We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Receptor de células T (TCR) repertorio de los seres humanos y los ratones se ha estimado en 1 x 10 8 y 2 x 10 6 TCR únicos respectivamente 1,2. Esta gran diversidad permite a las células T para reconocer una amplia gama de epítopos de antígenos derivados de péptidos propios, así como de los agentes patógenos presentados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células presentadoras de antígeno (APCs). Las diferencias sutiles en las interacciones de los TCR con los complejos de péptido-MHC únicas dictan si una célula T se someterá a la apoptosis, anergia, activación, diferenciación, la producción de citoquinas o la citotoxicidad. Sin embargo, debido a la gran repertorio TCR, el análisis de cómo un TCR específico responderá a un antígeno particular requiere el uso de los sistemas individuales de TCR.
Varios ratones transgénicos TCR se han generado con el fin de estudiar la función de un único TCR en un modelo in vivo 3-9. Sin embargo, hay advertencias a TCR ratones transgénicos incluyendo elcosto, la longitud de tiempo para generar un solo ratón transgénico y el llamado efecto fundador de inserción del transgén en el ADN de la línea germinal azar 10. Por lo tanto, son relativamente pocos los ratones transgénicos TCR se han generado para cualquier antígeno dado y las implicaciones funcionales de alta y baja afinidad TCR para el mismo epítopo rara vez se abordan. Para hacer frente a la necesidad de un acercamiento rápido a la pantalla y estudiar múltiples TCR de forma individual o en combinación, los ratones retrogenic ( 'retro' del retrovirus y 'génicas "de transgénicos) se han utilizado como una alternativa a la TCR ratones transgénicos 11-13.
El motivo de consenso péptido 2A se encuentra dentro de varios virus se componen de una 2A-Asp-Val / Ile-GLUT-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, en la que la escisión se produce entre la glicina de la 2A y de la prolina de la 2B a partir de cis-actuando hidrolasa actividad, lo que resulta en la omisión del ribosoma durante la traducción 10,14-16. Para un diagrama detallado que representa la cleavage de los diversos péptidos 2A (F2A, E2A, T2A y P2A), consulte las referencias 10 – 12. De esta manera, 2 cistrones (TCR alfa y beta TCR) se pueden vincular resultando en la traducción estequiométrica en un solo vector. Utilizando este enfoque, somos capaces de expresar y comparar directamente los múltiples TCR específicos de antígeno in vivo.
En el protocolo, detallamos varios pasos críticos para garantizar la salud de la médula ósea óptima, la eficacia de transducción y reconstitución. Primer paso fundamental es la generación y el mantenimiento adecuado de las células productoras viral GP + E86. Utilice líneas celulares productoras de paso de los primeros y mantener a 80% de confluencia o inferior antes de su uso. Al hacer células productoras viral GP + E86 frescos, asegurarse de que las células 293T son principios de paso y creciendo en cultivo …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (5K22A1119151-01 y 1R56DK104903-01) a MLB, Programa Piloto / Viabilidad del Centro de Investigación de la Diabetes (P30-DK079638) en BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-un APF, ADA 1-15-JF-07, Carreras AAI en Inmunología Beca de MB y La Fundación Robert y Janice McNair.
DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |