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Immunology and Infection

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54205
* These authors contributed equally

Introduction

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La moelle osseuse est un organe important impliqué dans l'hématopoïèse et la régulation immunitaire. Il se compose d'un composant hématopoïétique contenant des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC), et un composant de stroma contenant des cellules progénitrices non hématopoïétiques qui donnent naissance à des cellules mésenchymateuses 1. Deux tiers de l' activité hématopoïétique est dédié à la génération de cellules myéloïdes 2. En particulier, un grand nombre de neutrophiles sont produites dans la moelle osseuse, avec 1-2 x 10 cellules 11 produites par jour chez un humain adulte normal 2. Les neutrophiles sont la première ligne de défense contre les infections microbiennes et sont principalement réservés dans la moelle osseuse jusqu'à ce que le stress déclenche leur mobilisation pour compléter les neutrophiles périphériques 1,3. En plus de leurs effets anti-microbiens, des études récentes suggèrent un rôle important de neutrophiles dans la biologie du cancer, ayant à la fois pro- et anti- tumorigène phénotypes en fonction de la croissance transformantfacteur bêta (TGF-β) de signalisation dans le 4,5 microenvironnement de la tumeur. Par ailleurs, des études ont montré que les neutrophiles qui accumulent dans les tumeurs primaires exercent des effets pro-tumorigènes et métastatiques en supprimant la fonction cytotoxique des lymphocytes T 6,7, tandis que les neutrophiles en circulation exercent un cytotoxique, un effet anti-métastatique 8. En tant que tel, enquête sur les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse, en particulier des neutrophiles, est cruciale pour élucider leur rôle dans la régulation immunitaire et la tumeur.

Histopathologie et un dénombrement complet du sang périphérique sont couramment utilisés pour évaluer les altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse 9. Cependant, ces procédés ne fournissent que des informations statiques de différentes populations cellulaires ou des microstructures de tissu. Longitudinale imagerie in vivo peut être utilisé en combinaison avec les méthodes standard pour évaluer la dynamique de plusieurs cellules, vasculaires et stromales, ainsi que des composants de cellule à cinteractions ell de manière longitudinale. Microscopie intravitale (IVM), définie comme l' imagerie d'animaux vivants à une résolution microscopique 10 est particulièrement utile pour l' évaluation des processus cellulaires dynamiques au cours du temps dans un même échantillon, ce qui réduit le nombre d'animaux d' expérimentation nécessaire. IVM est souvent combiné avec une chambre de fenêtre chroniquement transplanté (WC) pour accéder à l'organe d'intérêt pour l'imagerie sur une durée de quelques semaines ou mois. modèles WC crâniennes et dorsale-skinfold ont la plus longue histoire d'utilisation qui remonte au milieu des années 1990. Plus récemment, d' autres modèles de WC spécifiques d'organes , tels que ceux du coussinet adipeux mammaire et les divers organes de l' abdomen ont été développés 11.

L'approche typique pour l' imagerie de la moelle osseuse in vivo est exposée principalement impliquée de la calvaria de souris, où l'os amincie permet la visualisation directe des cellules individuelles avec une intervention chirurgicale minimale 12-14. Cependant, l'os calvarial osseuse peut be distinct de celui des autres os, tels que l'os long, tel que démontré par un nombre inférieur de HSPCs et les cellules hypoxiques dans calvaria, qui indique le maintien et le développement de HSPCs 15 réduite. Par conséquent, des approches alternatives pour l'évaluation des composants cellulaires dans l'os long ont été étudiés. Ceux - ci comprennent l' exposition directe de l'os fémoral osseuse 16 et de la transplantation ectopique du fémur scission du dorsale skinfold WC 17. Cependant, la première est une procédure de terminal qui ne permet pas le suivi des altérations cellulaires, structurelles et fonctionnelles sur des périodes de temps plus longues, et le second probablement perturbe le fonctionnement normal de la moelle osseuse en raison de la transplantation du fémur à un site ectopique à l'intérieur du WC dorsale du pli cutané. Une autre méthode qui permet une imagerie en série orthotopique de la moelle osseuse du fémur au cours du temps est l'utilisation d'un WC dans l'os du fémur. Un rapport précédent a démontré l'imagerie à long terme de la microcirculation dans l'os fémoral osseuse au moyen d'unfémur WC chez les souris 18. En outre, les auteurs ont démontré la visualisation des cellules tumorales dans le fémur, ce qui indique son utilité dans la métastase de la moelle osseuse de surveillance. Cependant, cette conception de WC est limitée par sa grande taille (1,2 cm de diamètre) et relativement petite surface d'imagerie (4 mm de diamètre), qui est uniquement pour la grande souris (26-34 g, 3-6 mois), ce qui rend le approche pratique pour une utilisation de routine.

Par conséquent, un nouveau WC avec une taille globale plus petite et la plus grande surface d'imagerie interne a été conçue dans le but de la présente étude. Le but de cette étude était de fournir un procédé pour imager différents types de cellules dans la moelle osseuse du fémur. Le modèle de WC du fémur a été développé en interne et a été utilisé pour visualiser et suivre neutrophiles dans le réseau vasculaire 3D. En utilisant ce modèle, MIV de la moelle osseuse peut être réalisée en série sur 40 jours. Cette approche peut être appliquée à une variété de domaines pour élucider les processus de l'hématopoïèse, une régulation immunitairele développement de la tumeur nd.

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Protocol

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NOTE: Tous les travaux des animaux a été effectuée dans le protocole # 2615 approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux University Health Network.

1. Préparation chirurgicale de la souris

  1. Avant la chirurgie, stériliser les instruments chirurgicaux et la chambre à fenêtre (WC) par autoclavage. Compléter l'eau potable avec 50 mg / kg de poids corporel de l'amoxicilline 2 jours avant l'intervention chirurgicale. Injecter de la souris avec 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine par voie intrapéritonéale 4 heures avant l'intervention chirurgicale.
  2. Anesthetize la souris nude athymiques par injection intrapéritonéale d'une solution saline 350-400 ul contenant 80 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine (Note: Ceci a été approuvé par le Comité de protection des animaux dans les institutions, et nous avons pas eu une expérience avec des effets indésirables ). Confirmer l'anesthésie correcte en testant pied réflexe. Continuer d'observation du rythme respiratoire, la couleur des muqueuses et réflexes du pied au cours de la procédure.
  3. Effectuer la pr chirurgicaleocedures sous une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles au cours de la chirurgie. Placer la souris sur un coussin chauffant électrique recouverte d'un drap chirurgical pour maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale. Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous la loupe binoculaire.
  4. Appliquer une pommade oculaire pour garder les yeux humides pendant la chirurgie. Répéter si nécessaire pendant la procédure chirurgicale. La stérilisation de la zone de fonctionnement de la souris en essuyant avec 7,5% de povidone-iode, 70% d'alcool isopropylique et 10% de povidone-iode consécutivement, et répéter deux fois cette procédure.
  5. Faire une incision longitudinale de la peau de 10 mm en utilisant un scalpel avec une lame (# 15), se rapprochant du fémur du côté latéral. Exposer le fémur entre les muscles fléchisseurs et extenseurs par dissection en utilisant des pinces hémostatiques et pour assurer la fonctionnalité musculaire.
  6. Insérez la barre en forme de U sous l'os, et installer le WC (Figure 1). Fixer la barre à la fenêtre en utilisant deux écrous, et serrer les écrous avec pourCèpes. Remplir l'espace entre l'os et le WC avec du ciment dentaire.
  7. Broyer l'os cortical dans une région de 2 mm x 2 6 avec un micro-foret pour obtenir un accès optique à la cavité médullaire.
    Remarque: Inspectez soigneusement l'amincissement de l'os cortical sous le microscope pendant cette procédure. Laissez une couche de périoste intact, presque transparent de l'os.
  8. Placez le 8 mm lamelle sur la fenêtre, et fixer la lamelle avec un anneau élastique pour le maintenir en place.
  9. Réajuster la musculature des muscles fléchisseurs et extenseurs de retour à leur emplacement d'origine en utilisant des pinces pour maintenir leur fonction après la chirurgie. Suturer le derme à l'aide de fil de suture 5-0 et un porte-aiguille.
  10. Surveiller la souris pour la récupération, jusqu'à ce qu'il soit conscient et est en mesure de se déplacer librement. Mettre l'animal dans une nouvelle cage lorsqu'ils ont été récupérés.
  11. Après la récupération, effectuer l'acquisition d'images sur l'animal le même jour ou les jours suivants (voir la section 2). Surveiller la phyétat cal de la souris quotidienne.
    Note: Surveiller les conditions physiques, telles que le poids portant sur le membre, courbant, respiration rapide ou superficielle, gonflement des membres postérieurs, l'auto-mutilation, la cellulite et la dermatite sévère.
  12. Donner une injection intrapéritonéale de 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine pendant 3 jours et 1 mg / kg de poids corporel du méloxicame pendant 5 jours après la chirurgie pour le traitement de la douleur et de l'inflammation post-opératoire. Continuer à fournir l'eau amoxicilline supplémenté pendant 5 jours.
  13. Au point limite expérimental, euthanasier l'animal par le CO 2 narcose suivie d'une méthode secondaire (par exemple, la dislocation cervicale).

