Summary

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Abstract

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos e amplamente utilizados durante muitos anos para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na transcrição. Este processo requer múltiplas subunidades de polimerase de ADN dependente de ARN (RNAP) e uma série de factores de transcrição que actuam para modular a actividade de RNAP durante a expressão do gene. eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos radiomarcados é usado para fornecer informações mecanicista detalhadas sobre como rendimentos de transcrição e quais parâmetros podem afetá-lo. Neste artigo descrevemos o protocolo para estudar como o factor de alongamento essencial NusA regula a pausa de transcrição, bem como um método para identificar um agente antibacteriano alvo de iniciação de transcrição através da inibição da formação holoenzyme RNAP. Estes métodos podem ser usados ​​como uma plataforma para o desenvolvimento de abordagens adicionais para explorar o mecanismo de acção dos factores de transcrição que ainda permanecem incertos, bem como novos agen antibacterianats alvo de transcrição que é um alvo da droga subutilizados em pesquisa e desenvolvimento de antibióticos.

Introduction

A transcrição é o processo em que o ARN é sintetizado a partir de um molde de ADN específica. Em células eucariotas, existem três RNAPs distintas: eu RNAP transcreve precursores de rRNA, RNAP II é responsável pela síntese de ARNm e de certos RNAs nucleares pequenos, e a síntese de rRNA 5S e tRNA é realizada por RNAP III. Em bactérias, existe apenas uma RNAP responsável pela transcrição de todas as classes de ARN. Existem três fases de transcrição: iniciação, alongamento e terminação. A transcrição é um dos processos mais altamente reguladas na célula. Cada etapa do ciclo de transcrição representa um ponto de verificação para a regulação da expressão do gene 1. Para a iniciação, RNAP tem de se associar com um factor sigma para formar holoenzima, o que é necessário para dirigir a enzima para locais específicos chamados promotores de 2 para formar um complexo promotor aberta. Posteriormente, um grande conjunto de fatores de transcrição são responsáveis ​​pela regulação oatividades f RNAP durante as fases de alongamento e terminação. O fator de transcrição aqui examinado é a proteína altamente conservada e essencial, Nusa. Ele está envolvido na regulação da transcrição e a pausa de terminação, bem como anti-terminação durante a síntese de rRNA 3-5.

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos como poderosas ferramentas para estudar os passos de regulação complexos durante a transcrição 6. Em geral, um fragmento linear de ADN incluindo uma região promotora é necessária como molde para a transcrição. O molde de ADN é normalmente gerado por PCR ou por linearização um plasmídeo. proteínas e os NTP (incluindo uma NTP marcado radioactivamente para fins de detecção) purificados são então adicionados e produto analisado a seguir ao período de incubação necessário. Usando modelos apropriados e condições de reacção, todas as etapas de transcrição foram examinadas utilizando esta abordagem, o que permitiu a caracterização molecular detalhada da transcription ao longo do último meio século 7. Em combinação com a informação sobre a estrutura 3-dimensional da RNAP Também foi possível investigar o mecanismo molecular da inibição da transcrição pelos antibióticos e conduz a antibióticos, e utilizar essa informação para o desenvolvimento de novas e melhores drogas 8-10.

Neste trabalho fornecem exemplos de como ensaios de transcrição pode ser usada para determinar o mecanismo de regulação da transcrição por alongamento / factor de terminação NusA, e a forma como o mecanismo de acção de um inibidor da ligação de iniciação da transcrição podem ser determinados novos.

Protocol

Cuidado: As experiências envolvem o uso do isótopo radioactivo 32 P e nenhum trabalho deve ser realizado até que tenham sido cumpridas todas as condições de segurança adequadas. Geralmente são necessárias de pessoal para participar de um curso de segurança e submetidos a prática supervisionada antes experimentos utilizando reagentes radioativos. Por favor, usar equipamento de proteção individual (dosímetro termoluminescente, óculos de segurança, luvas, sala de radiação jalecos, calças de comprimento total, fecho…

Representative Results

eficiência da transcrição pode ser determinada pela medição do nível de radiação nas bandas a diferentes pontos de tempo. O ensaio parando para testar a função do fator NusA visualização da pausa, terminação habilitada, e produtos (Figura 1A) run-off. Na presença do domínio N-terminal de NusA (NTD NusA; resíduos de aminoácidos 1-137), a aparência dos produtos de ARN foi significativamente retardado em comparação com a experiência de controlo sem Nus…

Discussion

Em todos os organismos, a transcrição é um processo fortemente regulado. Os ensaios in vitro de transcrição têm sido desenvolvidos para proporcionar uma plataforma para testar os efeitos de factores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores da transcrição. Neste trabalho método, foi descrito um ensaio para a transcrição bacteriana geral. ensaios de transcrição combinados com eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos são muito importantes para estudos sobre os mecanismo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Materials

Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)  Sigma-Aldrich  T9281
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

References

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Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

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