Summary

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Abstract

Les essais in vitro de transcription ont été mis au point et largement utilisé depuis de nombreuses années pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la transcription. Ce processus nécessite plusieurs sous-unités d'ARN-polymérase ADN-dépendante (RNAP) et une série de facteurs de transcription qui agissent pour moduler l'activité de RNAP pendant l'expression génique. gel de séquençage électrophorèse des transcrits radiomarqués est utilisé pour fournir des informations mécaniste détaillées sur la façon de transcription produit et quels paramètres peuvent l'affecter. Dans cet article, nous décrivons le protocole pour étudier la manière dont le facteur d'élongation essentiel NusA régule la transcription de pause, ainsi qu'une méthode pour identifier un agent antibactérien ciblage initiation de la transcription par l'inhibition de la formation holoenzyme RNAP. Ces méthodes peuvent être utilisées comme une plate-forme pour le développement d'approches supplémentaires pour explorer le mécanisme d'action des facteurs de transcription qui restent encore peu clair, ainsi que de nouvelles agen antibactériennets ciblant la transcription qui est une cible de médicament sous-utilisé dans la recherche et le développement d'antibiotiques.

Introduction

La transcription est le processus dans lequel l'ARN est synthétisé à partir d'une matrice d'ADN spécifique. Dans les cellules eucaryotes, il existe trois RNAPs distincts: I ARNP transcrit précurseurs ARNr ARNP II est responsable de la synthèse de l'ARNm et de certains petits ARN nucléaires, ainsi que la synthèse de l'ARNr 5S et ARNt est réalisée par ARNP III. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul ARNP responsable de la transcription de toutes les classes d'ARN. Il y a trois étapes de transcription: initiation, l'élongation et la terminaison. La transcription est l'un des procédés les plus réglementés dans la cellule. Chaque étape du cycle de transcription représente un point de contrôle pour la régulation de l' expression des gènes 1. Pour l' initiation, ARNP doit associer à un facteur sigma pour former une holoenzyme, qui est nécessaire pour diriger l'enzyme à des sites spécifiques appelés promoteurs 2 pour former un complexe promoteur ouvert. Par la suite, une grande suite de facteurs de transcription sont responsables de la réglementation oactivités f RNAP pendant l'allongement et de terminaison phases. Le facteur de transcription examiné ici est la protéine hautement conservée et essentielle, NusA. Il est impliqué dans la régulation de la transcription en pause et la résiliation, ainsi que des anti-terminaison au cours de la synthèse de l' ARNr 3-5.

Les essais in vitro de transcription ont été développés comme des outils puissants pour étudier les étapes réglementaires complexes lors de la transcription 6. D'une manière générale, un fragment linéaire d'ADN comprenant une région promotrice est requise en tant que matrice pour la transcription. La matrice d'ADN est habituellement généré par PCR ou par linéariser un plasmide. les protéines et les PNT (y compris une NTP radiomarqué à des fins de détection) purifiés sont ensuite ajoutés et le produit analysé après la période d'incubation requise. Utilisation de modèles appropriés et des conditions de réaction, toutes les étapes de la transcription ont été examinés en utilisant cette approche qui a permis la caractérisation moléculaire détaillée de transcription au cours du dernier demi – siècle 7. En combinaison avec des informations sur la structure en 3 dimensions de RNAP il a également été possible de sonder le mécanisme moléculaire de l' inhibition de la transcription par les antibiotiques et conduit aux antibiotiques, et utiliser cette information dans le développement de nouveaux médicaments améliorés 8-10.

Dans ce travail, nous fournissons des exemples de tests de transcription peuvent être utilisés pour déterminer le mécanisme de régulation par allongement de la transcription / facteur de terminaison NusA, et comment le mécanisme d'action d'une nouvelle initiation de la transcription inhibiteur de plomb peut être déterminée.

Protocol

Attention: Les expériences impliquent l'utilisation de l'isotope radioactif 32 P et aucun travail devraient être entrepris avant que toutes les conditions de sécurité appropriées ont été respectées. En général, le personnel sont tenus d'assister à un cours de sécurité et se soumettre à la pratique supervisée avant des expériences en utilisant des réactifs radioactifs. S'il vous plaît porter un équipement de protection individuelle (dosimètre thermoluminescent, des lunettes de sécurité, gants,…

Representative Results

l'efficacité de la transcription peut être déterminée en mesurant le niveau de rayonnement dans les bandes à des instants différents. Le dosage pause pour tester la fonction du facteur NusA visualisation de la pause, la terminaison est activée, et le ruissellement des produits (figure 1A). En présence du domaine N-terminal de NusA (NTD NusA, les résidus d'acides aminés 1-137), l'apparence des produits d'ARN a été sensiblement retardée par rap…

Discussion

Dans tous les organismes, la transcription est un processus étroitement régulé. Les essais in vitro de transcription ont été développés pour fournir une plate – forme pour tester les effets des facteurs de transcription, des petites molécules et les inhibiteurs de la transcription. Dans cette méthode, le papier, un test pour la transcription bactérienne générale a été décrite. essais de transcription combinés avec un gel de séquençage électrophorèse des transcrits sont très importants pour …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Materials

Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)  Sigma-Aldrich  T9281
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

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Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

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