2. Acquisition d'image à l'aide combinée multi-photon et microscopie confocale

  1. Avant l'imagerie, anesthésier les souris par injection intraperitoneale d'une solution saline 350 à 400 pi contenant 80 mg / kg de kétamine et 13 mg / kg de xylazine. Vous pouvez également utiliser un anesthésique inhalable, lorsqu'il est disponible.Appliquer une pommade oculaire.
  2. Injecter le mélange de colorants intravasculaires pour l'étiquetage vasculature (0,65 mg de 2 MDa fluorescéine (FITC) -dextrane) et de neutrophiles (4 ug de allophycocyanine (APC) anticorps Ly6G -anti).
  3. Utiliser un multi-photons combiné en position verticale et confocal équipé d'un laser à photons multiples allant 705-980 nm pour l'excitation à deux photons, ainsi que les lasers à photon unique qui fournit des longueurs d'onde d'excitation du bleu au rouge.
  4. Définir une étape d'imagerie sur mesure sur le microscope (figure 1B). Fixer la souris sur la scène par serrage des deux extrémités du WC avec des pinces crocodiles.
    Remarque: Les composants critiques de la scène sont: deux pinces crocodile pour maintenir le WC, et un élément de chauffage pour maintenir la température physiologique (37 ° C) de la souris lors de l'imagerie.
  5. Allumez le laser à deux photons et le système confocal, et lancer le logiciel d'acquisition d'image en cliquant sur "Start System". Une fenêtre avec 4 onglets (Localiser,Acquisition, traitement, et maintenir) ouvrira.
  6. Mettre en place les canaux d'imagerie. Cliquez sur «Smart Setup» sous l'onglet Acquisition et choisissez les colorants qui seront utilisés pour l'imagerie: FITC (excitation à 488 nm, 493-588 nm émission) et APC (633 nm excitation et 638-743 nm émission). Choisissez "Meilleur Signal" et cliquez sur "Appliquer".
  7. Ajouter la deuxième génération d'harmoniques (SHG) canal d'acquisition d'image manuellement. Allumez le laser à deux photons dans la fenêtre "Laser" dans l'onglet Acquisition. Sous la fenêtre Canaux, cliquez sur le signe "+" pour ajouter une piste.
  8. Mettre en place la piste SHG. Changer la longueur d'onde de 840 nm sous la fenêtre des canaux en utilisant les flèches vers le haut et vers le bas, et choisissez la plage de détection à être 415-425 nm sous la fenêtre "Path Light" en utilisant la barre de défilement.
  9. Cliquez sur "Oculaires en ligne" sous l'onglet Locate. Cliquez sur FITC sous le réglage de filtre pour FITC pour afficher la région d'intérêt et d'ajuster la mise au point manuellement en tournant til se concentre bouton sur le côté du microscope. Lorsque la région d'intérêt se trouve, cliquez sur "Oculaires Hors ligne" sous l'onglet Locate.
  10. Cliquez sur l'onglet Acquisition. Sélectionnez la piste FITC sous la fenêtre des canaux et cliquez sur "Live" pour prévisualiser l'image de FITC-dextran avec l'objectif 5X. Réglez la mise au point, si nécessaire, et cliquez sur "Stop" sous l'onglet Acquisition pour arrêter la prévisualisation.
  11. Tourner manuellement à 20X objective de l'eau en déplaçant une roue au-dessus des lentilles. Voir l'image à nouveau pour FITC-dextran en utilisant l'objectif 20X, et ajuster Master Gain et sténopé sous la fenêtre des canaux pour obtenir un signal optimal et le contraste. Répéter pour les autres canaux en sélectionnant APC et SHG pistes sous la fenêtre des canaux.
  12. Choisissez les paramètres d'imagerie. Cliquez sur "Mode d'acquisition" pour ouvrir sa fenêtre. Définissez la taille de l'image soit 1.024 x 1.024 pixels, et la moyenne de 4X pour obtenir des images de haute qualité.
  13. Acquérir un instantané 2D. Sélectionnez tous les canaux sous les canaux gagnentdow et cliquez sur "Snap" sous l'onglet Acquisition. Vérifiez la qualité de l'image et de modifier les paramètres d'imagerie si nécessaire.
  14. Acquérir image 2D time-lapse.
    1. Cochez "Time Series" dans l'onglet Acquisition pour ouvrir la fenêtre Time Series. Tapez 0 dans les intervalles, et 40 pour le nombre total de balayages de prendre 40 images en continu, sans intervalle de temps.
      Note: 40 scans génère environ 5 minutes de temps-série avec une vitesse de balayage de 7,5 sec / cadre et la taille de l'image de 600 um x 600 um. Ajuster l'intervalle et le nombre de balayages en fonction du microscope, les paramètres d'acquisition d'image et la vitesse de l'appareil de trame. Un intervalle de temps fixe (> 0 sec) peut être utilisé pour comparer les images time-lapse acquises à différents moments. Une durée plus longue d'imagerie time-lapse peut être nécessaire en fonction de la vitesse moyenne attendue des neutrophiles (ou d'autres cellules d'intérêt) dans la condition expérimentale.
  15. Acquérir image 3D.
    1. Cochez "Z-Stack" dans l'onglet Acquisition pour ouvrir la fenêtre Z-Stack. Démarrez le "Live" mode de prévisualisation pour FITC-dextran. Focus sur la partie supérieure de l'échantillon et cliquez sur "Définir d'abord», et se concentrer sur l'autre extrémité de l'échantillon et cliquez sur "Définir Last" dans la fenêtre Z-stack.
    2. Réglez l'intervalle de 10 um sous la fenêtre Z-stack. En fonction de la première et de la dernière tranche optique sélectionné à l'étape précédente, cela va générer 10-20 tranches, avec une épaisseur optique globale de 90 à 180 um.
      Remarque: L'intervalle z pile dépend de la taille du trou d'épingle, qui détermine l'épaisseur de la tranche optique. Régler l'intervalle soit inférieure à l'épaisseur de la tranche optique.
    3. Cliquez sur "Démarrer Experiment" sous l'onglet Acquisition de commencer à recueillir des images.
  16. Acquérir image 3D time-lapse.
    1. Cochez "Time Series" et "Z-stack" dans l'onglet Acquisition pour ouvrir la série chronologiqueet les fenêtres Z-stack.
    2. Mettre en place la série Le temps et les paramètres d'acquisition Z-stack comme décrit dans les étapes 2.14 et 2.15. Cliquez sur "Démarrer Experiment" sous l'onglet Acquisition de commencer à recueillir des images.
  17. Surveiller la souris lors de l'imagerie pour vous assurer qu'il est stable et inconscient. Si la souris est instable et / ou consciente lors de l'imagerie, retirez la souris de la scène, l'injection supplémentaire de 100-150 ul de la solution anesthésique par voie intrapéritonéale, et continuer l'imagerie.
    Remarque: Les signes d'instabilité comprennent une respiration rapide et le mouvement de la souris, qui peut être vu comme déplacer des objets dans les images acquises.
  18. Après l'acquisition d'image, prenez la souris hors de la scène et le retourner à la cage. Utilisez une lampe chauffante pour le garder au chaud, et de surveiller la souris jusqu'à ce qu'il soit conscient.

