Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery

doi: 10.3791/54256 Published: September 20, 2016

Abstract

In vitro transkripsjon-analyser er blitt utviklet og mye brukt i mange år for å studere de molekylære mekanismer som er involvert i transkripsjon. Denne prosessen krever multi-subenhet DNA-avhengig RNA polymerase (rnap) og en serie av transkripsjonsfaktorer som fungerer for å modulere aktiviteten av rnap i løpet av genekspresjon. Sekvense gel elektroforese av radiomerkede transkripsjoner brukes til å gi detaljert mekanistisk informasjon om hvordan transkripsjons inntektene og hvilke parametere kan påvirke det. I denne beskrivelsen beskriver vi protokollen for å studere hvordan den essensielle elongeringsfaktor Nusa regulerer transkripsjonen midlertidig stopping, så vel som en fremgangsmåte for å identifisere et antibakterielt middel rettet mot transkripsjonsinitiering gjennom hemming av rnap holoenzyme formasjonen. Disse metodene kan brukes som en plattform for utvikling av flere tilnærminger for å utforske virkningsmekanismen av transkripsjonsfaktorer som fortsatt er uklare, så vel som nye antibakterielle agents målretting transkripsjon som er en dårlig utnyttede medikamentmål i antibiotikum forskning og utvikling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transkripsjon er den prosess hvor RNA syntetiseres fra en spesifikk DNA-templat. I eukaryote celler er det tre distinkte RNAPs: rnap I transkriberer rRNA-forløpere, er rnap II ansvarlig for syntesen av mRNA og visse små nukleære RNA, og syntesen av 5S rRNA og tRNA er utført av rnap III. I bakterier, er det bare én rnap ansvarlig for transkripsjon av alle klasser av RNA. Det er tre stadier av transkripsjon: initiering, forlengelse og avslutning. Transkripsjon er en av de mest regulerte prosesser i cellen. Hvert trinn i syklusen transkripsjon representerer en kontrollpost for regulering av genekspresjonen 1. For initiering, har rnap å assosiere med en sigma faktor for å danne holoenzyme, som er nødvendig for å dirigere enzymet til bestemte steder som kalles aktivatorer 2 for å danne en åpen promoter kompleks. Deretter en stor pakke med transkripsjonsfaktorer er ansvarlig for regulering of rnap aktiviteter i løpet forlengelses og terminerings faser. Transkripsjonsfaktor undersøkt her er svært konservert og viktig protein, Nusa. Det er involvert i regulering av transkripsjon pauser og avslutning, samt anti-avslutning i løpet av rRNA syntese 3-5.

In vitro transkripsjon analyser har blitt utviklet som kraftige verktøy for å studere de komplekse regulatoriske trinnene under transkripsjon 6. Generelt er et lineært fragment av DNA som inneholder en promoter region som kreves som templat for transkripsjon. DNA-templatet blir vanligvis generert ved hjelp av PCR eller ved linearisering av et plasmid. Rensede proteiner og NTPs (inkludert en radioaktivt merket NTP for deteksjonsformål) blir deretter tilsatt, og produktet analysert ved å følge den ønskede inkubasjonsperiode. Ved hjelp av egnede maler og reaksjonsbetingelser, har alle stadier av transkripsjon blitt undersøkt ved hjelp av denne tilnærmingen som har gjort det mulig detaljert molekylær karakterisering av transcription over det siste halve århundret 7. I kombinasjon med informasjon om tre-dimensjonale strukturen av rnap har det også vært mulig å undersøke den molekylære mekanismen for transkripsjon hemming av antibiotika og antibiotika fører, og bruke denne informasjonen i utviklingen av nye og bedre legemidler 8-10.

I dette arbeidet gir vi eksempler på hvordan transkripsjons analyser kan anvendes for å bestemme mekanismen for regulering av transkripsjon forlengelse / opphør faktor Nusa, og hvor mekanismen for virkningen av en ny transkripsjonsinitiering inhibitor bly kan bestemmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forsiktig: Eksperimenter innebære bruk av den radioaktive isotopen 32 P og noe arbeid skal gjennomføres før alle nødvendige sikkerhetsmessige forhold er oppfylt. Vanligvis personell er pålagt å delta på et sikkerhetskurs og gjennomgå veiledet praksis før eksperimenter ved hjelp av radioaktive reagenser. Vennligst bruke personlig verneutstyr (thermoluminescent dosimeter, vernebriller, hansker, stråling rom lab strøk, full lengde bukser, lukket-toe sko) når du utfører reaksjonen.

