Introduction
מוח עצם הוא איבר חשוב המעורב hematopoiesis ורגולציה חיסונית. הוא מורכב מרכיב hematopoietic המכיל תאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs), ומרכיב סטרומה המכיל ובתאים הלא hematopoietic כי להצמיח תאי mesenchymal 1. שני שלישים של פעילות hematopoietic מוקדש לדור של תאים מיאלואידית 2. בפרט, מספר רב של נויטרופילים מיוצר במח העצם, עם 1-2 x 10 11 תאים שנוצרו ליום בתוך אדם מבוגר נורמלי 2. נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים מיקרוביאליים שמורות בעיקר במח העצם עד מתח מפעילה התגייסותם להשלים נויטרופילים היקפי 1,3. בנוסף להשפעות שלהם אנטי מיקרוביאליים, מחקרים אחרונים מראים תפקיד חשוב של נויטרופילים בביולוגיה סרטן, נתקל בשני פרו פנוטיפים אנטי tumorigenic תלוי צמיחה הפיכתבטא גורם (TGF-β) איתות 4,5 microenvironment הגידול. יתר על כן, מחקרים הראו כי נויטרופילים שמצטברים גידולים ראשוניים להשפעות פרו-tumorigenic ו גרורתי ידי דיכוי הפונקציה ציטוטוקסיות של תאי T 6,7, תוך נויטרופילים במחזור להפעיל ציטוטוקסיות, אנטי-גרורתי השפעה 8. ככזה, החקירה של תאי hematopoietic במח העצם, במיוחד נויטרופילים, היא חיונית כדי הבהרת תפקידם בתקנה חיסונית גידול.
Histopathology וספירת דם היקפית מלאה משמשים באופן שיגרתי כדי להעריך שינויים הסלולר מבניים מח עצם 9. עם זאת, שיטות אלה רק לספק מידע סטטי של אוכלוסיות תאים שונות או microstructures רקמות. אורך in vivo הדמיה ניתן להשתמש בשילוב עם השיטות הסטנדרטיות כדי להעריך את הדינמיקה של מרכיבים תאיים, כלי דם ואת סטרומה מרובים וכן תא אל גאינטראקציות ell באופן אורכי. מיקרוסקופיה Intravital (IVM), מוגדר הדמיה של חיים חיים ברזולוציה מיקרוסקופית 10, הוא שימושי במיוחד להערכת תהליכים תאיים דינמיים לאורך זמן באותו המדגם, צמצום מספר בעלי חי ניסוי הנדרש. IVM היא לעתים קרובות בשילוב עם תא חלון מושתלים כרוני (WC) לגשת איבר עניין הדמיה במשך זמן של שבועות עד חודשים. מודלי WC גולגולתי ו-skinfold הגבו יש את ההיסטוריה הארוכה ביותר של שימוש שראשיתה אמצע 1990. לאחרונה, מודלים WC איבר ספציפי אחרים כגון אלה של כרית שומן החלב ואת אברי הבטן השונים פותחו 11.
הגישה הטיפוסית הדמית מח עצם in vivo יש בעיקר מעורבת חשיפת מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת של עכברים, שם העצם הדליל מאפשר הדמיה ישירה של תאים בודדים עם התערבות כירורגית מינימאלית 12-14. עם זאת, מח עצם calvarial עשוי bדואר שונה מזו של עצמות אחרות, כגון עצם הארוך, כפי שהוכח על ידי מספר נמוך יותר של HSPCs ותאי היפוקסי ב מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת, מעידה מופחתת תחזוקה ופיתוח של HSPCs 15. לכן, גישות חלופיות להערכת מרכיבים תאיים ב העצם הארוך נחקרו. אלה כוללים חשיפה ישירה של מח עצם ירך 16 והשתלות אקטופי של ירך פילוג skinfold הגבה בב"ש 17. עם זאת, לשעבר הוא הליך מסוף שאינו מאפשר מעקב של שינויים הסלולר, מבניים ותפקודיים לאורך תקופות זמן ארוכות, ואת הסיכוי האחרון מפריע פונקצית מח עצם נורמלית עקב השתלת עצם הירך לאתר אקטופי בתוך WC הגבה skinfold. שיטה נוספת המאפשרת הדמיה סדרתי orthotopic של מח עצם הירך לאורך זמן הוא השימוש של WC בעצם הירך. בדוח הקודם אחת הפגינו הדמיה לטווח ארוך מיקרו מחזורי במח העצם הירך באמצעותירך WC בעכברים 18. בנוסף, החוקרים הדגימו ויזואליזציה של תאים סרטניים בעצם הירך, המציין השירות שלה גרור במח עצם ניטור. עם זאת, עיצוב בב"ש זה היה מוגבל על ידי גודל גדול שלה (בקוטר 1.2 ס"מ) ואזור הדמיה קטן יחסית (4 מ"מ קוטר), אשר היה מתאים רק עכברים גדולים (26-34 גרם, 3-6 חודשים של גיל) ובכך להפוך את להתקרב מעשי לשימוש שגרתי.
