सेलुलर थर्मल इफेक्ट्स की जांच के लिए हीटिंग संचित कोशिकाओं के लिए लगातार-लहर थुलीयम लेजर
Summary
1.94 सुक्ष्ममापी निरंतर तरंग लेजर विकिरण का उपयोग करते हुए एक संस्कृति पकवान में गरम कोशिकाओं के लिए एक मूल प्रायोगिक सेटअप पेश किया गया है। इस पद्धति का प्रयोग करते हुए, विभिन्न थर्मल एक्सपोजर के बाद रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं के जैविक प्रतिक्रियाओं की जांच की जा सकती है।
Abstract
जैविक मूल्यांकन के लिए 1.94 सुक्ष्ममापी निरंतर तरंग थ्यूलियम लेजर का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं को गर्मी के लिए एक मूल विधि यहां प्रस्तुत की गई है। थुलीयम लेजर विकिरण को पानी से जोरदार रूप से अवशोषित किया जाता है, और संस्कृति डिश के निचले भाग में कोशिकाओं को थर्मल प्रसार के माध्यम से गरम किया जाता है 365 सुक्ष्ममापी व्यास के साथ एक लेजर फाइबर संस्कृति डिश के ऊपर से 12 सेमी ऊपर किसी भी प्रकाशिकी के बिना सेट किया जाता है, जैसे कि लेजर बीम व्यास संस्कृति डिश (30 मिमी) के भीतरी व्यास के बराबर है। प्रत्येक प्रयोग में सांस्कृतिक माध्यम की लगातार मात्रा रखते हुए, कोशिकाओं को अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तापमान वृद्धि के साथ विकिरण करना संभव है।
प्रत्येक शक्ति सेटिंग के लिए एक सेल कल्चर डिश में तापमान में वृद्धि और इसके वितरण को जांचने के लिए, तापमान 10 डिग्री के विकिरण के दौरान विभिन्न स्थानों पर और सेलुलर स्तर पर मापा गया। एक गणितीय ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तापमान वितरण का प्रतिनिधित्व किया गया थाकार्यक्रम, और संस्कृति डिश भर में इसका पैटर्न गाऊसी रूप में था। लेजर विकिरण के बाद, तापमान पर निर्भर सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए विभिन्न जैविक प्रयोग किए जा सकते हैं। इस पांडुलिपि में, समय के विभिन्न बिंदुओं के बाद सेल एपोपोसिस और मौत के लिए थ्रेसहोल्ड तापमान निर्धारित करने में मदद करने के लिए व्यवहार्यता धुंधला हो जाना ( यानी, जीवित, अपोपचारिक और मृत कोशिकाओं को भेद करना) पेश किया गया है।
इस पद्धति के फायदे तापमान और हीटिंग के समय की सटीकता, साथ ही एक पूरे सेल कल्चर डिश में ताप कोशिकाओं में इसकी उच्च क्षमता है। इसके अलावा, यह तापमान और समय के विभिन्न प्रकारों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, जो कम्प्यूटरीकृत ऑपरेटिंग सिस्टम द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।
Introduction
तापमान-आश्रित कोशिका को समझना जैविक प्रतिक्रिया सफल हाइपरथर्मिया उपचारों के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। ऑप्थाल्मोलॉजी में प्रयुक्त थर्मल लेजर के साथ रेटिना लेजर फोटोकॉएग्यूलेशन, दवा में सबसे अधिक स्थापित लेजर उपचारों में से एक है। दर्शनीय प्रकाश, ज्यादातर हरे रंग से पीले तरंग दैर्ध्य के लिए, रेटिना लेजर उपचार में प्रयोग किया जाता है। रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं में मेलेनिन द्वारा प्रकाश