки, в то же время осознавая, какая сторона представляет собой кислород обращению, убедитесь, что кислород обработанной стороной вверх и крепятся на пялец. Поместите рамку на растягивая сцену и равномерно растянуть поворотом ручки на сцене , пока не достигнет 10% удлинения (или какой - либо другой предварительно определенное растяжение, удлинение может быть непосредственно считаны из стадии вытяжки) в длинной оси 9. Закрепите растяжку, затянув винты на раме.
- Снимите раму со сцены. Убедитесь, что поверхность мембраны сухой и свободной от пыли, а затем поместить силиконовую камеру на мембрану, позволяя липкой стороне камеры, чтобы плотно прикрепить к мембране.
Примечание: силиконовая камера обеспечивает хорошо для удерживания среды клеток на мембране PDMS. Конструкция устройства показана на рисунке 1. - Стерилизовать поверхность с УФ в течение 10 мин.
- Добавить 1 мл поли-L-лизин (ФАПЧ) (0,01% в фосфатно-солевом буферном) на поверхности PDMS внутри камеры, в течение 6 ч плазменной обработки и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С перед посевом нейроны DRG. Это усиливает прикрепление клеток.
- Подготовить стандартную ростовую среду для нейронов DRG.
- До изоляции, автоклава изоляции оборудования и фильтров реагентов. Добавляют 5 мл буфера изоляции в одну лунку 6-луночного планшета, и поместите тарелку на льду. Приготовьте 10 мл среды диссоциации путем добавления 1 мл коллагеназы А (500 Ед / мл) до 9 мл 0,05% трипсин-ЭДТА (1 мг / мл), фильтрации растворов с фильтром и место 0,22 мкм на льду.
- Используйте десять-двенадцать 5 - 7 старых крыс Sprague-Dawley суток за изоляции. Спрей щенкам с 75% изопропилового спирта, и принести в жертву путем обезглавливания.
- Срежьте кожу, перекрывающую спинной мозг со спины и удалите излишки ткани вокруг позвоночника. Под хирургической лупу с хирургическими местная подсветка на, сделать первый надрез от шеи, а затем один разрез вдоль позвоночника с обеих сторон с помощью ножниц. Отделить позвоночник от тела щенкам и удалить избыток мышц. Затем, используйте ножницы, чтобы разрезать вдоль долготуг оси позвоночника и использовать пинцет, чтобы полностью открыть позвоночник и извлечь спинного cord.Remove наконечник из пипетки, чтобы создать большее отверстие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку.
- С помощью тонкой пинцет, удалите ганглий из костного кармана и собирают примерно 10 - 16 DRG с обеих сторон. Обрежьте корни нерва и передать ганглиев в ледяном буфере изоляции.
- Извлеките наконечник из пипетки, чтобы создать большее открытие для передачи ДРГ с буфером изоляции в стерильный 15 мл пробирку. После химической диссоциации, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
- Пусть ткани оседают на дно пробирки и осторожно удалите буфер изоляции на верхней и добавляют 10 мл раствора диссоциации среды в трубу.
- Инкубируйте рассеченные ткани в среде диссоциации в водяной бане C 37 ° в течение 1 ч при встряхивании трубки через каждые 5 - 10 мин.
- Послехимическая диссоциация, центрифуга ганглии при 900 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 10 мл стандартных сред и вихревыми.
- Центрифуга диссоциированных клеток, как указано в разделе 2.9 еще раз.
- Удалить супернатант, повторно приостанавливать осадок в 12 мл стандартных сред роста и вихря.
3. Культура DRG по предварительно растянутой поверхности
- Перед посевом клеток, удалить растворы ФАПЧ из камеры и промыть поверхность PDMS стерильной водой и сухой воздух.
- После повторного суспендирования клеток, пусть множество подвески в течение 1 - 2 мин, чтобы позволить мусор оседают на дно пробирки. Добавить 1,5 мл суспензии клеток в каждую натяжного камеру и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2.
- Для устранения глиальных клеток, на 1 день в пробирке (DIV), добавьте 10 мкл (или 15 мкл) смесь фтор-2-дезокси уридин и уридин (FDU-U) акций Soluti(смотрите таблицу материалов) в каждую лунку. Через 7 ч, заменить эту среду со свежей стандартной ростовой среды и поместить предварительно растянутой устройство культура в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2.
- В течение периода культивирования клеток (2 - 3 недели), изменения среды каждые два дня, заменив половину затрачиваемое среды свежей средой. Примечание: После культивирования на растянутых и растяжений поверхности в течение 2 недель, очищенный Стволовые добавляют в камеру и культивировали в течение следующей недели (этап 4.7).