Analyse et Quantification 3. image

  1. Utilisez un logiciel d'analyse d'images pour analyser les données 3D et de séries chronologiques. Ouvrez le logiciel etajouter des images en les faisant glisser dans l'écran ouvert, qui est appelé vue "Arena". Double-cliquez sur un fichier image pour l'ouvrir; l'image sera ouverte sous "Surpass" vue.
  2. Créer une image 2D / 3D.
    1. Dans la barre «Plus» qui se trouve sur le coin en haut à droite, cliquez sur "Modifier / Afficher Réglage de l'affichage" pour ouvrir "Réglage de l'affichage" fenêtre. Optimiser l'affichage de la fluorescence en ajustant les seuils pour chaque canal, et prendre une photo pour enregistrer l'image.
  3. Générer des pistes d'objets en utilisant des images de time-lapse.
    1. Ouvrez l'image à analyser sous "Surpass" vue. Cliquez sur l'icône avec une image de points orange, trouvé sous l'icône "Surpass". Cela va ouvrir une nouvelle fenêtre "Spots".
    2. Cochez "Spots de piste (dans le temps)" et cliquez sur la flèche bleue pour aller à l'étape suivante. Sélectionnez le canal contenant les objets à suivre sous "Source Channel", et définir le Diamet objet estiméer sous "estimée Diamètre XY" en tapant un numéro. Cliquez sur la flèche bleue pour aller à l'étape suivante.
      Remarque: Pour le suivi des neutrophiles, sélectionnez le canal contenant APC fluorescence pour les neutrophiles et régler le diamètre de l'objet à 12 pm en fonction de la taille connue de neutrophiles.
    3. Dans la fenêtre, recherchez et sélectionnez "Qualité" filtre en cliquant sur la flèche vers le bas. Observer les points définis par le logiciel et régler le seuil manuellement pour inclure ou exclure des taches. Une fois que le seuil est défini, cliquez sur la flèche bleue pour passer à l'étape "Suivi".
    4. Avec l'algorithme, trouver et sélectionner "Autoregressive Mouvement Algorithm" en cliquant sur la flèche vers le bas. Tapez 10 pm pour "Max Distance" et 3 pour "Taille Max Gap" trouvé sous Paramètres. Cochez «Combler les lacunes avec tous les objets détectés" pour commencer le suivi, et cliquez sur la flèche bleue pour aller à l'étape suivante.
      Note: "algorithme de mouvement Autoregressive» est utilisé fou des objets qui ont dirigé le mouvement, car il génère des pistes basées sur l'emplacement prévu du mouvement précédent. "Max Distance" et "Max Gap Size" peut être ajustée en fonction de la dimension attendue et la vitesse de l'objet suivi, ainsi que la durée globale de l'image time-lapse.
    5. Sous Type de filtre, sélectionnez le "Track Durée" filtre. Cliquez sur la flèche verte pour terminer le suivi et vérifier les pistes qui ont été générés. Retour à l'étape précédente si nécessaire pour trier manuellement les pistes.
  4. Si l'image dérives time-lapse générés, corriger la dérive de la traduction.
    1. Cliquez sur l'icône avec une image d'un crayon. Ceci est un onglet d'édition qui ouvre "Modifier Tracks" fenêtre. Examinez l'image time-lapse et trouver une place de référence qui ne devrait pas être en mouvement pour toutes les images.
    2. Dans le coin supérieur gauche de l'écran, trouver "Pointer" fenêtre et cocher "Sélectionner" pour activer le cursor pour sélectionner un endroit. Cliquez sur le point de référence.
    3. Cliquez sur "Drift correcte" dans la fenêtre "Modifier Tracks". Cochez "Translational Drift". Le logiciel génère automatiquement la série corrigée des images.
  5. Mesurer le mouvement cellulaire défini par les traces d'objets dans les images de time-lapse.
    1. Sous la fenêtre "Modifier Tracks", cochez "Tracks" et sélectionnez une piste qui représente le mouvement d'une cellule. La piste sélectionnée sera surlignée en jaune dans l'image des séries chronologiques.
    2. Cliquez sur l'icône avec une image d'un graphique pour ouvrir la fenêtre (onglet statistiques) "Statistiques".
    3. Sous "Sélection", sélectionnez "Track Vitesse moyenne" en cliquant sur la flèche vers le bas pour générer la vitesse de la piste signifie pour la piste sélectionnée. Choisissez différentes pistes et répétez les étapes pour mesurer la vitesse de la piste signifie pour toutes les cellules d'intérêt.

