Summary

Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte

Published: June 30, 2017
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Summary

Ein ursprünglicher experimenteller Aufbau zum Erwärmen von Zellen in einer Kulturschale unter Verwendung von 1,94 μm kontinuierlicher Laserstrahlung wird hier eingeführt. Mit dieser Methode können die biologischen Reaktionen von retinalen Pigmentepithel- (RPE) -Zellen nach unterschiedlichen thermischen Expositionen untersucht werden.

Abstract

Ein originelles Verfahren zur Erwärmung von kultivierten Zellen mit einem 1,94 μm kontinuierlichen Thulium-Laser für die biologische Beurteilung wird hier vorgestellt. Die Thulium-Laserstrahlung wird stark von Wasser absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden durch thermische Diffusion erwärmt. Eine Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm wird etwa 12 cm oberhalb der Kulturschale ohne jegliche Optik eingestellt, so dass der Laserstrahldurchmesser nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) entspricht. Indem man in jedem Experiment eine konsistente Menge an Kulturmedium hält, ist es möglich, die Zellen mit einer hoch reproduzierbaren Temperaturerhöhung zu bestrahlen.

Um die Temperaturerhöhung und ihre Verteilung in einer Zellkulturschale für jede Leistungseinstellung zu kalibrieren, wurde die Temperatur während 10 s der Bestrahlung an verschiedenen Positionen und auf zellulärer Ebene gemessen. Die Temperaturverteilung wurde mit einer mathematischen Grafiksoftware dargestelltProgramm, und sein Muster über die Kulturschale war in Gaußsche Form. Nach der Laserbestrahlung konnten verschiedene biologische Experimente durchgeführt werden, um temperaturabhängige Zellreaktionen zu bestimmen. In diesem Manuskript wird die Viabilitätsfärbung ( dh die Unterscheidung von lebenden, apoptotischen und toten Zellen) eingeführt, um die Schwellentemperaturen für die Zellapoptose und den Tod nach verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen.

Die Vorteile dieser Methode sind die Präzision der Temperatur und die Zeit des Heizens sowie die hohe Effizienz bei Heizzellen in einer ganzen Zellkulturschale. Darüber hinaus ermöglicht es das Studium mit einer Vielzahl von Temperaturen und Zeitdauern, die durch ein computerisiertes Betriebssystem gut kontrolliert werden können.

Introduction

Das Verständnis der temperaturabhängigen zellbiologischen Reaktionen ist für erfolgreiche Hyperthermie-Behandlungen von großer Bedeutung. Retinale Laser-Photokoagulation mit einem thermischen Laser, in der Ophthalmologie verwendet, ist eine der etabliertesten Laser-Behandlungen in der Medizin. Sichtbares Licht, meist von grün bis gelb Wellenlängen, wird in der Netzhaut Laserbehandlung verwendet. Das Licht wird durch das Melanin in retinalen Pigment-Epithel- (RPE-) Zellen stark absorbiert, die die äußerste Zellmonoschicht der Retina bilden. Es gab jüngstes Interesse bei Ärzten und Forschern in einer sehr milden thermischen Bestrahlung (sub-sichtbare Photokoagulation) als neue therapeutische Strategie für verschiedene Arten von Netzhautstörungen 1 , 2 . Nach diesem Trend liegt unser Interesse an der sub-letalen Erwärmung von RPE-Zellen unter präziser Temperaturregelung, einer Technik namens temperaturgesteuerte photothermische Therapie (TC-PTT).