4. Совместное культивирование клеток Шванн (SCS) с DRG нейронах по предварительно растянутой поверхности
- Изолировать SCs , как описано группой доктора Кампана в ранее 15.
- Если коротко, то изолировать ГКС от 1-дневного возраста детеныша. Сбор и диссоциируют седалищный нервы как химически (трипсин-ЭДТА и коллагеназы A) и механически (18 калибра иглы / 10 мл шприц) 15.
- Семя разложенных клеток в поли-D-лизина (PDL) соованные Т25 колбу и культуры при 37 ° С в 5% CO 2. На 5-й день, очищают клетки путем отбора антител с использованием анти-Thy 1.1 антител и кроличий комплемент и субкультуры очищенные клетки к прохождению 2 - 4. С помощью культуральной среды, содержащей Дульбекко модифицированную Дульбекко (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) , 1% пенициллин / стрептомицин (Пенна / Стрептококковое), 21 мкг / мл бычьего гипофизарный экстракт (BPE), и 4 мкМ форсколин.
- Удалить культуральную среду, из ГКС, и добавляют 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в колбу. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 2 - 3 мин.
- Проверьте клетки под оптическим микроскопом с использованием объектива 10х, чтобы увидеть, если они поднимают вверх из колбы, затем добавляют 5 мл культуральной среды и смешивают с клетками в колбе.
- Добавить суспензии клеток в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугируют при 200g и 20 ° С в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 7 мл стандарт DRG медианы ростаНМА.
- Взять 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужных пробирку емкостью 0,5 мл, смешивают с 10 мкл трипанового синего, а затем подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра при оптической микроскопии с использованием объектива 10х. Развести клеточной суспензии до 5000 клеток на мл путем добавления питательной среды DRG.
- Удалить 0,5 мл среды от DRG культуры в растянутом камере и добавляют 0,5 мл суспензии SC в DRG культуры.
- Культуры клеток в течение 1 недели при 37 ° С и 5% СО 2. Изменение средств массовой информации каждые два дня, заменив половину истощенной средой со свежей стандартной питательной среды для DRG. После 1 недели совместного культивирования, процесс клетки с помощью иммуногистохимии 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система предварительно растянутой культуры клеток способствует DRG выравнивание аксонов 10. DRG нейроны культивировали на предварительно растянутой и растяжений поверхности в течение 12 дней. Аксоны окрашивали для бета-III-тубулина , чтобы продемонстрировать их выравнивание. Рисунок 2 сравнивает ориентацию аксонов на подложках предварительно растянутой и Нерастянутые PDMS после 12 дней культивирования. В DRG аксоны расположены параллельно натянутым направлении, в то время как они показали случайное выравнивание и формируется взаимосвязанная сеть на нерастянутом PDMS подложке.
В дополнение к индукции выравнивания аксонов, предварительно простирания наведенная анизотропия усиливает подрагивание аксонов. Выровненные аксоны по натянутым поверхности, образованной аксонов пучки, которые отличались от подключенного к сети аксонов наблюдается на нерастянутом поверхности. Эти пучки фасцикулярные на предварительно растянутой поверхности напоминали тр нервной тканидействует в естественных условиях. Рисунок 3 показывает аксоны нейронов DRG на предварительно растянутой и растяжений поверхности после 21 дней культивирования. Как показано на рисунке 3 показано, аксоны на предварительно растянутой подложке агрегированного вместе , чтобы сформировать пучки, которые появлялись подобно пучковой трактов. Это позволило предположить, предварительно растянутый поверхность была в состоянии способствовать обширный рост аксонов в направлении предварительного натяжения, которые являются важными в повышении регенерации нервной ткани.
Для оценки миелинизации, ГКС совместно культивировали с унифицированным аксонов. После культивирования нейроны DRG по натянутым и растяжений поверхности в течение 2 недель, очищенный Стволовые были добавлены к камере и культивируют в течение другой недели. На рисунке 4, аксоны совместной культуры окрашивают бета-III-тубулина (зеленый) и ГКС окрашивают P0 (красный). P0 является маркером зрелого ГКС и является также компонентом миелиновой оболочки,а также считать показателем миелинизации. Существует значительная совместная локализация зеленого и красного на предварительно растянутой поверхности, наводит на мысль о SCs, приходящихся на аксонов на растянутой поверхности, но не на нерастянутом поверхности, где красные и зеленые пятна случайным образом распределены. Предварительно растянутая поверхности усиливается выравнивание аксонов, формирование пучковой-кишечного тракта, как и присоединение к SCs регенерированных аксонов, все критические для миелинизации.