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Representative Results

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Murine fémorale de la moelle osseuse est accédé avec succès à l' aide du WC pour permettre la visualisation des neutrophiles et des réseaux individuels vasculaires. La figure 1 montre l'instrument WC et décrit la procédure chirurgicale, qui comprend une exposition de l'os du fémur et de l' amincissement de la corticale pour avoir accès optique à l' intérieur du OS. La chirurgie est bien tolérée chez la souris; ils ont été évalués pour des réactions physiques indésirables, tels que des membres postérieurs gonflement, non-poids portant sur le membre, l'auto-mutilation, la cellulite et la dermatite, ainsi que des dommages aux WC pendant 5 jours post-chirurgie, sans rapport de détresse. Notamment, la fenêtre reste optiquement clair pour IVM jusqu'à 40 jours, ce qui peut permettre une évaluation à long terme des altérations cellulaires et structurelles suite à une intervention.

Vasculature dans la moelle osseuse peut être visualisée par des colorants intravasculaires, tels que la FITC-Dextran(Figure 2). Le contraste dépend de l'injection du colorant, l'image acquise représente le système vasculaire fonctionnel où il y a un débit sanguin suffisant. En plus de la vasculature, les neutrophiles peuvent être colorées in vivo en utilisant un anticorps anti-Ly6G. La figure 3A et 3B représentent la même région de la moelle osseuse observée à différents points de temps, où les neutrophiles sont vus à la fois dans l'espace intravasculaire et extravasculaire. Ces zones ont été caractérisées par les repères vasculaires. Rhodamine 6G peut être utilisé comme une alternative à l' anti-tache pour Ly6G neutrophiles in vivo; cependant, il diffuse hors du système vasculaire et des taches monocytes dans l'espace extravasculaire de manière non spécifique. Par conséquent, l' anti-Ly6G est préférée car elle permet une imagerie spécifique des neutrophiles. La figure 3C représente l' imagerie de l'os cortical, qui est principalement composée de fibres de collagène. La profondeur maximale obtenue pour l'imageriedans cette expérience est de 180 um (figure 3C).

Time-lapse imagerie de fluorescence facilite le suivi et la quantification du mouvement cellulaire in vivo. La figure 4A montre le suivi des neutrophiles dans la niche vasculaire de la moelle osseuse. Imaging sans intervalle de temps supplémentaire entre chaque balayage permet un suivi précis des cellules; cependant, une certaine entrée de l'utilisateur est nécessaire pour améliorer encore la précision des pistes générées par le logiciel. Suivi des points (c. -à- cellules d'intérêt) permet la quantification des différents paramètres, tels que la vitesse moyenne de la piste (figure 4B). D'autres paramètres qui peuvent être mesurés comprennent, mais ne sont pas limités à, suivre la longueur, le changement de taille de la tache, la forme et l'intensité. Ce dosage permet la quantification des différents paramètres qui permettent d'améliorer la caractérisation des interactions cellulaires et des mouvements.


