Introduction
Øjeblikket placere enkelte celler individuelt i en kultur rum opnås almindeligvis ved hjælp af begrænsende fortynding eller fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). For mange laboratorier, begrænsende fortynding er en bekvem metode, da den kun kræver en pipette og vævskulturplader, som er let tilgængelige. I dette tilfælde bliver en cellesuspension seriefortyndes til en passende celledensitet, og derefter anbragt i dyrkningsbrønde ved anvendelse af en manuel pipette. Disse rumopdelte enkeltceller anvendes derefter til celleanalyse, såsom genetisk heterogenitet screening 1 og kolonidannelse 2. Men denne metode er lavt gennemløb og arbejdskrævende, uden anvendelse af en robotarm for assistance, fordi Poissonfordelingen karakter af begrænsende fortyndingsmetode begrænser encellede begivenheder til en maksimal sandsynlighed på 37% 3. FACS maskiner med integreret robotarm kan overvinde begrænsningen af Poisson-fordeling ved nøjagtigt placing et enkeltdosis celle i en kultur brønd på et tidspunkt 4. Det høje mekaniske forskydningsspændingen (således sænket cellelevedygtighed) 5 og maskine køb og driftsomkostninger har begrænset dens anvendelse i mange laboratorier.
For at overvinde de ovennævnte begrænsninger, er mikroskala anordninger blevet udviklet til højt effektivt indlæse enkeltceller i mikrobrønde 6. Men mikrobrøndene ikke giver tilstrækkelig plads til de fyldte celler til at proliferere, som følge af behovet for at gøre størrelsen af hver mikrobrønd tæt på den for en enkelt celle for at maksimere enkeltcelle-loading sandsynlighed. Som kultur assays er påkrævet i mange cellebaserede applikationer (f.eks klongenicitetsassayet 7), større mikrobrønde (fra 90 - 650 um i diameter eller i sidelængde) er også blevet anvendt til at muliggøre længere cellekulturer. Men ligesom den begrænsende fortyndingsmetode, de har også en lav encellede belastningseffektiviteter, i området fra 10 -. 30% 8, 9
Tidligere har vi udviklet et high-throughput mikrofluid platform at isolere enkelte celler i individuelle mikrobrønde og demonstrere dens anvendelse i klongenicitetsassayet af de isolerede celler. 10. Anordningen blev fremstillet med poly-dimethylsiloxan (PDMS) og omfatter to sæt af mikrobrønde arrays med forskellige mikrobrønde størrelser, som i vid udstrækning kan forbedre effektiviteten i indlæsning af en enkelt celle i en mikrobrønd hvis størrelse er betydeligt større end cellen. Især denne "dual-brønd" konceptet mulighed størrelsen af kulturen område justeres fleksibelt uden at påvirke den encellede capture effektivitet, hvilket gør det nemt at justere anordningens konstruktion, der passer til forskellige celletyper og anvendelser. Denne højeffektiv metode bør være nyttige for langsigtede cellekultur forsøg til celle heterogenitet undersøgelser og monoklonal cellelinje etablering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: De fotomaske design for vores mikrofluidanordning fremstilling blev trukket ved anvendelse af en computer aided design (CAD) software. De designs blev derefter brugt til at fabrikere krom fotomasker ved hjælp af en kommerciel tjeneste. PDMS indretninger blev fremstillet ved anvendelse af bløde litografiteknikker. 11
1. Fremstilling af Master forme af litografi
- Før fotolitografi proces 12 Brug 4-inch siliciumskiver som et substrat og dehydrere skiverne i en konventionel ovn ved 120 ° C i 10 minutter.
- Rengør dehydrerede siliciumskiver ved hjælp oxygen plasmabehandling ved 100 watt i 30 sekunder i et plasma renere.
- Forvarm to kogeplader ved 65 ° C og 95 ° C, henholdsvis for følgende bageprocessen.