को अत्यधिक अवशोषित किया जाता है, जो रेटिना के सबसे बाहरी सेल मोनोलायर होते हैं। बहुत हल्के विकिरण (उप दृश्यमान फोटोकॉएग्यूलेशन) में चिकित्सकों और शोधकर्ताओं के बीच हाल ही में दिलचस्पी हुई है कि रेटिना संबंधी विकार 1 , 2 के विभिन्न प्रकारों के लिए एक नई चिकित्सीय रणनीति के रूप में। इस प्रवृत्ति के बाद, हमारे हित, सटीक तापमान नियंत्रण के तहत उप-घातक हीटिंग आरपीईई कोशिकाओं में है, जिसे तापमान-नियंत्रित फोटोथर्मल थेरेपी (टीसी-पीटीटी) कहते हैं।
हाल के ऑप्टोहमारे संस्थान के ध्वनिक प्रौद्योगिकी ने रेटिना में विकिरणित साइटों पर तापमान बढ़ने की वास्तविक-समय माप के लिए अनुमति दी है। यह विकिरण 3 के दौरान तापमान में वृद्धि पर नियंत्रण को सक्षम बनाता है हालांकि, आरटीई कोशिकाओं को उप-घातक रूप से हीटिंग के कारण रेटिना पर उप-घातक हाइपरथेरिया, तापमान को मापने और नियंत्रित करने की असंभवता से पहले नहीं माना गया है, थर्मल लेजर विकिरण के बाद आरपीई कोशिकाओं के तापमान पर निर्भर सेल प्रतिक्रियाएं तिथि करने के लिए बहुत कम अध्ययन किया गया है। इसके अलावा, न केवल तापमान के अंतर पर विस्तार से चर्चा की गई है, बल्कि उप-घातक और घातक विकिरण के बाद जीवित कोशिकाओं के सेल व्यवहार में अंतर भी शामिल नहीं है। इसलिए, टीसी-पीटीटी-आधारित उपचार पर वैज्ञानिक प्रमाणों को इकट्ठा करने के लिए, हम इन-विट्रो प्रयोगात्मक सेटअप में तापमान-निर्भर आरपीई सेल जैविक प्रतिक्रियाओं और उनके तंत्र को स्पष्ट करने के उद्देश्य हैं।
टी के लिएउनका उद्देश्य, सेल-हीटिंग सेटअप स्थापित करने के लिए आवश्यक है जो निम्नलिखित शर्तों को पूरा करता है: 1) तेजी से तापमान बढ़ने की संभावना, 2) ठीक से नियंत्रित समय और तापमान, और 3) जैविक प्रयोगों के लिए जांच की गई कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या । हीटिंग विधि के बारे में, एक नैदानिक लेजर, जैसे कि आवृत्ति-दोगुनी एनडी। वाईएजी लेजर (532 एनएम), दुर्भाग्य से सेल संस्कृति हीटिंग के लिए अनुपयुक्त है। यह सुसंस्कृत RPE कोशिकाओं में मेलेनोसॉम्स की दृढ़ता से कम संख्या के कारण है। लेजर प्रकाश अवशोषण अछाल हो सकता है, और सेलुलर स्तर पर तापमान में वृद्धि प्रयोगों के बीच चरखी होती है, भले ही एक ही विकिरण शक्ति से विकिरण हो। पिछले कई अध्ययनों में विकिरण 4 के दौरान डिश के नीचे काली कागज के प्रयोग की सूचना दी गई है या प्रयोगात्मक 5 , 6 से पहले संस्कृति कोशिकाओं द्वारा फागोगिटाइज किए गए अतिरिक्त मेलेनोसॉम्स के उपयोग के बारे में बताया है। के कईहाइपरथेरिया से प्रेरित सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इन विट्रो जैविक अध्ययनों को एक गर्म प्लेट, एक पानी के स्नान या तापमान सेटिंग 7 के साथ सीओ 2 इनक्यूबेटर का उपयोग कर किया गया है। इन विधियों को एक लंबी हीटिंग अवधि की आवश्यकता होती है क्योंकि वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए कुछ समय ( यानी, कुछ मिनट) लगते हैं। इसके अलावा, इन विधियों का उपयोग करते हुए, सेलुलर स्तर पर एक विस्तृत थर्मल