לכן, אסלה חדשה עם גודל כולל קטן ואזור הדמיה הפנימית גדול נועדו לצורך מחקר זה. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע שיטת הדמית סוגי תאים שונים במח עצם הירך. מודל WC הירך פותח בתוך הבית ושמש לדמיין ולעקוב אחר נויטרופילים בתוך רשת כלי דם 3D. באמצעות מודל זה, IVM של מח העצם ניתן לבצע באופן סדרתי על 40 ימים. גישה זו ניתן ליישם במגוון תחומי הבהרת תהליכי hematopoiesis, תקנה חיסוניתהתפתחות גידולים nd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל עבודת החיה בוצעה תחת פרוטוקול # 2615 אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדי אונ' בריאות ברשת ועדת שימוש.
1. הכנת כירורגים של עכבר
- לפני הניתוח, לעקר את כל מכשירי הניתוח ובית נבחרי החלון (WC) על ידי מעוקר. להשלים את מי השתייה עם 50 מ"ג / ק"ג משקל גוף של אמוקסיצילין 2 ימים לפני הניתוח. להזריק את העכבר עם 0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף של עצירות intraperitoneally 4 שעות לפני הניתוח.
- להרדים את העכבר בעירום athymic בזריקה intraperitoneal של תמיסת מלח 350-400 μl המכיל קטמין 80 מ"ג / ק"ג ו -13 מ"ג / ק"ג xylazine (הערה: זו אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים, ואנחנו לא היה ניסיון עם תופעות לוואי ). אשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת רפלקס ברגל. משך תצפיות דפוס נשימה, צבע קרום רירי רפלקס ברגל במהלך ההליך.
- בצעו את pr כירורגיתocedures מתחת לארון biosafety כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח. מניחים את העכבר על כרית חימום חשמלי מכוסה לעטוף כירורגית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. בצע את כל הליכים כירורגיים תחת סטראו.
- החל העין משחה לשמור על עיניים לחות במהלך הניתוח. חזור במידת הצורך במהלך ההליך הכירורגי. לחטא את אזור ההפעלה של העכבר על ידי מנגב עם 7.5% יוד povidone, אלכוהול איזופרופיל 70% ו -10% יוד povidone ברציפות, חזור על הליך זה פעמים.
- לעשות חתך בעור אורך 10 מ"מימ באמצעות אזמל עם להב (# 15), מתקרב הירך מהצד לרוחב. לחשוף את עצם הירך בין השרירים המכופפים ו פושטים ידי דיסקציה הקהה באמצעות מלקחי hemostats כדי להבטיח פונקציונליות שריר.
- הכנס את המוט בצורת U מתחת לעצם, ולהתקין את בב"ש (איור 1). אבטח את הבר עם החלון באמצעות שני אגוזים, והדק את האגוזים עם עבורפטריות לבנות. למלא את החלל בין העצם הב"ש במלט שיניים.
- טוחנים את עצם קורטיקלית באזור 6 x 2 מ"מ 2 עם מקדחה מיקרו כדי לקבל גישה אופטית עד העצם החלולה.
הערה: בזהירות לבדוק דילול של עצם קורטיקלית תחת מיקרוסקופ תוך ביצוע הליך זה. השאר שכבת periosteal ללא פגע, כמעט שקופה של העצם. - מניחים את coverglass 8 מ"מ על גבי חלון, ולאבטח את coverglass עם טבעת הצמד לשמור אותו במקום.
- להתקין מחדש את מערכת השרירים של המכופפים ו פושטים בחזרה למיקום המקורי שלהם באמצעות מלקחיים כדי לשמור על התפקוד שלהם לאחר הניתוח. לתפור את הדרמיס באמצעות תפר 5-0 ו בעל מחט.
- צג את העכבר להתאוששות, עד שהוא מודע והוא מסוגל לנוע בחופשיות. מכניסים את בעל החיים לתוך כלוב חדש כאשר התאושש.
- לאחר התאוששות, לבצע רכישת תמונה על החיה באותו היום או בימים הבאים (ראה סעיף 2). לפקח על physiמצב קאל של העכבר יומי.
הערה: צג תנאים פיסיים, כגון נשיאת משקל על גפיים, מכנס, נשימה מהירה או רדודה, נפיחות גפיים אחוריות, פגיעה עצמית, צלוליטיס דרמטיטיס חמורה. - תן זריקה intraperitoneal של 0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף של עצירות במשך 3 ימים, ו 1 מ"ג / ק"ג משקל גוף של meloxicam במשך 5 ימים לאחר הניתוח לטיפול בכאב ודלקת לאחר ניתוח. המשך מתן מים בתוספת-אמוקסיצילין במשך 5 ימים.