- Coat 5 g negativ fotoresist (PR) på de rensede siliciumskiver ved et spin coater; centrifugering ved 1.200 rpm (SU-8 50) i 30 sekunder for at fremstille mikrokanalplade lag.
- Placer PRbelagt wafer på en forvarmet varmeplade ved 65 ° C i 12 min og overføre den til en anden forvarmet varmeplade ved 95 ° C i 33 min (til 100 um tykke mønstre) til at udføre en blød bage proces.
- Efter bagningen placere PR belagt silicium wafer på indehaveren af en halvautomatisk maske aligner og tilpasse den til en 25.400 dpi gennemsigtighed fotomaske.
- Udsætte PR belagt silicium wafer for UV-lys (365 nm) i en dosis på 500 mJ / cm2 for at skabe PR mønster på siliciumskiven.
- Fjern wafer fra aligner og placere den på en kogeplade for post-bagning ved 95 ° C i 12 min.
- Soak waferne i SU-8 udvikler (propylenglycolmonomethylether acetat, PGMEA) opløsning til at vaske tværbundet PR i 12 minutter og forsigtigt tør med nitrogengas for at blotlægge justeringsmærkerne.
- Igen, belægge 5 g negativ fotoresist på waferne ved et spin coater; centrifugering ved 700 rpm (SU-8 100) i 30 sekunder og 1.200 rpm (SU-8 10) i 30 sekunder ved 300 &# 181; m tyk mønster og 27 um tyk mønster henholdsvis at gøre mikrobrønd lag.
- Placer PR coated wafer på en varmeplade ved 65 ° C i 4 minutter og ved 95 ° C i 8 minutter (for 27 um dyb capture-brønd lag); og ved 65 ° C i 40 minutter og ved 95 ° C i 110 min (for 300 um dyb kultur-brønd lag).
- Efter afkøling placere PR belagt silicium wafer på masken aligner udstyret med UV-lys.
- Udsætte PR overtrukket siliciumskive til UV-lys (365 nm) i en dosis på 250 mJ / cm2 (for 27 um tyk mønster) og 700 mJ / cm2 (for 300 um tyk mønster).
- Bag waferne ved 95 ° C i 5 min (27 um tyk mønster) og 30 minutter (300 um tyk mønster), hhv.
- Vaske tværbundet PR ved PGMEA i 6 minutter (27 um tyk mønster) og 25 min (300 um tyk mønster), henholdsvis og derefter tørre dem med nitrogengas.
- Mål højden af mønsteret funktioner påskiven med en scanning laser profilometer ved at placere skiven på xy-fase af en scanning laser profilometer.
- Juster brændplanet til klart at vise mønsteret funktioner på wafer ved at bruge "camera view" observation tilstand under en 20X objektiv.
- Skift observation mode fra "kamera view" til "laser view", og indstille de øvre og nedre positioner af funktioner.
- Indstil måling tilstand, område, kvalitet, og z-banen til transparent (øverst), en linje (1024 x 1), høj nøjagtighed og 0,5 um, henholdsvis, og tryk start bund for at starte målingen.
2. Udarbejdelse af PDMS enheder for Single-celle Isolation
- Før PDMS støbning, silanize master forme med trichlorsilan at skabe en hydrofob overflade, hvilket gør det nemmere at skrælle PDMS replikaer fra master forme.
- Placer master forme og en vægtning båd indeholder200 pi trichlorsilan i en ekssikkator og anvende vakuum (-85 kPa) i 15 min.
- Stop vakuum og derefter forlade master forme i ekssikkatoren at silanize master forme ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Fjern master forme fra ekssikkator og placere hver mester mug i en 10 cm petriskål.
- Bland en total mængde på 17,6 g PDMS polymer kit indeholdende en base og et hærdningsmiddel i et forhold på 10: 1, og hæld derefter PDMS på master skimmel i petriskålen.
- Placer petriskålen i en ekssikkator og anvende vakuum (-85 kPa) i 1 time for at fjerne luftbobler i PDMS.