1. Utarbeidelse av analysen Materials

  1. Skaff proteiner som kreves for transkripsjon analysen.
    1. For forsøket beskrevet her, overprodusere og rense E. coli rnap i laboratoriet som beskrevet 11, eller få fra en kommersiell kilde (Materialer List).
      Merk: Begge gir lignende resultater. Andre fremgangsmåter for rensing av naturlig eller affinitet merket rnap kan også brukes 12,13. Sigma / Nusa faktorer kan fås som described i tidligere arbeid 14,15.
  2. Utarbeidelse av dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlet vann
    Merk: Alternativt kan RNase-fritt vann fås fra kommersielle kilder (Materials List).
    1. Tilsett 1 ml dietylpyrokarbonat (DEPC) til 1 liter renset vann (0,1% v / v) og blandes over natten.
    2. Autoklav DEPC vann og tips to ganger.
  3. DNA Mal Forberedelse
    1. Rense plasmid pSG1154 16 og / eller pIA226 17 ved hjelp av et plasmid rensing kit (Materialer List) i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. For å forsterke mal for avrennings transkripsjon analyser (360 bp fragment som omfatter P fortelle XYL promoter-regionen), montere en PCR reaksjon på isen, inkludert 25 ul 2x PCR mix (Materials List), 2 mL hver av de primere (5 mm) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(fremover) og 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (bakover), 1 ul pSG1154 plasmid preparation (250 pM) og 20 pl renset vann).
      1. Eller alternativt, for enkelt runde transkripsjons analyser, forsterke et 447 bp fragment som omfatter λ P R promoter regionen fra pIA226 17. Sett opp en PCR-reaksjon på is ved anvendelse av 25 ul 2 x PCR-blanding, 2 ul hver av primerne (5 pM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(fremover) og 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (revers), 1 ul pIA226 17 plasmid forberedelse (250 pM) og 20 pl renset vann).
        Merk: Denne malen mangler cytosin inntil 26 nt posisjon, som er den 26. nucleotide fra transkripsjon start stedet. Derfor transkripsjon ved hjelp av denne ramme vil tillate initiering, promoter klaring og drøye på 26 nt for å danne et stabilt kompleks transkripsjon forlengelse (EF) når bare ATP, UTP og GTP er til stede i reaksjonen.
    3. Sett opp en PCR reaksjon med følgende vilkår: 95 °C i 30 sek, 50 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder, gjentatt i 30 sykluser.
    4. Rens produktet ved hjelp av en PCR opprydding kit (Materials List) i henhold til produsentens instruksjoner og elueres i 100 ul transkripsjon buffer for transkripsjon analysen.
    5. Bestem mal DNA konsentrasjonen ved hjelp av en fluorospectrometer (Materialer List).
  4. NTP Forberedelse
    Merk: NTPs kan fås fra forskjellige kommersielle kilder (Materials List).
    1. Løs opp NTPs (≥99% ren) i DEPC-behandlet vann for å lage en M lager, delmengde 1 ml av løsningen i 1,5 ml rør (50 mikroliter i hvert rør) og oppbevar ved -20 ° C.
    2. Orden α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) forut for eksperimentet. 32p har en kort halveringstid på 14.29 dager.
      Merk: Bruk av alfa-merket UTP unngår å sammenligne intensiteten av band med forskjellig lengde.
  5. RNA Ladder Forberedelse
    1. Monter oppfølginging reaksjon ved romtemperatur: 0,5 ug RNA-templat Mix (Materials List), 80 mM HEPES-buffer pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32P UTP, 0,5 mL T7 rnap (Materialer List), DEPC-behandlet vann til 20 mL.
    2. Tillat reaksjonen å forløpe ved 37 ° C i 1 time. Brukes umiddelbart eller oppbevares ved -80 ° C.