- בנקודת הקצה ניסיוני, להרדימו על ידי ה- CO 2 הרדמה ואחריו שיטה משנית (למשל, נקע בצוואר הרחם).
2. יבוא תמונות של שימוש משולב רב-פוטון מיקרוסקופי Confocal
- לפני הדמיה, להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של תמיסת מלח 350-400 μl המכיל 80 מ"ג / ק"ג קטמין ו -13 מ"ג / ק"ג xylazine. לחלופין, להשתמש בחומר inhalable, אם יש כזו.החל משח עין.
- להזריק את התערובת של צבעי intravascular עבור כלי דם תיוג (0.65 מ"ג של 2 מד"א והעמסה (FITC) -dextran) ו נויטרופילים (4 מיקרוגרם של Allophycocyanine (APC) נוגדן -anti-Ly6G).
- השתמש פוטון רב בשילוב זקוף מיקרוסקופ confocal מצויד לייזר רב פוטון החל 705-980 ננומטר עבור שני הפוטונים עירור, כמו גם לייזרים פוטון יחיד המספק אורכי גל עירור מכחול לאדום.
- הגדרת שלב הדמיה מחוייט על המיקרוסקופ (איור 1 ב). אבטח את העכבר על הבמה על ידי כיווץ שני הקצוות של WC עם קליפים תנין.
הערה: רכיבים קריטיים של הבמה: שני קליפים תנין להחזיק הב"ש, ואת גוף חימום כדי לשמור על טמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס) של העכבר במהלך הדמיה. - הפעל את ליזר שני פוטונים ומערכת confocal, ופתח את תוכנת רכישת תמונה על ידי לחיצה על "מערכה התחל". חלון עם 4 כרטיסיות (אתר,רכישה, עיבוד, ולתחזק) תיפתח.
- הגדרת ערוצי ההדמיה. לחץ על "הגדרה חכמה" תחת לשונית הרכישה ולבחור הצבעים אשר ישמשו הדמיה: FITC (488 ננומטר עירור, 493-588 ננומטר פליטה) ו- APC (עירור 633 ננומטר 638-743 פליטת ננומטר). בחר "Best איתותים" ולחץ על "החל".
- מוסיפים את הדור הרמוני השני ערוץ רכישת התמונה (SHG) באופן ידני. הפעל את ליזר שני פוטונים מתחת לחלון "ליזר" בלשונית הרכישה. מתחת לחלון ערוצים, לחץ על הסימן "+" כדי להוסיף מסלול.
- הגדרת מסלול SHG. שנה את אורך הגל 840 ננומטר מתחת לחלון ערוצים באמצעות החצים למעלה ולמטה, ולבחור את טווח הגילוי להיות 415-425 ננומטר מתחת לחלון "נתיב האור" באמצעות המחוון.
- לחץ על "oculars באינטרנט" תחת לשונית אתר. לחץ FITC תחת ההגדרה המסננת FITC כדי להציג את האזור של עניין ולהתאים את הפוקוס באופן ידני על ידי סיבוב tהוא להתמקד כפתור בצד של המיקרוסקופ. כאשר האזור של אינטרס ממוקם, לחץ "לא מקוון oculars" תחת לשונית אתר.
- הקש על כרטיסיית הרכישה. בחר מסלול FITC מתוך ערוצי חלון ולחץ על "חי" כדי לצפות בתצוגה מקדימה של התמונה של dextran FITC עם מטרת 5X. התאם את המיקוד במידת צורך, ולחץ על "עצור" תחת לשונית הרכישה לעצור את התצוגה מקדימה.
- ידני לפנות אובייקטיבי מי 20X ידי הזזת גלגל מעל העדשות. הצג את התמונה שוב-dextran FITC באמצעות המטרה 20X, ולהתאים מאסטר רווח ו חריר מתחת לחלון ערוצים כדי להשיג אות וניגודיות אופטימלי. חזור על פעולה עבור ערוצים אחרים על ידי בחירת מסלולי APC ו SHG מתחת לחלון הערוצים.
- בחר את הפרמטרים הדמיה. לחץ על "מצב הרכישה" לפתוח חלון שלה. הגדר את גודל המסגרת להיות 1,024 x 1,024 פיקסלים, והעמיד ממוצע של 4X כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה.
- רוכש תמונת 2D. בחר את כל הערוצים מתוך ערוצים לנצחדאה ולחץ על "צמד" תחת לשונית הרכישה. בדוק את איכות התמונה ולשנות פרמטרים הדמיה במידת הצורך.
- סריקתתמונה זמן לשגות 2D.
- בדוק את "סדרות עתיות" בלשונית רכישת כדי לפתוח את חלון סדרות עתיות. הקלד 0 תחת במרווחים, ו -40 עבור מספר כולל של סריקות לקחת 40 תמונות ברציפות ללא מרווח זמן.
הערה: 40 סריקות מייצרות כ באורך 5 דקות-סדרת זמן עם מהירות סריקה של 7.5 שניות / מסגרת ואת גודל התמונה של 600 מיקרומטר x 600 מיקרומטר. התאם את המרווח ומספר הסריקות תלויות מיקרוסקופ, הגדרות רכישת תמונה ואת קצב הפריימים של המצלמה. זמן מרווח קבוע (> 0 שניות) ניתן להשתמש כדי להשוות זמן לשגות תמונות רכשו בנקודות זמן שונות. משך הדמיה כבר זמן לשגות שיידרש תלוי המהיר הממוצע הצפויה של נויטרופילים (או תאים אחרים בעלי עניין) של תנאי הניסוי.
- בדוק את "סדרות עתיות" בלשונית רכישת כדי לפתוח את חלון סדרות עתיות. הקלד 0 תחת במרווחים, ו -40 עבור מספר כולל של סריקות לקחת 40 תמונות ברציפות ללא מרווח זמן.
- סריקתתמונה 3D.
- בדוק את "Z-Stack" בלשונית הרכישה כדי לפתוח את חלון Z-Stack. הפעל את מצב התצוגה המקדימה "חי" על-dextran FITC. דגש על החלק העליון של המדגם ולחץ על "המערכה הראשונה", ולהתמקד בצד השני של המדגם ולחץ על "הגדר אחרונה" בחלון מחסנית Z.
- הגדר את המרווח להיות 10 מיקרומטר מתחת לחלון מחסנית Z. בהתאם הראשון ואת הפרוסה האופטית האחרונה שנבחר בשלב הקודם, זה יפיק 10-20 פרוסות, עם עובי אופטי כולל של 90-180 מיקרומטר.
הערה: מרווח Z- המחסנית הוא תלוי בגודל של החריר, אשר קובע את העובי של הפרוסה האופטית. הגדר את המרווח להיות פחות מעובי של הפרוסה האופטית. - לחץ על "התחלת ניסוי" תחת לשונית הרכישה להתחיל לאסוף תמונות.
- סריקתתמונה זמן לשגות 3D.
- בדקו את "סדרות עתיות" ו- "Z-ערימה" בלשונית הרכישה כדי לפתוח את הסדרות עתיותוחלונות מחסנית Z.
- הגדרת סדרה עתית הפרמטרים רכישת Z- מחסנית כמתואר בשלבים 2.14 ו 2.15. לחץ על "התחלת ניסוי" תחת לשונית הרכישה להתחיל לאסוף תמונות.
- צג את העכבר במהלך הדמיה כדי לוודא שהוא יציב וחסר הכרה. אם העכבר אינו יציב ו / או בהכרה במהלך הדמיה, להסיר את העכבר המשלב, להזריק נוסף 100-150 μl של ההרדמה intraperitoneally, ולהמשיך הדמיה.
הערה: סימנים של חוסר יציבות כוללים מהר נשימה ותנועה של העכבר, אשר ניתן לראות הסטת חפצי תמונות שנרכשו. - לאחר רכישת התמונה, לקחת את העכבר מהבמה ולהחזירו לכלוב. השתמש מנורת חימום כדי לשמור אותו חם, ולנטר את העכבר עד שהוא מודע.
3. ניתוח תמונה וכימות
- השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לנתח את נתוני 3D והזמן-סדרה. פתח את התוכנהלהוסיף תמונות על ידי גרירתם לתוך המסך הפתוח, אשר נקרא נוף "ארנה". לחץ לחיצה כפולה על קובץ תמונה כדי לפתוח אותה; התמונה תיפתח תחת "לעלות" נוף.
- יצירת תמונת 2D / 3D.
- מהסרגל "יותר" שנמצא בפינה הימנית העליונה, לחץ על "התאמת תצוגה ערוכה / צג" לפתוח "לכיוון תצוגה" חלון. מטב את התצוגה קרינה על ידי התאמת הספים עבור כל ערוץ, ולקחת תמונת מצב כדי לשמור את התמונה.
- צור מסלולי אובייקט באמצעות תמונות זמן לשגות.
- פתח את התמונה להיות מנותח תחת "לעלות" נוף. הקש על הסמל עם תמונה של נקודות תפוז, נמצאת מתחת לסמל "לעלות". פעולה זו תפתח חלון "כתמים" חדש.
- בדוק את "מסלול כתמים (לאורך זמן)" ולחץ על החץ הכחול כדי לעבור לשלב הבא. בחר ערוץ המכיל את האובייקטים לעקוב אחריו "מקור ערוץ", ולהגדיר את diamet האובייקט המוערךאה תחת "קוטר XY משוער" על ידי הקלדת מספר ב. לחצו על החץ הכחול כדי לעבור לשלב הבא.