- Fjern petriskålen fra ekssikkatoren og læg den i en konventionel ovn ved 65 ° C til stillingen 3 - 6 timer at helbrede PDMS.
- Fjern den hærdede PDMS replikaer fra master forme og punch to huller som et indløb og et udløb ved de to ender af mikrokanalplade om indfangning brønde matrix PDMS replika af en Hullemaskine med indvendig diameter på 0.75 mm for fluidik kanal (figur 2A).
- Brug tape til at rengøre overfladen af PDMS replikaer, og derefter placere den PDMS reproduktioner i et plasma renere for korte ilt plasma behandling (100 watt for 14 sek).
- Fjern PDMS replikaer fra oxygen plasma maskine.
- Juster en top (indeholdende capture mikrobrønde) og en bund PDMS (indeholdende kultur mikrobrønde) replica med hånden under et stereomikroskop og bringe dem i kontakt.
- Placer aligned PDMS replikaer i en ovn ved 65 ° C i 24 timer for at opnå permanent binding mellem PDMS replikaer at danne den endelige indretning.
- Soak PDMS enheden i en deioniseret (DI) -vand fyldte beholder og placere beholderen i en ekssikkator under vakuum (-85 kPa) i 15 minutter for at fjerne luft fra mikrokanalplade af PDMS-enheden.
- Placer DI vandfyldte PDMS enhed i en vævskultur hætte og bruge UV-lys (bølgelængde af lys: 254 nm) for at sterilisere af indretningen til 30 min.
- Erstat DI vand i PDMS enhed med en 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-opløsning og inkuber ved 37 ° C i 30 min for at forhindre celler i at klæbe til PDMS overflade.
Bemærk: BSA belægning er afgørende for at forbedre overførslen effektiviteten af isolerede celler fra capture-godt til kultur-godt. - Erstatte 5% BSA-opløsning i PDMS enhed med steriliseret 1x PBS-opløsning.
3. Fremstilling af encellede Suspension
- Kultur neural stamcelle KT98 og human carcinomacellelinie A549 og MDA-MB-435 vi i petriskålen på konventionel cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, og 95% fugtighed) til fremstilling af celler til PDMS enhed celle eksperiment .
- Fjern og kassér brugte dyrkningsmedium (DMEM basalt medium leveres med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika) fra dyrkningsskålen med celler dyrket til 70 - med 80% konfluens.
- Forsigtigt vaske cellerne med steriliserede PBS tre gange. </ Li>
- Fjern og kassér PBS, og der tilsættes 2 ml af en rekombinant enzym blanding med proteolytiske, collagenolytiske og DNase aktiviteter (se venligst Materialer List for detaljeret information).
- Inkubér kulturen skålen ved stuetemperatur i 5 min, og derefter trykke på kultur parabol for at lette celle løsrivelse.
- Tilsæt 4 ml steriliseret PBS for at dispergere cellerne, og derefter overføre cellesuspensionen til en 15 ml konisk rør.
- Centrifugeres røret ved 300 xg i 3 min og fjern supernatanten.
- Forsigtigt resuspender cellepelleten i 1 ml steriliseret PBS og tælle levende celle nummer ved hjælp af standard Trypan Blå udelukkelse metode 13.
Bemærk: Denne resuspension trin er kritisk til fremstilling af godt dissocierede enkelt-cellesuspension for at forbedre single-celleisolering effektivitet.
4. Single-celle Isolering og Klonal Kultur
- Load 50 pi cellesuspension ved en koncentration på 2,2 - 2.5 x10
- Indlæse yderligere 50 pi cellesuspension gennem indløbet hul til jævnt fylde hele mikrokanalplade med celler.
- Forsegl hullet af stikkontakten med et stik (en 3 mm lang, 1 mm i diameter skåret nylon fiskesnøre) for at undgå flow induceret af hydrostatisk tryk fra dråberne på indløbs- og ud- huller.