Рисунок 1:. Схема для процедуры предварительного натяжения (а) Кусок PDMS мембраны крепится на двух полосках рамы, которые с возможностью скольжения. Рама устройства составляет приблизительно 7 "х 5"; брекеты около 5 "х 1; зажимы на фигурных около 3" х 0,25 ", и чаша составляет около 1,5" диаметр широкий открытый верх, 1 "открытую нижнюю часть, и около 0,25 & #34; высокий. (Б) Поместите рамку на стадии вытяжки, поверните ролик , чтобы применить 10% удлинения, а затем исправить положение полос путем затягивания винтов. (С) Снимите раму из стадии вытяжки и прикрепить камеру кремния на мембрану. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Аксон Выравнивание по предварительно растянутой и нерастянутая поверхности флуоресцентные изображения DRG нейроны , посеянных на (а) статического предварительно растянутой поверхности в течение 12 дней, по сравнению с DRG клеток , посеянных на (б) в нерастянутом состоянии поверхности в течение 12 дней.. Аксоны выровнены в предварительно растянутой направлении, в то время как аксоны выровнены случайным образом на нерастянутом поверхности управления. аксонs окрашивали анти-мышиных β-III тубулина первичного антитела, и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии с использованием объектива 10X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Axon Толщина Рост на растянутыми по сравнению с Unstretched PDMS Субстрат фазового контраста изображения DRG аксонов на (а) растягиваются и (б) Нерастянутые поверхности после 21 дней.. Аксоны на растянутой поверхности образуются более толстые пучки, в то время как на поверхности нерастянутой аксоны формируется взаимосвязанном сеть аксонов. Изображения были сделаны с использованием инвертирован фазового контрастного микроскопа с использованием объектива 10X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть альARGER версия этой фигуры.
Рисунок 4:. Сокультивируют SCs с Aligned DRG Аксоны в растянутом состоянии против нерастянутая PDMS Субстраты После культивирования на растянутых и растяжений поверхности в течение 2 недель, очищенный Стволовые были добавлены к камере и культивируют в течение другой недели. (А) β-III-тубулина (зеленый) для окрашивания аксонов на растянутой поверхности; (Б) Накладка бета-III-тубулина (зеленый), P0 (красный) пятна на растянутой поверхности; (С) β-III-тубулина (зеленый) для окрашивания аксонов на нерастянутом поверхности; (D) Накладка β-III-тубулина (зеленый), P0 (красный) окрашивание на нерастянутом поверхности. На предварительно растянутой поверхности, красные и зеленые пятна локализуются, предполагающие ГКС прикреплены к и, вероятно, myelinating аксоны. На нерастянутаяповерхность, красные и зеленые пятна случайным образом распределены, предполагая ГКС не привязаны к аксонов. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того, чтобы побудить аксонов выравнивание по предварительно растянутой поверхности, есть два важных шага: 1) мембрана PDMS должна быть ровной и гомогенной толщины; и 2) глиальные клетки должны быть удалены из DRG. После смешивания PDMS и сшивателя и отверждения в печи, сшитый гель PDMS должны храниться на ровной поверхности стола и осторожно, чтобы избежать перекоса. Лечение кислородной плазмой мембраны PDMS необходимо следовать в течение 6 часов с помощью ФАПЧ покрытия, так как гидрофильность поверхности (требуется для прикрепления клеток) после плазменной обработки затухает с течением времени. Так как плазменная обработка применяется к одной стороне мембраны, необходимо позаботиться после отклеивания PDMS от тарелки, чтобы обеспечить правильную сторону размещается на раме, то есть, обработанная плазма поверхность должна быть обращена вверх для клеток прикрепить к.
В DRGs расположены внутри костных карманов, которые выравнивают вдоль позвоночника. Поскольку цвет позвонка имеет белыймолодых щенков, трудно отличить ДРГ от позвонка. В этом случае важно, чтобы поместить позвоночник близко к пятно света. Под светом, DRGs станут прозрачными, а кости остается белым и непрозрачным. Важно, чтобы поддерживать буфер рассечение на льду и при физиологическом рН, так как рН влияет на жизнеспособность нервных клеток. Выделенные ткани очень вязкими и имеют тенденцию прилипать к кончика пипетки при переносе в центрифужную пробирку. Таким образом, сокращая самый кончик пипетки, чтобы произвести большее отверстие облегчает передачу.