Figure 1: chambre de fenêtre Fémur (WC), le stade de l' imagerie et l'intervention chirurgicale (A) fémur de titane WC sur mesure avec une barre en forme de U qui sert à fixer le fémur en place.. Le WC est titulaire d'un couvercle en verre de 8 mm de diamètre, fixé par un anneau élastique. (B) étape de sur mesure imagerie. Un élément chauffant est placé sur le fond de la scène pour maintenir la température physiologique de la souris lors de l'imagerie. Les deux pinces crocodiles sont utilisés pour maintenir le WC. (C - H) Intervention chirurgicale pour installer le WC du fémur. (C) Le fémur est exposé entre les muscles fléchisseurs et extenseurs. Les muscles ne sont pas éliminés pendant la procédure. (D) La barre en forme de U est placé sous le fémur, et (E) le WC est installé et fixé à l' aide de deux écrous. Ciment (F) dentaire est appliquée entre l'os et laWC pour remplir l'espace. (G) Le derme est suturée et (H) le verre de couverture est fixé en place avec la bague de retenue. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: imagerie par fluorescence 3D du réseau vasculaire dans la moelle osseuse in vivo de l' image représentative du système vasculaire de la moelle osseuse, imagée par l'intermédiaire du WC fémur.. Vascularisation (vert) est visualisé par injection dans la veine de la queue de 2 MDa FITC-Dextran. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"Figure Figure 3: L' imagerie 3D du réseau vasculaire, les neutrophiles et la matrice osseuse in vivo d' images de la vascularisation et de neutrophiles dans la moelle osseuse (A) , 3 jours et (B) 10 jours après la chirurgie du fémur WC.. Neutrophiles, souillé par injection dans la veine de la queue de l'anticorps marqué Ly6G APC, sont considérées à la fois dans les espaces intra-vasculaires et extravasculaires. Les flèches indiquent la structure vasculaire vu sur les deux jours, ce qui indique la possibilité de suivre le même emplacement au fil du temps. Barre d'échelle = 50 pm. (C) une matrice osseuse peut être visualisée à l' aide SHG (blanc), en plus de la vasculature (vert) et de neutrophiles (rouge). L'image a été acquise 40 jours après la chirurgie WC. Barre d'échelle = 70 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 4: Suivi de mouvement des neutrophiles dans le réseau vasculaire de la moelle osseuse in vivo chemins (A) de la voie de neutrophiles dans le réseau vasculaire.. Les pistes sont générées automatiquement à l'aide intégrée Autoregressive algorithme de mouvement du logiciel. Chaque point blanc représente un point d'une particule centrale étant suivi (neutrophiles). Barre d'échelle = 50 pm. (B) la vitesse de la piste mesurée pour intravasculaires et extravasculaires neutrophiles moyenne, ce qui indique la différence dans le mouvement des neutrophiles (barre d'erreur = moyenne + SD, * p = 0,0176, à deux queues t-test). S'il vous plaît , cliquez ici pour afficher une version plus grande cette figure.

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Discussion

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En temps réel, l'imagerie en série des processus cellulaires dynamiques dans la moelle osseuse contient des informations qui est par ailleurs difficile à obtenir en utilisant des techniques classiques telles que l'histologie et la numération totale du sang. Le modèle de WC du fémur décrit ici offre des occasions uniques pour enquêter sur des altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse au fil du temps. Bien qu'un modèle fémur WC a été indiqué précédemment, notre nouvelle conception fournit un champ d'imagerie plus grande de vue et plus petite taille globale de WC, qui sont plus compatibles pour une utilisation chez des souris adultes. Le modèle de WC fémur peut être utilisé dans une variété de souches de souris, y compris immunocompétentes et / ou des souris transgéniques rapporteurs.

Il y a des étapes critiques de la chirurgie qui déterminent la durée totale et de la qualité de l'imagerie. Lors de l'exposition du fémur, seule une dissection des muscles entre fléchisseurs et extenseurs est effectuée; suppression de ces muscles peut entraîner une réduction de la mobilité de la souris et must être évitée. En outre, le broyage de l'os cortical doit être réalisée avec soin. Broyage d'environ 50 pm est approprié pour l'imagerie optique, tout en maintenant l'intégrité structurelle du réseau vasculaire fémorale. Application de ciment dentaire autour de l'os est indispensable pour assurer l'étanchéité de la zone exposée chirurgicalement, ce qui empêche l'accumulation de liquide, et le maintien d'une fenêtre d'imagerie optique clair pendant plus d'un mois tout en réduisant le risque d'infection. Le ciment dentaire agit également de fixer le WC en place, empêchant le WC de tourner autour de l'os fémoral. Enfin, l'anneau élastique servant à maintenir la lamelle est adapté pour une utilisation avec lentille immersion dans l'eau, la fourniture d'eau-joint. Le jonc est recommandé sur les adhésifs pour fixer la lamelle au WC, car plus d'adhésifs peut augmenter l'écart entre l'os et la lamelle, ou placer la lamelle à un angle faible par rapport au plan d'imagerie, ce qui réduit la profondeur de pénétration réalisable pour imagerie. en outre, L'anneau élastique est utile lorsque la lamelle doit être nettoyé ou changé.

En plus de la chirurgie, il y a plusieurs étapes essentielles pour réaliser l'imagerie optique réussie de la moelle osseuse. Pour l'image à l'intérieur du WC du fémur, le WC est placé horizontalement à l'étape d'imagerie pour une bonne immersion de l'objectif. L'étape de formation d'image sur mesure est adaptée à cet effet, car elle permet un réglage de l'angle du WC par rapport à la lentille. En outre, la conception du WC, en particulier la taille de la barre en forme de U, maintient l'os dans une position horizontale aussi près que possible du couvre-objet pour obtenir une profondeur de pénétration optimale. Au cours de l'imagerie, les artefacts respiratoires peuvent être observés sous forme de lignes horizontales dans l'image de fluorescence. En plus d'assurer le WC à l'étage de formation d'image, la température de l'élément chauffant sous l'étage de formation d'image peut être ajustée pour se réchauffer suffisamment l'animal afin de minimiser la respiration excessive. Une mince couche de gazepeut être placé entre la souris et le stade chauffé à aider davantage à réduire les artefacts de respiration pendant l'imagerie. En fonction de la cible d'imagerie biologique, les paramètres d'acquisition tels que le taux de trame, le volume d'imagerie et de la durée d'imagerie peuvent également être ajustées pour recueillir des images suffisantes pour répondre aux questions expérimentales. Par exemple, la vitesse de migration des neutrophiles et crawling peut différer dans différentes conditions expérimentales, de 2,8 um / min pour les neutrophiles résidents dans des conditions basales partout allant de 5 à 10 um / min pour les neutrophiles dans des conditions inflammatoires 19-21. Ainsi, la vitesse de formation d'image et la durée appropriées pour le suivi des neutrophiles in vivo seraient également varier en fonction des conditions expérimentales. En outre, comme on le voit à partir des résultats, le suivi des cellules dans le système vasculaire, il faudrait une caméra d'imagerie rapide avec une cadence élevée (30 images / sec). Toutefois, si les cellules cibles résident dans l'espace extravasculaire, ou si la INTERACTIONS cellule à cellulen d'intérêt devrait se produire plus lentement, la qualité de l'image doit être prioritaire par rapport à la vitesse d'imagerie.

L'influence des anticorps injectés in vivo pour la coloration des cellules sur la fonction cellulaire doit également être envisagée. Dans notre étude, nous avons utilisé l'anticorps anti-Ly6G (1A8 clone), qui est généralement utilisé à des doses élevées (150-250 ug) pour épuiser les neutrophiles de la circulation et d'étudier leur rôle dans divers modèles de maladies. Yipp et Kubes ont démontré que l' anticorps anti-Ly6G fluorochrome marqué ne perturbe pas le recrutement des leucocytes à de faibles doses d'injection intravasculaire (1-40 ug) 22. Cependant, une étude plus récente suggère que fluorochromes, ayant de grandes différences dans la masse moléculaire et la structure chimique, peuvent différentiellement influencer la fonction d'anti-Ly6G 23. L'étude a démontré que FITC marqué anti-Ly6G, mais pas riode et les anticorps APC marqué, épuise efficacement neutrophiles in vivo à une faible concentration (30 ug).Dans notre étude, nous n'avons pas observé neutrophiles épuisement des heures supplémentaires en utilisant 4 ug d'APC marqué anti-Ly6G. Néanmoins, une caractérisation plus poussée de la fonction du fluorochrome marqué par un anticorps anti-Ly6G in vivo est requis pour valider son utilisation en imagerie intravitale. Cela vaut également pour d'autres anticorps qui ont la capacité fonctionnelle de modifier les interactions cellulaires. A titre d'alternative à l' in vivo , la coloration des cellules avec des anticorps, des souris transgéniques reporteur 24 et / ou les cellules marquées par fluorescence 25 peut être utilisé pour visualiser les neutrophiles ou d' autres populations de cellules d'intérêt in vivo.