Neueste optoAkustiktechnologie aus unserem Institut hat die Echtzeitmessung von Temperaturerhöhungen an bestrahlten Stellen in der Netzhaut ermöglicht. Dies ermöglicht die Kontrolle über die Temperaturerhöhung während der Bestrahlung 3 . Da jedoch eine sub-letale Hyperthermie auf der Netzhaut, die durch das Erhitzen von RPE-Zellen sub-lethally verursacht wurde, bisher aufgrund der Unmöglichkeit der Messung und Kontrolle der Temperatur nicht berücksichtigt wurde, haben die temperaturabhängigen Zellreaktionen von RPE-Zellen nach der thermischen Laserbestrahlung Wurde bislang sehr wenig studiert. Darüber hinaus wurde nicht nur die Temperaturdifferenz nicht im Detail diskutiert, sondern auch der Unterschied im Zellverhalten der überlebenden Zellen nach sub-letaler und tödlicher Bestrahlung. Um wissenschaftliche Erkenntnisse über TC-PTT-basierte Behandlungen zu sammeln, wollen wir die temperaturabhängigen biologischen Reaktionen der RPE-Zelle und ihre Mechanismen unter Verwendung von in vitro- Versuchsaufbauten erläutern.

Für tSein Zweck ist es notwendig, einen Zelle-Heizungsaufbau herzustellen, der die folgenden Bedingungen erfüllt: 1) eine Möglichkeit für schnelle Temperaturerhöhungen, 2) eine präzise kontrollierte Zeit und Temperatur und 3) eine relativ hohe Anzahl von untersuchten Zellen für biologische Experimente . Hinsichtlich des Heizverfahrens ist ein klinischer Laser, wie ein frequenzverdoppelter Nd.YAG-Laser (532 nm), leider für die Zellkulturerwärmung ungeeignet. Dies liegt an der stark reduzierten Anzahl von Melanosomen in kultivierten RPE-Zellen. Die Laserlichtabsorption könnte inhomogen sein, und die Temperaturerhöhung auf zellulärer Ebene ist zwischen den Experimenten variabel, auch wenn sie mit derselben Strahlungsleistung bestrahlt wird. Mehrere frühere Studien berichteten über die Verwendung von schwarzem Papier unter dem Tellerboden während der Bestrahlung 4 oder die Verwendung von zusätzlichen Melanosomen, die vor den Experimenten 5 , 6 durch die Kulturzellen phagozytiert werden. Viele vonDie in vitro biologischen Studien zur Beurteilung von hyperthermieinduzierten Zellreaktionen wurden unter Verwendung einer Kochplatte, eines Wasserbades oder eines CO 2 -Inkubators mit einer Temperatureinstellung 7 durchgeführt . Diese Verfahren erfordern eine lange Heizperiode, da es einige Zeit dauert ( dh mehrere Minuten), um die gewünschte Temperatur zu erreichen. Weiterhin ist es mit diesen Verfahren schwierig, auf zellulärer Ebene eine detaillierte thermische Geschichte ( dh Temperatur multipliziert mit der Zeit) zu erhalten. Darüber hinaus kann sich die Temperatur unter den Zellen an verschiedenen Positionen in einer Kulturschale aufgrund der variablen Temperaturdiffusion unterscheiden. In den meisten Fällen wurde diese zeitliche und räumliche Temperaturinformation während der Hyperthermie bei biologischen Analysen nicht berücksichtigt, obwohl die biologische Zellreaktion durch die Temperatur und die Zeitdauer der erhöhten Temperatur kritisch beeinflusst werden kann.

Um diese Probleme zu überwinden,Dünnwellen-Thulium-Laser wurde hier verwendet, um die Zellen zu erhitzen. Die Thulium-Laserstrahlung (λ = 1,94 μm) wird stark von Wasser 8 absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden ausschließlich durch thermische Diffusion thermisch stimuliert. Die Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm ist etwa 12 cm über der Kulturschale, ohne jegliche Optik. Der Laserstrahldurchmesser divergiert so, dass er nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) an der Oberfläche des Kulturmediums entspricht. Mit einer konsistenten Menge an Kulturmedium ist es möglich, die Zellen mit der Temperaturerhöhung zu bestrahlen Von hoher Wiederholbarkeit. Variable Leistungseinstellungen ermöglichen die Bestrahlung mit bis zu 20 W und die mittlere Temperatur auf zellulärer Ebene kann bis zu ΔT ≈ 26 ° C in 10 s erhöht werden.