ההערה: מעקב נויטרופילים, בחר בערוץ המכיל קרינת APC עבור נויטרופילים ולהגדיר את קוטר האובייקט עד 12 מיקרומטר בהתבסס על הגודל הידוע של נויטרופילים. - בחלון, לחפש ולבחור "איכות" מסנן על ידי לחיצה על החץ למטה. שים את הנקודות שהוגדרו על ידי התוכנה ולהתאים את הסף באופן ידני כדי לכלול או לא לכלול כתמים. לאחר סף מוגדר, לחץ על החץ הכחול כדי לעבור לשלב "מעקב".
- תחת אלגוריתם, לחפש ולבחור "אלגוריתם Motion AutoRegressive" על ידי לחיצה על החץ למטה. הקלד 10 מיקרומטר עבור "מקס מרחק" ו -3 עבור "מקס גאפ גודל" נמצא תחת פרמטרים. בדוק את "למלא פערים עם כל האובייקטים המזוהים" כדי להתחיל מעקב, לחץ על החץ הכחול כדי לעבור לשלב הבא.
הערה: "אלגוריתם תנועת AutoRegressive" משמשת fאו חפצים אשר מכוונים תנועה, מכיוון שהוא מייצר מסלולים המבוססים על מיקום בעצם לצפות תנועה קודמת. "מקס מרחק" ו "גודל מקס גאפ" עשוי להיות מותאם תלוי בממד ומהירות הצפויים של האובייקט במעקב, כמו גם את המשך הכולל של הזמן לשגות תמונה. - תחת סוג מסנן, בחר את המסנן "מסלול משך". לחץ על החץ הירוק כדי לסיים מעקב, ולבדוק את המסלולים שנוצרו. חזור על השלב הקודם במידת הצורך למיין את הרצועות באופן ידני.
- אם מרחף זמן לשגות תמונה שנוצר, המתאים להיסחף translational.
- הקש על הסמל עם תמונה של עיפרון. זהו כרטיסיית עריכה שנפתחה "ערוך רצועות" חלון. בדוק את זמן לשגות התמונה ולמצוא מקום התייחסות שאסור לזוז במשך כל התמונות.
- בפינה השמאלית העליונה של המסך, למצוא חלון "פוינטר" ולבדוק את "בחר" על מנת להפעיל את המ"קrsor לבחירת מקום. לחץ על המקום התייחסות.
- לחץ "דריפט נכון" בחלון "ערוך רצועות". בדוק את "Translational דריפט". התוכנה תפיק סדרת התיקן אוטומטית של תמונות.
- מדוד תנועה הסלולר שהוגדרה על ידי רצועות אובייקט זמן לשגות תמונות.
- מתחת לחלון "ערוך רצועות", לבדוק את "שירים" ובחר מסלול שמייצג את התנועה של תא. המסלול שנבחר יודגש בצהוב בתמונה בזמן הסדרה.
- הקש על הסמל עם תמונה של גרף כדי לפתוח את (כרטיסיית סטטיסטיקה) "הסטטיסטיקה" חלון.
- תחת "בחירה", בחר "מסלול מהיר Mean" על ידי לחיצה על החץ למטה כדי ליצור את מהירות המסלול מתכוון למסלול הנבחר. בחר מסלולים שונים וחזור על הצעדים כדי למדוד את מהירות המסלול מתכוונת לכל התאים של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מח עצם ירך Murine הוא לגשת בהצלחה באמצעות WC לאפשר ויזואליזציה של נויטרופילים פרט רשתות כלי דם. איור 1 מציג את מכשיר WC ומתאר את ההליך כירורגי, אשר כרוך בחשיפה של העצם ודילול הירך של עצם קורטיקלית כדי לקבל גישה אופטית בתוך עצם. הניתוח ונסבל היטב עכברים; הם עברו הערכה תגובות פיזיות שליליות, כגון נפיחות הגפיים האחוריות, הלא נושאת משקל על הגפיים, פגיעה עצמית, צלוליטיס דרמטיטיס, כמו גם נזק בב"ש במשך 5 ימים לאחר הניתוח, ללא דיווח על מצוקה. יש לציין, החלון נשאר ברור אופטי עבור IVM עבור עד 40 ימים, אשר עשוי לאפשר הערכה ארוכת טווח של שינויים הסלולר ומבניים בעקבות התערבות.
כלי הדם בתוך מח העצם ניתן דמיינו ידי צבעי intravascular, כגון FITC-dextran(איור 2). מאז הניגוד תלוי בדבר ההזרמה לצבוע, התמונה רכשה מייצגת כלי דם פונקציונליים שבו יש זרימת דם מספקת. בנוסף כלי הדם, נויטרופילים יכול להיות מוכתם in vivo באמצעות נוגדן אנטי Ly6G. איור 3 א ו 3 ב לייצג באותו אזור של מח העצם שנצפה בנקודות זמן שונות, שבו נויטרופילים נתפסים הן intravascular ומרחב extravascular. אזורים אלה התאפיינו מציוני הדרך של כלי הדם. Rhodamine 6G ניתן להשתמש כחלופה אנטי Ly6G להכתים נויטרופילים in vivo; עם זאת, זה מתמוסס מתוך מונוציטים כלי דם וכתמים במרחב extravascular באופן שאינו ספציפי. לכן, אנטי Ly6G עדיף כיוון שהיא מאפשרת הדמיה ספציפית של נויטרופילים. איור 3 ג מייצג הדמיה של עצם קורטיקלית, אשר מורכב בעיקר של סיבי קולגן. העומק המקסימאלי עבור הדמיה המושגת בניסוי זה הוא 180 מיקרומטר (איור 3 ג).
זמן לשגות דימות פלואורסצנטי מקלת מעקב וכימות של תנועה הסלולר in vivo. איור 4 א מציג מעקב של נויטרופילים בגומחה וסקולרית מח עצם. הדמיה ללא מרווח זמן נוסף בין כל סריקה מאפשרת מעקב מדויק של תאים; עם זאת, קצת קלט משתמש נדרש עוד כדי לשפר את הדיוק של מסלולים שנוצרו על ידי התוכנה. מעקב של כתמים (כלומר, תאים בעלי עניין) מאפשרת כימות של פרמטרים שונים, כגון מהירות ממוצעת המסלול (איור 4B). פרמטרים נוספים שניתן למדוד כוללים, אך אינם מוגבלים, לעקוב אחר אורך, שינוי גודל נקודה, צורה ועצמה. assay זה מספק כימות של פרמטרים שונים המשפרים את האפיון של תנועות אינטראקציות הסלולר.
= "1"> 
איור 1: תא חלון עצם הירך (WC), בשלב הדמיה ההליך הכירורגי (א) בב"ש הירך טיטניום מחוייט עם בר בצורת U המשמש לתקן את הירך במקום.. הב"ש בעל מכסה זכוכית בקוטר 8 מ"מ, מאובטח על ידי טבעת תוך שניות ספורות. (ב) בשלב הדמיה מחוייט. גוף חימום מושם על החלק התחתון של הבמה כדי לשמור על הטמפרטורה הפיזיולוגית של העכבר במהלך הדמיה. שני קליפים התנין משמשים כדי להחזיק הב"ש. (C - H) הליך כירורגי להתקנת הב"ש הירך. (ג) עצם הירך חשוף בין השרירים המכופפים ו פושטים. שרירים לא יוסרו במהלך ההליך. (ד) הלשכה בצורת U ממוקמת מתחת הירך, ו (ה) בב"ש מותקנת ומאובטחת באמצעות שני אגוזים. (F) מלט שיניים מוחל בין העצם ואתבב"ש כדי למלא את החלל. (G) הדרמיס הוא sutured ו (H) הזכוכית המכסה הוא קבוע במקום עם טבעת תמך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דימות פלואורסצנטי 3D של רשת כלי דם במח עצם in vivo תמונת נציג כלי הדם במח העצם, צלם דרך WC הירך.. כלי הדם (ירוק) הוא מדמיין על ידי הזרקה לווריד הזנב של 2 מד"א FITC-dextran. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מעקב תנועה נויטרופילים בתוך רשת כלי הדם של מח העצם in vivo (א) עקוב אחר נתיבים של נויטרופילים בתוך רשת כלי הדם.. מסלולים נוצרים באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם Motion המובנה AutoRegressive של התוכנה. כל נקודה לבנה מייצגת נקודת המרכז של חלקיק במעקב (נויטרופילים). בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) מהירות ממוצעת מסלול נמדדה עבור נויטרופילים intravascular ו extravascular, המציין הבדל בתנועה של נויטרופילים (בר שגיאה = מתכוון + SD, * p = 0.0176, שני זנב t-test). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה בזמן אמת, סידורי של התהליכים התאיים הדינמיים במח עצם מספקת מידע כי הוא מאתגר אחרת להשיג באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון היסטולוגיה וספירת דם מוחלטת. מודל WC הירך המתואר כאן מספק הזדמנויות ייחודיות לחקור שינויים הסלולר מבניים במח העצם לאורך זמן. למרות מודל WC הירך דווח בעבר, עיצוב הרומן שלנו מספק בתחום הדמיה גדול מבט וגודל WC הכולל קטן יותר, אשר תואם יותר לשימוש עכברים בוגרים. מודל WC הירך ניתן להשתמש במגוון של זני עכבר כולל מערכת חיסון תקין ו / או עכברי כתב מהונדסים.
ישנם שלבים קריטיים במהלך הניתוח הקובעים את המשך הכולל ואיכות ההדמיה. כאשר חושף את עצם הירך, רק לנתיחה בוטה של שרירים בין מכופפים ו הפושטים מתבצעת; הסרת השרירים אלה עלולות לגרום ניידות מופחתת של העכבר must להימנע. יתר על כן, שחיקה של עצם קורטיקלית חייבת להתבצע בזהירות. גריסה כ 50 מיקרומטר היא נאותה עבור דימות אופטי תוך שמירה על שלמות מבנית של רשת כלי הדם הירך. יישום של דבק דנטלי סביב העצם הוא קריטי עבור איטום באזור החשוף בניתוח, מניעת הצטברות נוזלים, ושמירה על חלון הדמיה אופטי ברור יותר מחודש תוך צמצום הסיכון לזיהום. מלט השיניים פועל גם כדי לתקן את WC במקום, מניעת השירותים מן מסתובב סביב עצם הירך. לבסוף, את טבעת הצמד משמשת להחזיק את coverglass היא מתאימה לשימוש עם עדשת מי טבילה, מתן חותמת מים. טבעת הצמד מומלץ יותר דבקים לצרף את coverglass אל הב"ש כי תוספת של דבקים עשוי להגדיל את הפער בין העצם ואת coverglass, או שמעבירים את coverglass ב קרוב משפחה בזווית קלה אל המטוס הדמיה, ובכך להפחית את עומק החדירה השגה עבור הַדמָיָה. יתר על כן, טבעת הצמד שימושית כאשר coverglass צריך לנקות או השתנה.
בנוסף הניתוח, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להשיג הדמיה אופטית מוצלחת של מח העצם. כדי תמונה בתוך WC הירך, הב"ש מושם אופקי לשלב הדמיה לטבילה תקינה של העדשה האובייקטיבית. שלב הדמית מחוייט הוא מתאים למטרה זו שכן היא מאפשרת התאמות של הזווית של WC ביחס העדשה. יתר על כן, את העיצוב של השירותים, במיוחד בגודל של הבר בצורת U, שומר על העצם במצב אופקי קרוב coverglass ככל האפשר כדי להשיג עומק חדירה אופטימלי. במהלך הדמיה, חפצים נשימה אפשר לראות כמו קווים אופקיים בתמונות הקרינה. בנוסף לאבטחת WC לשלב הדמיה, הטמפרטורה של גוף החימום מתחת לבמת ההדמיה עשויה להיות מותאמת כדי לחמם את החיה כראוי כדי למזער נשימה מוגזמת. שכבה דקה של גזהיוטל בין עכבר הבמה המחוממת נוסף כדי לסייע להפחית חפצי נשימה במהלך הדמיה. בהתאם ליעד ההדמיה הביולוגי, פרמטרי רכישה כגון מסגרת דולר, נפח הדמיה ומשך הדמיה עלולים גם להיות מותאמים כדי לאסוף תמונות מספיק כדי לענות על שאלות ניסיוניות. לדוגמא, מהירות של גירת נויטרופילים וסריקה עשויה להיות שונה תחת תנאי ניסוי שונים, מ -2.8 מיקרומטר / min נויטרופילים תושב בתנאים בסיסיים כדי החל מקום בין 5-10 מיקרומטר / min נויטרופילים בתנאים דלקתיים 19-21. לפיכך, את המהירות ואת משך ההדמיה המתאימה מעקב נויטרופילים in vivo היו גם להשתנות בהתאם לתנאי ניסוי. בנוסף, כפי שניתן לראות מן התוצאות, מעקב של תאים בתוך כלי הדם ידרוש מצלמת הדמיה מהירה עם קצב פריימים גבוה (30 מסגרות / שנייה). עם זאת, אם תאי היעד שוהים בחלל extravascular, או אם תא אל תא interaction עניין צפוי להתבצע לאט יותר, איכות תמונה צריכה להיות מהירות הדמיה על סדר עדיפויות.
השפעת הנוגדנים מוזרקים מכתים in vivo תא על תפקוד הסלולר חייב להיות גם נחשבת. במחקר שלנו, השתמשנו נוגדנים נגד Ly6G (1A8 שיבוט), שלרוב משמש במינונים גבוהים (150-250 מיקרוגרם) כדי לרוקן נויטרופילים ממחזור וללמוד תפקידם מודלי מחלה שונים. Yipp ו Kubes הראו כי נוגדנים שכותרתו fluorochrome אנטי Ly6G לא לשבש גיוס לויקוציטים במינונים הזרקת intravascular נמוך (1-40 מיקרוגרם) 22. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה עולה כי יותר fluorochromes, שיש הבדלים גדולים מסה מולקולרית ומבנה כימי, יכול דיפרנציאלי להשפיע על התפקוד של אנטי-Ly6G 23. המחקר הוכיח כי FITC שכותרתו אנטי Ly6G, אבל לא PE- ו APC שכותרתו נוגדנים, ביעילות מכלה נויטרופילים in vivo בריכוז נמוך (30 מיקרוגרם).במחקר שלנו, אנו לא צופים שעות נוספות דלדול נויטרופילים באמצעות 4 מיקרוגרם של Ly6G אנטי שכותרתו APC. אף על פי כן, אפיון נוסף של הפונקציה של נוגדן שכותרתו fluorochrome אנטי Ly6G in vivo נדרש כדי לאמת את השימוש בו הדמיה intravital. זה חל גם על נוגדנים אחרים שיש להם יכולת תפקודית לשנות אינטראקציות הסלולר. כחלופת מכתים תא in vivo עם נוגדנים, עכברי כתב מהונדסים 24 ו / או תאי פלורסנט שכותרתו 25 יכול לשמש כדי לחזות נויטרופילים או אוכלוסיית תאים אחרות בעלי עניין in vivo.
מודל WC הירך המתואר פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של עד 40 ימים לאחר הניתוח. כמה מן האתגרים הדמיה לטווח ארוך באמצעות מודל בב"ש זה כולל את תהליך ריפוי העצם מתעכב ותחזוקה של חלון זכוכית נקי. יש לציין, לא חגגנו סימני ריפוי העצם ברור בעקבות ההשתלה בב"ש, אשר היה includדואר עיבוי של קרום העצם; זה לא בלתי צפוי בהתחשב בעובדת תהליך ריפוי העצם מתרחש בדרך כלל לאחר 1 ½-3 חודשים 26,27. תחזוקה של חלון נקי אופטי-ברור יכולה להיות מושגת על ידי היישום של הדבק דנטלי, ושימוש טבעת צמד coverglass המספק מי חותם משרד עם הרקמה. Coverglass ניתן לנקות מדי פעם עם טיפים כותנה מבחוץ כדי להסיר אבק ופסולת. בב"ש יש שדה הדמיה רחב, כמעט מכסה את כל האורך של אזור diaphysis (כ 8.4-8.6 מ"מ 28), מה שהופך אותו ינעל המודל שפורסם בעבר 18. עם זאת, גישה לאזורי דיסטלי ואת העצם החלול העמוקה מוגבל. בפרט, metaphysis trabecular עשיר, ממוקם בקצוות המרוחקים של diaphysis, ידוע להיות עשיר HPSCs 29. באזורים אלו ניתן לגשת היסטולוגית, או על ידי IVM כהליך סופני. לחלופין, שיטות הדמיה שונות כגון-comp מיקרוניתן להשתמש טומוגרפיה התנהגותיות בילדים תמונה האזורים הדיסטלי של מח העצם in vivo 30. שיטות כאלה הן משלימים IVM, מתן גישה משולבת להערכת האנטומיה ואת השינויים הסלולר מבניים השונים ואינטראקציות בתוך מח העצם.
הפרוטוקול המתואר כאן מציע גישה חדשנית לאבחון במרחב ובזמן לטווח ארוך של מח עצם הירך בעכברים ברזולוציה הסלולר. השיטות שהוצגו לאפשר הדמית סדרתי vivo כדי לעקוב אחר תנועות של תא בודד או אוכלוסיות הסלולר על סולמות זמן רלוונטיים מבחינה ביולוגית, תוך קבלת מידע מבני ותפקודי זמני של מח העצם. בנוסף, ניתוח תמונת כמותית ניתן לבצע כדי להמשיך לאפיין שינויים הסלולר ופונקציונליים, כגון מעקב תנועות הסלולר. יישום של מודל WC ירך זה זנים שונים של עכברים, במיוחד אצל עכברי כתב מהונדסים 31,ייתכן נוסף להפעיל חקירה של אוכלוסיות תאים בנפרד שכותרתו מרובות כגון המעורבים hematopoiesis. לכן, פרוטוקול המתואר הוא נרחב החלים על מגוון רחב של מחקרים פרה-קליניים מעורבים תהליכים ביולוגיים שונים בתוך מח העצם בעכברים חיים, כולל חקירות hematopoiesis, לוקמיה, השתלת HPSC, תקנה החיסון, במיקרו-סביבה של מח העצם (למשל, נישה היפוקסי) ו התרומה של תאי מערכת החיסון כדי התקדמות גרורות של גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מתקן מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת (www.aomf.ca) בבית רשת בריאות באוניברסיטת לסיוע עם מיקרוסקופיה, ומר ג'ייסון אליס מן חנות הנסיכה מרגרט Cancer Center מכונות להכנת הב"ש והשלב הדמיה. אנו רוצים גם להודות לד"ר איריס Kulbatski לעריכת כתב יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