Le modèle du fémur WC décrit dans ce protocole permet l'imagerie jusqu'à 40 jours après la chirurgie. Certains des défis pour l'imagerie à long terme à l'aide de ce modèle de WC comprennent le processus de guérison osseuse retardée et l'entretien d'une fenêtre en verre propre. Notamment, nous ne sommes pas d'observer des signes de cicatrisation osseuse évidente suite à l'implantation WC, ce qui serait include épaississement de périoste; ce n'est pas surprenant étant donné que le processus de guérison de l' os se produit généralement après 1 ½-3 mois 26,27. Maintenance d'une fenêtre propre et optiquement clair peut être atteint par l'application du ciment dentaire, et l'utilisation de l'anneau élastique et coverglass qui fournissent une eau-joint ferme avec le tissu. La lamelle peut être occasionnellement nettoyé avec des conseils de coton de l'extérieur pour enlever la poussière et les débris. Le WC a un champ d'imagerie large, couvrant presque toute la longueur de la région diaphysaire (approximativement de 8,4 à 8,6 mm 28), ce qui le rend supérieur au modèle précédemment publié 18. Cependant, l'accès aux zones distales et la cavité de la moelle profonde est limitée. En particulier, la métaphyse trabéculaire riches, situés aux extrémités distales de la diaphyse, est connu pour être riche en hPSCs 29. Ces zones peuvent être consultées histologiquement ou par IVM comme une procédure terminal. Alternativement, différentes modalités d'imagerie telles que la micro-compbué tomographie peut être utilisée pour imager les régions distales de la moelle osseuse in vivo 30. De telles méthodes sont complémentaires à IVM, fournissant une approche intégrée pour l'évaluation de l'anatomie et les diverses altérations cellulaires et structurelles et les interactions au sein de la moelle osseuse.

Le protocole décrit ici offre une nouvelle approche pour l'évaluation spatio-temporelle long terme de l'os fémoral osseuse chez la souris à une résolution cellulaire. Les méthodes présentées permettent l'imagerie in vivo en série pour suivre les mouvements d'une cellule unique ou des populations cellulaires sur des échelles de temps biologiquement pertinentes, tout en obtenant simultanément des informations structurales et fonctionnelles de la moelle osseuse. En outre, l'analyse quantitative de l'image peut être effectuée pour caractériser davantage les altérations cellulaires et fonctionnelles, telles que le suivi des mouvements cellulaires. L' application de ce modèle de WC fémur dans différentes souches de souris, en particulier chez les souris transgéniques 31 reporteurs,peut en outre permettre à l'enquête de populations multiples de cellules individuellement marqués, tels que ceux qui sont impliqués dans l'hématopoïèse. Par conséquent, le protocole décrit est largement applicable à un large éventail d'études précliniques portant sur ​​divers processus biologiques au sein de l'os murin vivant osseuse, y compris les enquêtes dans l' hématopoïèse, la leucémie, HPSC transplantation, la régulation immunitaire, le microenvironnement de la moelle osseuse (par exemple, niche hypoxique) et la contribution des cellules du système immunitaire à la progression tumorale et les métastases.

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Disclosures

Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Fonds avancée Microscopie optique (de www.aomf.ca) au Réseau universitaire de santé de l'aide à la microscopie, et M. Jason Ellis de la princesse Margaret Cancer Center Machine Shop pour la fabrication du WC et l'étape d'imagerie. Nous tenons également à remercier le Dr Iris Kulbatski pour l'édition de manuscrits.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NRCNU-F athymic nude mice Taconic Ncr nude 8-10 weeks old, female
Saline Baxter JB1302P
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc.  DIN 01989529
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Surgical drape Proxima DYNJP2405
Electric heating pad Life Brand 57800827375
Stereomicroscope Leica Leica M60
Eye ointment (tear gel) Novartis  T296/2
7.5% betadine Purdue Frederick Co 67618-151-16
70% isopropyl alcohol GreenField P010IP7P
10% betadine Purdue Frederick Co 67618-150-05
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#15) VWR 89176-368
Spring Scissors curved Fine science Tools 15023-10
Baby-Mixter Hemostat Fine science Tools 13013-14
Fine Scissors Fine science Tools 14094-11
Extra Fine Graefe Forceps Fine science Tools 11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats Fine science Tools 13008-12
Micro-drill Harvard Apparaus 72-6065
Micro-drill burrs Fine Science Tools 19007-14
Femur window chamber PMCC machine shop custom design 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness)
U-shaped bar PMCC machine shop custom design 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height)
Coverglass (8 mm) Warner Instruments  HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8 mm) ACKLANDS GRAINGER UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel) Fastenal 70701
Dental cement 3M RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black) Covioien SN-5698
Halsey needle holder Fine Science Tools 12501-13
Buprenorphine (Temgesic) Reckitt Benckiser DIN 0281251
Meloxicam (Metacam) Boehringer Ingelheim DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox) Pfizer DIN 02027879
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)  eBioscience 17-9668
Two-photon microscope LSM 710 Carl Zeiss Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage PMCC machine shop custom design 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height)
Imaris software Bitplane Imaris 8.0 Image analysis software described in Section 3 of the Protocol 
Zen 2012 Zeiss Zen 2012 Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol 

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References

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Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).More

Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).

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