Bemærk: Propperne blev UV steriliseret i en vævskultur hætte før anvendelse. - Fyld en 1 ml steril sprøjte med dyrkningsmedium, skubbe luftbobler fra det, og sæt den op på en sprøjte pumpe.
- Tilslut medium indlæst sprøjten til indløbshullet af PDMS enhed via en 23 G stump nål og en poly-tetrafluoroethene (PTFE) rør.
- Fjern stikket fra stikkontakten hul og alleow en 2-min tidsinterval for at tillade cellerne at bosætte sig i de encellede capture-brønde med tyngdekraften.
- Vaske væk uopfangede celler med 300 pi kulturmedium ved en strømningshastighed på 600 gl / minut drevet af sprøjtepumpen.
- Vent 2 minutter for at stabilisere enheden, og forsegle indløbs- og ud- huller med stik til at danne et lukket kultur-system.
- Flip enheden med hånden for at overføre tilfangetagne single-celler til kulturen mikrobrøndene.
- Placer PDMS-enheden i en 100 mm vævskulturskål, og der tilsættes 10 ml steriliseret PBS omkring enheden for at undgå dyrkningsmedium fordampning fra mikrokanalplade.
- Flyt dyrkningsskålen til en konventionel cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, og 95% fugtighed) i klonal kultur af de enkelte celler.
5. Kultur Medium Genopfyldning
- Efter 1 d af kultur, erstatte dyrkningsmediet i PDMS enhed med frisk medium for at forbedre celle proliferation.
- Placer to dråber af dyrkningsmedium oven på PDMS enheden tæt indløbs- og outlet huller områder for at undgå at indføre luftbobler i mikrokanalplade mens de udfører det næste skridt.
- Punch to huller fra toppen af PDMS enheden nær de to ender af mikrokanalplade som et indløb og et udløb for mikrokanal.
Bemærk: Du må ikke slå igennem hele to lag af PDMS enhed; stedet, blot slå igennem det øverste lag af PDMS. - Tilslut en 1 ml plastik sprøjte indeholdende frisk medium til fjorden via en 23 G stump nål og PTFE slange.
- Flow 120 pi frisk medium i indretningen i 5 min for at erstatte det gamle medium.
- Sæt to stik til at forsegle indløb og udløb huller, og returnere enheden til cellekultur inkubator.
- Genopfriske dyrkningsmediet hver 2 d løbet af kulturen ved at fjerne lukkepropperne, efterfulgt af at gentage trin 5.4 til 5,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofluid platform for enkelt-celleisolering og kultur omfatter en mikrokanal (200 um i højde) med to sæt mikrobrøndsplader arrays (figur 2A). De to sæt mikrobrønde arrays betegnes som capture-brønd (25 um i diameter og 27 um i dybden) og kultur-brønd (285 um i diameter og 300 um i dybden) til enkelt-celle isolation og kultur, henholdsvis, og hver capture-brønd er placeret i midten af en kultur-brønd set fra top-view (figur 2B). For enhedens funktion (den skematiske drift flow er illustreret i figur 1), det nødvendige udstyr (sprøjtepumpe, vævsdyrkningsinkubator, og mikroskoper) og materiel (sprøjte, pipette, og slanger) er almindeligt tilgængelige i biologiske laboratorier. Desuden portabilitet og gennemsigtighed af platformen tillod cellerne at være let observeres og analyseres i en enhed med en overenskomstnale mikroskop under cellekulturen eksperimentet.
Tilfangetagelsen effektivitet af celler i capture-brønde efter vasketrinnet varierer fra 67,80 ± 11,38% til 85,16 ± 1,91% (afhængigt af celletype) (figur 3A). Desuden er de fleste af de capture-brønde kun indeholde en enkelt celle for alle tre celletyper (89,89% - 92,98%), hvilket er bekræftet ved at analysere antallet af indlæste celler i kulturen-brønde (figur 3B). Den endelige encellede isolation effektivitet i kulturen-brønde var mere end 76% for KT98 og MDA-MB-435-celler, men kun 61% for A549 celler på grund af cellestørrelse forskelle blandt de testede celletyper.
For kræftforskning, kan klonogen assay af enkelt-celler anvendes til at teste lægemiddelresistens og spredning satser for de enkelte celle kolonier. Cellekulturen og klongenicitetsassayet af de isolerede single-celler i vores platform blev udført ved at opdatere dyrkningsmediet hver 2 d. Denne demonstration fremhæver anvendeligheden af denne indretning til at studere cellulære heterogenitet på enkelt celle niveau ved at måle forskellene i celleoverlevelse og proliferation satser af individuelle celler.
Den cellulære heterogenitet og proliferationshastighed af de isolerede celler blev analyseret fra daglig anskaffede billeder. Resultaterne viste, at de isolerede enkeltceller kunne dyrkes i 7 dage og udviste forskellige vækstmønstre. For eksempel 13% af de isolerede celler havde ingen celledeling og forblev som en enkelt celle (figur 4B), medens 17,5% af cellerne opdelt i mere end 15 celler og dannede cellekolonier (figur 4A) under dyrkningen. Cellular heterogenitet blandt de prolifererende celler blev også påvist ved deres forskellige vækstmønstre danner to celler (4,3%), tre celler (2,5%), og 4 - 14 celler(15%) i cellekultur eksperimentet (figur 4C).
Disse resultater viste, at platformen kan anvendes til langvarig cellekultur, klonogene assays, og cellulære heterogenitet undersøgelser. Have et stort antal individuelle cellekolonier dyrket i et lille fodaftryk område gør også mikroskopisk analyse af cellerne lettere.
. Figur 1. Skematisk illustration af drift flow for high-throughput encellede isolering og dyrkning i mikrofluid platform Proceduren operation til enkelt-celle isolation og klonal kultur omfatter 4 trin: i) vejeceller ind i mikrokanalplade af en plastik spids og manuel pipette; ii) vaske væk uopfangede celler med frisk dyrkningsmedium drevet af en sprøjtepumpe; iii) efter forsegling indløbs- og afgangsåbninger med stik, det erolated celler blev overført fra capture-brønde til kultur-brønde ved at vippe enheden; og iv) udføre klonal kultur (klonogene assay) i kultur-brønde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Foto og SEM billeder af den mikro encellede isolering og dyrkning platform. (A) Mikrofluid platform indlæst med rød farve, der viser mikrokanalplader og mikrobrønde strukturer for single-cellekultur. (B) En repræsentativ billede taget fra et snit enhed, der viser set fra siden tre encellede isolation og klonal kultur enheder i mikrofluid platform. Scale bar: 100 um. SEM billeder af enkelt-cellekultur (C) og opsamling (D Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. KT98, A549, og MDA-MB-435 enkelt-celleisolering effektivitet i mikrofluid platform. (A) Effektivitet af KT98, A549, og MDA-MB-435 celler fanget i capture-brønde efter vask væk uopfangede celler . Tilfangetagelsen effektivitet celler var fra 67.80% til 85,16% i de tre celletyper. (B) Den encellede forholdet i alt kultur-brønde (skråstreg bar) var mere end 76% for KT98 og MDA-MB-435, men 61,63% for A549. (C) Et repræsentativt billede af individuel KT98 single-celler(Rød, farvet med celle tracker) isoleret i store kultur-brønde til klonal kultur. Målestok: 300 um. (D) Cell nummer i celle-besat kultur-brønde i KT98 celle model. Forholdet mellem kultur-brønde var 77,3% med en enkelt-celle, 16,31% uden celler, 5,96% med to celler og 0,43% med mere end tre celler. Fejllinjer er repræsenteret som ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Celledyrkning, klonogene assay og cellulær heterogenitet undersøgelse af isolerede A549 celler i mikrofluid platform for 7 d. (A) En isoleret encellede voksede og prolifererede til en celle koloni i kultur-brønd. (B) En isoleret encellede overlevede, men ikke dele sig, efter 7 dageaf kultur. Scale bar: 100 um. (C) De isolerede single-celler udviste heterogene vækstmønstre efter at være dyrket i 7 d. Fejllinjer er repræsenteret som ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrobrønd-baseret enhed systemer 6,14 er blevet anvendt til enkelt-celle manipulation og analyse, såsom storstilet enkelt celle trapping 6 og enkelt hæmatopoietisk stamcelleproliferation 15. Selvom godt størrelse, antal, og kan tilpasses til specifikke applikationer, single-celle isolation effektivitet altid kompromitteret, når størrelsen af brønden øges. 9,15
For at overvinde denne begrænsning, Park et al. Rapporterede en mikrofluid chip med trekantede mikrobrønde der har en høj encellede trapping sats (58.34%), mens mikrobrønd størrelse er forstørret for at tillade cellespredning og vækst. Imidlertid kunne microwells (med længden af en side ~ 50 um) kun støtte celleproliferation i op til 2 dage. 16 Vores dual-brønd strategi tillader enkeltcelle-loading i store microwells'ne ikke begrænses af sandsynligheden for Poisson fordeling stødt begrænse Dilution metoder og åbne såvel systemer 3, som demonstreret ved at levere høj encellede isolation virkningsgrad (mere end 75%) i store mikrobrønde, hvis størrelse var tilstrækkeligt for celleproliferation i mindst 7 d (figur 4A). På grund af sin evne til yderst effektivt udføre encellede isolation og klonal kultur med en simpel anordning og drift procedure, forestiller vi, at vores mikrofluid platform kunne være et nyttigt redskab for en bred vifte af applikationer, herunder kræft stamceller udvælgelse af klongenicitetsassayet 17 og high-throughput kardiotoksicitet screening af lægemidler 18,19.
En væsentlig begrænsning af vores encellede isolering og dyrkning platform er, at det ikke danner individuelt lukkede kultur-brønde for at forhindre krydstale mellem celler dyrket i kultur-brønde. Derfor kan opførsel af cellerne påvirkes af parakrine sekretion af andre isolerede enkelt-celler i mikrofluidapparatet. Den othendes begrænsning af vores platform er behovet for at fremstille relativt høj massefylde cellesuspension for højeffektiv encellede isolation. Denne høje celle forbrug kan begrænse ansøgningerne fra sjældne celle isolation og kultur, såsom vandige humor celler.
Før enhedens funktion, er det vigtigt at injicere DI vand fra indløbshullet at fylde mikrokanal og omhyggeligt observere nogen væskelækage fra bundet PDMS-enheden. Fluid lækage påvirker flow tilstand i mikrokanalplade dermed kan påvirke cellens opsamling og overførsel af resultatet. Hertil kommer, selv om vores encellede lastning effektivitet undersøgelsens resultater viser tab meget lav celle efter overførsel de isolerede celler fra capture-brønde til kultur-brønde, hvilket indikerer, at de fleste celler effektivt kunne overføres ved at vippe enheden, er den overførende effektiviteten faldt hvis BSA blokerende trin (2,12) er ikke korrekt udført. Brugere kan ændre BSA blokering protokol den eller bruge alnative overflade modifikation metoder til deres specifikke celle eksperiment behov (f.eks, stigende BSA koncentration eller belægning tid, hvor der anvendes en mere klæbende celletype). Dimensionerne af cellen capture-brønde er de dominerende faktorer, der skal optimeres for den bedste enkeltcelle-belastningseffektivitet i capture-brønde, afhængigt af størrelsen af den specifikke celletype af interesse. Høje multiple-celler-in-a-capture-brønd begivenheder skyldes have indfangning godt størrelse for stort til celletypen af interesse, mens lav celle belastningseffektivitet i capture brønd er en indikation af størrelsen af indfangning velvære for lille. Det er også vigtigt at minimere celleklynger i den fremstillede enkelt cellesuspension, som celleklynger kan reducere effektiviteten af enkeltcelle-loading i capture-brønde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