Durch Modifizieren der Bestrahlungsbedingungen ist es auch möglich, das Laserstrahlprofil zu ändern, um die Temperaturverteilung zu variierenIn einer Kulturschale. So ist es beispielsweise möglich, mit einer Gauß-artigen Temperaturverteilung wie in der aktuellen Studie oder mit einer homogenen Temperaturverteilung zu untersuchen. Letzteres kann für die Untersuchung der Effekte von temperaturabhängigen Zellreaktionen genauer für subtotale Temperaturerhöhungen, aber nicht für Zelltodstress oder Wundheilungsreaktionen vorteilhaft sein.

Insgesamt kann die Thulium-Laser-Bestrahlung die Untersuchung verschiedener Arten von biologischen Faktoren wie Gen / Protein-Expression, Zelltodkinetik, Zellproliferation und Zellfunktionalität nach verschiedenen thermischen Expositionen ermöglichen.

Protocol

1. RPE-Zellkultur Isolierung von RPE-Zellen aus Schweineaugen Erhalten Sie frisch entkernte Schweineaugen aus dem örtlichen Schlachthaus. Halten Sie sie kühl (4 ° C) und in einer dunklen Umgebung. Entfernen Sie extrazelluläre Gewebe mit einer Schere und tränken Sie die Augen in einer antiseptischen Lösung für 5 min. Legen Sie die Augen in sterilisiertem phosphatgepufferten Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS (-)) bis zur Verwendung. Mi…

Representative Results

Temperaturverteilung nach verschiedenen Leistungseinstellungen Alle Temperaturentwicklungen für jede einzelne Bestrahlung wurden bei der Temperaturkalibrierung überwacht. Aus diesen Daten wurde die maximale Temperatur am gemessenen Punkt erhalten und als T max (° C) definiert. Wie in Fig. 3A gezeigt , wurde das Programm zu dem Zeitpunkt ausgeführt, an dem die Kulturschale auf die Heizp…

Discussion

Bei der Erörterung von temperaturbedingten biologischen Zellreaktionen ist nicht nur die Temperatur, sondern auch die Zeitdauer der erhöhten Temperatur von Bedeutung, da die meisten biochemischen Prozesse zeitabhängig sind. Besonders auf dem Gebiet der laserinduzierten Hyperthermie in der Ophthalmologie ist es aufgrund des kurzen Zeitbereichs – von Millisekunden bis zu Sekunden – schwierig, zelluläre thermische Effekte mit präziser Temperaturkontrolle zu untersuchen. Daher ist ein Laserbestrahlungsaufbau, der für …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von einem Forschungsstipendium des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Zuschuss Nr. 13GW0043C) und einem Europäischen Amt für Luft- und Raumfahrtforschung und -entwicklung (EOARD, Grant # FA9550-15-1-0443) unterstützt.

Materials

Reagents
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796-500ML Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use.
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955-100ML Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.
Sodium pyruvate (100 mM) Sigma-Aldrich S8636-100ML Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)
Porcine serum Sigma-Aldrich 12736C-500ML Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
Trypsin from porcine pancreas Sigma-Aldrich T4799-25G
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich ED-100G
Human VEGF Quantikine ELISA Kit R&D System DVE00
Oxiselect Total Glutathione Assay Kit Cell Biolabs, Inc STA-312
Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit PromoKine PK-CA707-30018
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Thulium laser Starmedtec GmbH Prototype 0-20 W
365 mm core diameter fiber LASER COMPONENTS Germany CF01493-52
Thermocouple Omega Engineering Inc HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M
Heating plate MEDAX
Microplate reader (spectrofluorometer) Molecular Device Spectramax M4
cell homogenizer QIAGEN TissueLyser LT
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE Ti
mathematical software program The Mathworks. Inc MATLAB Release 2015b
system-design platform National Instrument Labview Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench

References

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Cite This Article
Miura, Y., Pruessner, J., Mertineit, C. L., Kern, K., Muenter, M., Moltmann, M., Danicke, V., Brinkmann, R. Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects. J. Vis. Exp. (124), e54326, doi:10.3791/54326 (2017).

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