Hier wordt een originele experimentele opstelling voor het verwarmen van cellen in een cultuurschotel met behulp van 1,94 μm continu-wave laserstraling geïntroduceerd. Met behulp van deze methode kunnen de biologische reacties van retinale pigmentepitheliale cellen (RPE) na verschillende thermische blootstellingen worden onderzocht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Continu-golf Thulium Laser voor Verwarming Cultured Cells om Cellulaire Thermal Effecten te onderzoeken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier wordt een originele methode voor het verwarmen van gekweekte cellen met behulp van een 1,94 μm continu-golf thuliumlaser voor biologische beoordeling. Thulium laserstraling wordt sterk geabsorbeerd door water en de cellen aan de onderkant van de kweekschotel worden verwarmd door thermische diffusie. Een laservezel met een diameter van 365 μm is ongeveer 12 cm boven de kweekbak geplaatst, zonder optica, zodat de laserbundeldiameter bijna gelijk is aan de binnendiameter van de kweekschotel (30 mm). Door in elk experiment een consistente hoeveelheid kweekmedium te houden, is het mogelijk om de cellen te irradieren met een zeer reproduceerbare temperatuurverhoging.
Om de temperatuurverhoging en de verdeling ervan in één celcultuurschotel te kalibreren voor elke vermogensinstelling, werd de temperatuur gedurende 10 seconden bestraald bij verschillende posities en op het cellulaire niveau. De temperatuurverdeling werd weergegeven met behulp van een wiskundige grafische softwareProgramma, en het patroon over de cultuurschotel was in Gaussische vorm. Na laserbestraling kunnen verschillende biologische experimenten worden uitgevoerd om temperatuurafhankelijke celreacties te beoordelen. In dit manuscript wordt levensvatbaarheidsverf ( dwz onderscheiden van levende, apoptotische en dode cellen) geïntroduceerd om de drempeltemperaturen voor celapoptose en de dood na verschillende tijdstippen te bepalen.
De voordelen van deze methode zijn de precisie van de temperatuur en de tijd van verwarming, evenals het hoge rendement bij het verwarmen van cellen in een hele celcultuurschotel. Bovendien staat het in staat om te studeren met een grote variëteit aan temperaturen en tijdsduur, die goed gecontroleerd kan worden door een geautomatiseerd besturingssysteem.
Inleiding
Het begrijpen van temperatuurafhankelijke celbiologische reacties is van groot belang voor succesvolle hyperthermiebehandelingen. Retinale laserfotocoagulatie met een thermische laser, gebruikt in oogheelkunde, is een van de meest opgestelde laserbehandelingen in de geneeskunde. Zichtbaar licht, meestal van groene tot gele golflengten, wordt gebruikt in retinale laserbehandeling. Het licht wordt sterk geabsorbeerd door de melanine in retinale pigmentepitheliale (RPE) cellen, die de buitenste celmonolaag van het netvlies vormen. Er is recente interesse geweest bij artsen en onderzoekers bij zeer zachte thermische bestraling (sub-zichtbare fotocoagulatie) als een nieuw....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. RPE Cell Culture
- Isolatie van RPE-cellen uit de ogen van de varkens
- Verkrijg verse enucleated porcine ogen van het lokale slachthuis. Houd ze koel (4 ° C) en in een donkere omgeving.
- Verwijder extracellulaire weefsels met een schaar en week de ogen in een antiseptische oplossing gedurende 5 minuten.
- Plaats de ogen in gesteriliseerde fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS (-)) tot gebruik.
- Door middel van een scalpel dringt u de sclera ongeveer 5 mm achter de corneale limbus in. Resect het hele voorste gedeelte van het oog door middel van een schaar doorheen, parallel met d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Temperatuurverdeling na verschillende stroominstellingen
Alle temperatuurontwikkelingen voor elke enkele bestraling werden gecontroleerd bij de temperatuurkalibratie. Uit deze gegevens werd de maximale temperatuur op het gemeten punt verkregen en gedefinieerd als T max (° C). Zoals getoond in Figuur 3A , werd het programma uitgevoerd op het tijdstip wanneer de kweekschotel op de verwarming.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij het bespreken van temperatuurgerelateerde biologische cellulaire reacties is niet alleen de temperatuur, maar ook de tijdsduur van de verhoogde temperatuur van belang, aangezien de meeste biochemische processen tijdafhankelijk zijn. Met name op het gebied van lasergeïnduceerde hyperthermie in oogheelkunde, door het korte tijdsbestek van milliseconden tot seconden, is het moeilijk om celthermische effecten te onderzoeken met precieze temperatuurregeling. Daarom is een laserbestralingsopstelling geschikt voor het celc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbijdrage van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (subsidie # 13GW0043C) en en een Europees Bureau voor Ruimtevaart Onderzoek en Ontwikkeling (EOARD, subsidie # FA9550-15-1-0443)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - hoge glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Voeg (2)-(4) toe voor gebruik. Verwarm in een waterbad van 37 °C voor gebruik. |
| Antibioticum Antimycotic-oplossing (100 ×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Bevat 10.000 eenheden penicilline, 10 mg streptomycine en 25 μg Amphotericin B in 1mL. Voeg 5,5 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik. |
| Natriumpyruvaat (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Voeg 5,5 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik (eindconcentratie: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Voeg 50 mL toe in 500 mL mediumfles (1) voor gebruik (eind: 10%) |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsine uit varkenspancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Etheen-diaminetetraazijnzuur (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA-kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay-kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotische/Nekrotiserende/Gezonde cellen detectie-kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Utrusting | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm kerndiametervezel | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermokoppel | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Verwarmingsplaat | MEDAX | ||
| Microplaatlezer (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| Celhomogenisator | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescentiemicroscoop | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| wiskundig softwareprogramma | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| systeem-ontwerpplatform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
Referenties
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