इतिहास ( यानी, समय से तापमान गुणा) प्राप्त करना मुश्किल है। इसके अलावा, एक संस्कृति डिश में विभिन्न स्थानों पर कोशिकाओं के बीच का तापमान चर तापमान प्रसार के कारण भिन्न हो सकता है। अधिकांश मामलों में, जैविक विश्लेषण के लिए जैविक सेल प्रतिक्रिया को गंभीर रूप से प्रभावित किया जा सकता है, जबकि तापमान और तापमान बढ़ने की अवधि के दौरान, hyperthermia के दौरान इस अस्थायी और स्थानिक तापमान जानकारी जैविक विश्लेषण के लिए विचार नहीं किया गया है।
इन समस्याओं को दूर करने के लिए, एक contiनुकीली लहर थ्यूलियम लेजर कोशिकाओं को गर्म करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था। थ्यूलियम लेजर विकिरण (λ = 1.94 सुक्ष्ममापी) को दृढ़ता से 8 पानी से अवशोषित किया जाता है, और संस्कृति डिश के निचले भाग में कोशिकाओं को थर्मल प्रसार के माध्यम से पूरी तरह प्रेरित किया जाता है। 365-माइक्रिया व्यास वाले लेजर फाइबर को संस्कृति डिश के ऊपर से 12 सेमी ऊपर सेट किया जाता है, बिना किसी प्रकाशिकी के। लेजर बीम का व्यास इस तरह बदल जाता है कि संस्कृति संस्कृति की सतह पर लगभग 30 मिलीमीटर संस्कृति डिश के समान है। संस्कृति के माध्यम के अनुरूप मात्रा के साथ, तापमान वृद्धि के साथ कोशिकाओं को विकिरण करना संभव है उच्च पुनरावृत्ति की वैरिएबल पावर सेटिंग्स 20 डब्ल्यू के साथ विकिरण को सक्षम करती हैं, और सेलुलर स्तर पर मध्यम तापमान 10 एस में ΔT ≈ 26 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जा सकता है
विकिरण की स्थिति को संशोधित करके, तापमान के वितरण में बदलाव के लिए लेजर बीम प्रोफाइल को बदलना भी संभव हैएक संस्कृति डिश में उदाहरण के लिए, गौसी जैसे तापमान वितरण की जांच करना संभव है, जैसा कि वर्तमान अध्ययन में है, या एक समरूप तापमान वितरण के साथ। उत्तरार्द्ध तापमान पर निर्भर सेल प्रतिक्रियाओं के अधिक विशेष रूप से उप घातक तापमान बढ़ने के प्रभावों की जांच के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन सेल मृत्यु तनाव या घाव भरने वाले प्रतिक्रियाओं के लिए नहीं।
कुल मिलाकर, थ्यूलियम लेजर विकिरण विभिन्न थर्मल एक्सपोजर के बाद विभिन्न प्रकार के जैविक कारकों की जांच, जैसे कि जीन / प्रोटीन अभिव्यक्ति, कोशिका मृत्यु कैनेटीक्स, सेल प्रसार, और सेल कार्यक्षमता विकास की जांच कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
तापमान से संबंधित जैविक सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर चर्चा करते हुए, न केवल तापमान, बल्कि तापमान में वृद्धि की अवधि भी महत्त्वपूर्ण है, क्योंकि अधिकांश जैव रासायनिक प्रक्रियाएं समय-निर्भर हैं। विशेष रूप ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ़ एजुकेशन एंड रिसर्च (बीबीएफएफ) (अनुदान # 13GW0043C) और एक यूरोपीय कार्यालय ऑफ एरोस्पेस रिसर्च एंड डेवलपमेंट (ईओएडीएडी, # एफएएम 9550-15-1-0443 अनुदान) से किया गया था।
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
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