В некоторых протоколах, есть еще один шаг центрифугирования требуется с изолированными тканей перед добавлением буфера диссоциации. Вместо этого шага, наш протокол требует ткани осесть в буфере рассечение в течение нескольких минут, что уменьшает дополнительный шаг центрифугирования, что в противном случае будет влиять на жизнеспособность и плотность клеток. Плотность клеток также зависитот количества щенков в жертву, и, таким образом, имеет важное значение для поддержания постоянного числа мышат каждый раз. Есть также глиальные клетки, которые изолированы вместе с нейронами DRG, таким ингибитором митоза, FDU-U, добавляют к культуральной среде при 1 Div, чтобы подавлять рост клеток глии. Это обычно используется для подавления глиальных клеток в ранний период роста нейронов, хотя некоторые протоколы предпочитают сочетание arabinofuranosylcytidine (AraC) и FDU-U. Молярная концентрация FDU-U добавляли к культуре варьируется в различных протоколах, в зависимости от плотности выделенных клеток. Мы обнаружили, что ингибитор митотической можно добавить несколько раз (в концентрации, указанной в пункте 3.3), в случае необходимости (если глиальные клетки присутствуют), в течение всей DRG культуры. Это, как правило, не рекомендуется добавлять большое количество (более 15 мкл) в любой момент времени, так как она влияет на прикрепление нейронов DRG.
Плазменная обработка повышает Surfacе гидрофильность и покрытие ФАПЧ обеспечивает заряженную поверхность для аксоны инициировать вложение. Согласно ссылки в литературе, плазменная обработка индуцированной гидрофильности гаснуть в течение долгого времени, в сухих условиях 16-17. Однако PDMS будет проходить медленную реакцию с водой в жидком условиях и будет постепенно меняться от того , гидрофобный гидрофильного 18. Поэтому, даже несмотря на то, плазменную обработку затухает в течение долгого времени, это не должно повлиять на наши результаты. Для покрытия ФАПЧ, в соответствии с информацией о продукте от поставщика, он стабилен в течение многих лет, если их поместить в благоприятных условиях. После того, как клетки прикрепить на покрытие ФАПЧ, они, как правило, не отделится. Кроме того, покрытие ФАПЧ помогает с начальным приложением, а также клетки растут они секретируют внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки , которые в дальнейшем помогают им оставаться прикреплены к поверхности 19. Будущие усовершенствования конструкции могут включать в себя пептиды вложении в PDсеть MS во время сшивания, которая позволит устранить плазменную обработку и шаги для покрытия ФАПЧ.
Протокол, здесь описан инженерный подход, который сгенерировал поверхностной анизотропии успешно вызвать выравнивание аксонов, рост и миелинизации. Такой подход может быть экспериментально расширен двумя способами. Во- первых, анизотропная поверхность может быть применен для создания нервных тканей в культуре, и в пробирке нервные пути могут быть затем пересаживают в естественных условиях. Во- вторых, понятие поверхностной анизотропии может быть включена в конструкцию перевиваемых подмостей , которые можно было бы использовать в естественных условиях для повышения выравнивания регенерирующих аксонов от места повреждения и миелинизации от принимающих ГКС. По сравнению с другими подходами , которые требуют многократных и сложных устройств 20-22, а также добавление факторов роста, наша платформа является относительно простым и легким в применении, и опирается только на предварительно протяжения , чтобы увеличить и аксон алиgnment и миелинизации без необходимости фактора роста дополнение. Кроме того, мы протестировали эту концепцию предварительного натяжения в экспериментальной конструкции на обоих ПКЦ и DRG нейроны, которые могут быть легко применены к другим типам клеток. Текущий дизайн был использован для исследования роста аксона на 2-мерных поверхностях, однако в будущем устройство может быть повышен для того, чтобы испытывать 3-dimenstional клеточных культур. Будущие приложения по ремонту и трансплантации нерва может включать предварительное растяжение в перевиваемых каркасах из биоразлагаемых природных или синтетических материалов, содержащих сшитые пептиды, наряду со свойствами лекарственных средств с контролируемым высвобождением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эрика Vasco за его помощь в подготовке субстратов PDMS, д-р Ван Shiyong в лаборатории доктора Марины Маты в Университете штата Мичиган за полезные советы и обучение изоляции DRG, и д-р Марк Tuszynski и д-р . В. Мари Кампана Калифорнийского университета в Сан-Диего за полезные предложения и протокол для изоляции SC. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом (конбетить 0941055 и конбетить 1510895), Национальный институт здравоохранения (R21CA176854, R01GM089866 и R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