2. Fremstilling av RNA-sekvensering Gel

  1. gel Forberedelse
    1. Rengjør platene fra en sekvense gelapparatur (Materialer List) to ganger med 70% etanol og renset vann, og montere cellen med en kam og to avstandsstykker.
      Merk: En plate kan være belagt med silikonsiering reagens (Materialer List) for å lette gel fjerning i trinn 4.2.
    2. Oppløs 33,6 g urea i 22 ml vann og 16,4 ml av 5 x Tris / borat / EDTA (TBE) buffer (54 g tris (hydroksymetyl) aminometan; 27,5 g borsyre, 10 ml 1 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 7,4 i 1 l vann) ved bruk av en magnetrører.
    3. Legg 16 ml av 40% akrylamid / bis-acrylamid-løsning (19: 1) til urealøsningen og filtreres gjennom et 0,45 um filter.
    4. Legg 514 pl 10% (vekt / volum) nyfremstilt ammoniumpersulfat i vann etterfulgt av 51,4 ​​pl N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED) til den filtrerte oppløsning.
    5. Snu forsiktig gelen løsning for å unngå overdreven lufting og injisere umiddelbart og greit inn i horisontalt plassert ferdigpakket sekvense celle fra bunnen injeksjon hullet. Pass på å unngå å lage bobler under injeksjon.
    6. Tillat 1-1,5 time før gelen er helt satt før bruk i transkripsjon analysen. Gelen kan oppbevares ved romtemperatur i to eller tre dager når de vikles med vann-vått vev på toppen av sekvense cellen.

3. transkripsjon Reaction

  1. Transkripsjon Forlengelse Pause analysen
    1. Dannelse av en transkripsjon forlengelse kompleks
      1. Tilsett 1 pl av rnap kjerne enzym (1 uM lager i transkripsjonsbuffer) til et 1,5 ml rør.
      2. Tilsett 1 pl renset sigma-70 faktor (σ 70; 3 uM lager i transkripsjonsbuffer) til rnap og inkuber på is i 10 min for å danne rnap holoenzyme.
      3. Tilsett 3 pl 500 nM renset templat-DNA (λ P R-promoteren fra det pIA226 PCR-produkt) i transkripsjon buffer til rnap holoenzyme og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter for å danne det åpne komplekset.
      4. Lag en blanding av reaksjonskomponentene i en annen 1,5 ml rør ved hjelp av 5 ul 10x transkripsjon buffer (Materialer List: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glycerol, pH 7,9 i DEPC behandlet vann), 2 ul av 250 pM hver GTP og UTP, 1 ul 1 mM ATP og 1 pl av α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Legg DEPC behandlet vann til 41 mikroliter.
        Neite: RNase inhibitor (Materialer List) kan brukes til å minimere RNase forurensning.
      5. Overfør blandingen løsning til røret som inneholder den åpne komplekse og inkuber ved 37 ° C i 15 min for dannelse av transkripsjon forlengelsen komplekset stoppet ved 26 nt.
      6. Flytt reaksjonen til romtemperatur (~ 21 ° C) og tilsett 1 pl 2,5 mg / ml rifampicin til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml.
      7. Tilsett 1 pl 0,1 mM renset Nusa til reaksjonsblandingen og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
      8. Tilsett 2 ul av 250 pM CTP i reaksjonsblandingen for å lage et endelig volum på 50 ul og måle reaksjonstiden ved hjelp av et tidsur.
      9. Transfer 5 ul av reaksjonsløsningen fordelt på 2 pl av RNA-gel lastebuffer (95% formamid, 0,05% bromfenolblått og 0,05% xylencyanol) ved 30, 60, 120, 240, 480 og 1200 sek for å stanse reaksjonen.
      10. Kast de 32 P UTP tips og rør i et radioaktivt avfall fortsainer.
  2. Transkripsjon Innvielse analyse
    1. Dannelse av Open Complex
      1. Fortynnet renset σ 70 til 0,5 mikrometer.
      2. Gjenta trinn 3.1.1.1 til 3.1.1.3 ved anvendelse av 0,5 um (i stedet for 3 uM) renset σ 70, og DNA-templatet (P fortelle XYL promoter-regionen fra pSG1154 PCR-produkt).
    2. Hemming av transkripsjonsstart assay
      1. Tilsett inhibitor utformet for å forhindre rnap holoenzyme formasjon til rnap kjerne enzym før tilsetning av σ 70 (etter trinn 3.1.1.1), etterfulgt av trinn 3.1.1.2 og 3.1.1.3 for å undersøke hvorvidt inhibitoren er i stand til å forstyrre holoenzyme formasjonen.
      2. Alternativt etter trinn 3.1.1.2, tilsett inhibitor for å undersøke om det er i stand til å hemmer kompetitivt σ 70 binding til rnap.
      3. Bruke den samme mengde av DMSO, løsningsmidlet av inhibitoren, i stedet for inhibitoren stock i kontroll reaksjoner.
    3. Fullføring av reaksjonen
      1. Oppløs heparin i vann til en stamkonsentrasjon på 1 mg / ml og lager ved -20 ° C.
        Merk: Heparin er en konkurrent av DNA som kan beslaglegge rnap som ikke har dannet en åpen kompleks. Når den åpne komplekset er dannet, kan heparin ikke gå inn i DNA-bindingssetet på rnap og hemme transkripsjon fra pre-dannede åpne kompleks. Derfor er heparin bare nødvendig for single-round-analyser; Det er ikke nødvendig for multi-runde analyser.
      2. Fremstille reaksjonsblandingen ved hjelp av 5 ul av 10 x transkripsjonsbuffer (Materialer List), 1 ul av 1 mg / ml heparin-løsning, 1 pl av 10 mM av hver ATP, GTP, CTP og, 2,5 mM UTP, og 1 ul av α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Legg DEPC behandlet vann til 45 mikroliter.
      3. Blande reaksjonsblandingen med transkripsjons åpen kompleks, puls spinn og inkuber ved 37 ° C i 20 min.
      4. Overfør 10 ul av reaksjons såning inn i 5 pl av RNA-gel lastebuffer (95% formamid, 0,05% bromfenolblått og 0,05% xylencyanol) for å stanse reaksjonen.

4. RNA Gel Running and Development

  1. Kjører denaturering polyakrylamidgel
    1. Kjør gelen ved 50 ° C og 50 W i 1 x TBE-buffer for ca 1,5 timer inntil temperaturen av gelen og bufferen er stabil ved 50 ° C.
    2. Varme prøver ved 90 ºC i 30 sek og flytte dem på is før lasting på gel.
    3. Belastningsprøver i brønnene på toppen av gelen langs en bane inneholdende 2 ul RNA stige (1: 100 fortynning).
    4. Kjør gelen ved 50 V og 50 ° C i 1 x TBE-buffer inntil bromfenol blått fargestoff når ~ 2/3 ned gelen.
  2. gel Treatment
    1. Åpen langsomt og forsiktig skille den øvre plate med sekvens cellen. Ta stor forsiktighet for å unngå å bryte gelen.
    2. Cut Chromatogrhy papir (Materialer liste) for å matche gel størrelse fra toppen til bromfenol blå farge. Bruk en geigerteller for å bekrefte den omtrentlige posisjonen til radioaktivt merkede RNA transkripsjoner.
    3. dekke nøye gelen med filterpapiret, og trykk godt til gelen fester seg til filterpapiret. Avskåret og forkaste bunnen av gelen til radioaktivt avfall som den uinkorporerte NTPs drevet til bunnen av gelen, noe som kan være svært varm.
    4. Plasser en lignende størrelse stykke filterpapir på tørke sjikt av et vakuum-tørkemaskin, og forsiktig la den gel-belagt papir på den med gelen side opp.
    5. Dekk-gel med en plastfolie og tørk ved 60 ° C i 1,5 timer.
    6. Pakk den andre siden av gelen belagt filterpapiret med plastfolie, og legg på en photostimulable fosfor plate i bilde saken, med det passende eksponeringstiden, som kan variere fra 1 time til over natten, avhengig av reaksjonseffektivitet.
    7. Bilde fosfor plate ved hjelpen imager scanner i henhold til produsentens instruksjoner. Bestem den relative bandet intensiteten ved hjelp ImageJ programvaren i henhold til programvarehåndboken.
    8. Bruk en geigerteller for å sjekke radioaktiv forurensning i arbeidsområdet, tørk den mistenkte elementer og området med vev og et rengjøringsmiddel og kast vevet i avfallsbeholderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transkripsjon effektivitet kan bestemmes ved å måle nivået av stråling i båndene ved ulike tidspunkt. Den pause analyse for å teste funksjonen til Nusa faktor aktivert visualisering av pausen, oppsigelse, og avrenning produkter (Figur 1a). I nærvær av det N-terminale domenet av Nusa (Nusa NTD, aminosyrerester 1-137), ble forekomsten av RNA-produktene betydelig forsinket sammenlignet med kontrollforsøk mangler Nusa. Delesjon av aminosyrerester 104-137 (Helix 3) av Nusa fragment, eller endring av alanin av en serie av aminosyrer (restene K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116, og R119) resulterte i fullstendig tap av Nusa pause aktivitet. Helix 3 rester R104 og K111 ble vist seg å være avgjørende for Nusa NTD pause aktivitet og med R104A og K111A konstruksjoner som ga samme pausehalveringstider til kontroll hvor Nusa NTD var fraværende (figur 1B). det should bemerkes at delesjon av Helix 3 eller endring av disse to aminosyrerester ikke har noen virkning på Nusa binding til rnap 15. Resultatet antydet at R104 og K111 var de viktigste aminosyrer som kreves for regulering av Nusa pause aktivitet.

Likeledes, som vist i figur 2A, er dose-responskurve viste inhibisjon av in vitro transkripsjon (multi rund) under anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av en nylig identifisert bakterie transkripsjonen inhibitor C5 14. C5 ble identifisert etter en i silico skjermen fra prosjekt til rasjonelt målrette samspillet mellom σ 70 med sin store bindingssetet på rnap kalt Clamp-Helix region 18. Under tilsetning av C5 inn i transkripsjonsreaksjon, kan denne forbindelsen konkurrere mot σ 70 for binding til rnap, og dermed hemmet transkripsjon. Mekanistisk tilsetning av C5 til rnap fulgt av σ <sup> 70 faktor til reaksjonsblandingen var betydelig mer effektiv for transkripsjon inhibering enn eksperiment ved hjelp C5 etter dannelsen av rnap holoenzyme (figur 2B). Disse resultatene viste at σ 70 ikke kan fortrenge bundet til C5 rnap, eller at C5 kunne ikke effektivt fortrenge σ 70 bundet til rnap i en enkelt runde analysen.

Figur 1
Figur 1:. Effekter av Mutant Nusa NTD i transkripsjon (A) transkripsjon pause analyser uten Nusa, ved hjelp av Nusa NTD (+ Nusa), Nusa NTD med helix tre slettet (Δ Helix), og Nusa NTD med alanin-substitusjoner ved restene K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116, og R119 (Alle Ala). P, pause nettstedet; T, oppsigelse nettstedet; RO, avrenning. Kiler ovenfor gelen demonstrere de tidspunkter samplet (0,5, 1, 1,5, 2, 5 og 10 min) 15; (B) Pause aktivitet av halveringstider på mutant Nusa NTD i forhold til villtype protein. Gjennomsnitt av 3 eksperimenter med SD. Dette tallet har blitt forandret fra nukleinsyrer Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Fig. 2: Transkripsjon hemming av forbindelse C5 (A) Inhibering av kurve E. coli rnap transkripsjon av forbindelse C5 i en multi-rund assay 14. Prosent inhibering av transkripsjon ble bestemt ved RNA-produkt i forhold til en kontroll (ingen C5 til stede) mot konsentrasjonen av C5 anvendt i reaksjonen. (B) Prosent inhiberende aktivitet av forbindelse C5 in single-round transcription forsøk med tilsetning av C5 før (kompleks + σ 70; grå) og etter (holoenzyme + C5; svart) holoenzyme dannelse. Dette tallet har blitt forandret fra ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I alle organismer, er transkripsjonen en strengt regulert prosess. In vitro-transkripsjon analyser er blitt utviklet for å tilveiebringe en plattform for å teste effektene av transkripsjonsfaktorer, små molekyler og transkripsjons inhibitorer. Ved denne fremgangsmåte papiret, ble en analyse for generell bakteriell transkripsjon er beskrevet. Transkripsjon analyser kombinert med sekvense gel elektroforese av vitnemål er svært viktig for mekanistiske studier som de tillater visualisering av alle transkripsjonsprodukter langs en tidslinje. Som et resultat, er denne metoden er i stand til å identifisere påvirkning av mindre endringer i reaksjonsbetingelsene og avslører en plausibel virkningsmekanisme. Videre blir det mulig å konstruere spesifikke transkripsjons analyser med hensyn til funksjonen av transkripsjonsfaktorer med ukjente virkningsmekanismer.

I denne artikkelen beskrives også vi metoden for å bekrefte virkningsmekanismen av en inhibitor av rnap holoenZyme formasjon. Metoden som beskrives her kan vise endringen av hvert RNA-transkript med tiden, og med passende modifikasjon kan muliggjøre testing av antibakterielle midler mot hvert trinn av transkripsjon som er hensiktsmessig. Den multi-round-analysen kan brukes som en relativ enkel screeningmetode for å identifisere nye transkripsjons målretting inhibitorer, mens den enkelt runde analysen kan brukes til å studere mekanismen av inhibitorer, slik som konkurrerende / ikke-konkurrerende egenskaper. Legg merke til at små molekylære aggregering kan føre til falske positive treff som ikke-konkurrerende hemmere i stoffet funnet prosessen og enkelt runde mekanistisk studie kan gi en helhetlig tilnærming for hit-til-ledningene. Som et resultat av dette er kontrollert transkripsjon prosessen er i stand til nøyaktig avsløre hvordan en inhibitor påvirker transkripsjon, noe som kan hjelpe til med rasjonaliseres de novo drug design. Sammen med høy oppløsning informasjon om hemmer bindingssteder av X-ray krystallografiske studør, strukturbasert rasjonell drug design vil være svært mottagelig for bruk i medisiner rettet mot transkripsjon.

Selv om high-throughput resultater ikke kan oppnås med in vitro transkripsjon assays, er de ekstremt nyttige i å dissekere nøyaktige mekanismer i forbindelse med kontroll av transkripsjon. Komponentene og analyse forhold kan lett modifiseres for individuelle behov. Ulike faktorer (for eksempel Nusa) 4, 15, små molekyler (f.eks ppGpp) 19 og / eller transkripsjons hemmere (f.eks rifampicin) 20 av interesse kan legges for å teste sine funksjoner i transkripsjon regulering. DNA malen skal være individuelt utformet, med nøye valg av sterke arrangører, pause sekvens og terminatorer. For å oppnå høy reproduserbarhet av analysen, skal være sterkt proteiner renset og fri for resterende RNase-aktivitet, og transkripsjonsbuffer, DNA-templat, ogstamløsning av NTP underlag må gjøres i DEPC behandlet vann. Bruken av radioaktive NTPs ble beskrevet i denne artikkelen, er imidlertid fluorescerende nukleotider kan også anvendes 21. Kvaliteten av DNA-templatet er avgjørende for suksess for transkripsjon assay. Tilstrekkelig avstand mellom promoter / pause / terminator må tas med, slik at de forskjellige transkripsjonsprodukter for å være riktig adskilt og undersøkt. Den sekvense gel må være riktig helles og relativt fersk TBE buffer må brukes for elektroforese for å oppnå høyest mulig oppløsning av RNA transkripsjoner. Ved nedbrytning av transkripsjon produkt blir lagt merke til, må høy kvalitet RNase-inhibitoren inkorporeres i transkripsjonsreaksjonsblandingen. Rør og pipetter må doble autoklaveres og hansker må brukes til enhver tid når du utfører analysen, for å minimere innføring av RNase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT Sigma-Aldrich DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180, (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4, (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107, (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401, (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7, (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47, (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5, (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5, (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80, (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278, (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43, (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227, (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117, (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45, (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405, (3), 666-678 (2011).
<em>In vitro</em> transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).More

Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter