פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.
תאים הנדסה עם מיקרו / חלקיקי ננו פעילים בעלי מרכיבים טעונים (NPS) הופך פופולארי יותר ויותר בשיטה כדי לשפר תכונות טיפוליות הילידים, לאפשר הדמיה ביו ולשלוט פנוטיפ התא. סוגיה קריטית עדיין התייחסה כראוי היא המספר המשמעותי של חלקיקים שנותרו מאוגד לאחר תיוג תא אשר לא ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה קונבנציונלי. זה מוביל לעלייה רעשי רקע הדמיה ביו יכול להקנות ההשפעה הטרנספורמטיבית על תאי היעד הלא שכנות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה חילופית חיץ מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית כפי שכונתה חלוקת זרימת דין (DFF) להפריד תאי שכותרתו ביעילות צירופים חינם באופן תפוקה גבוה. Microdevice הספירלה שפותח מסייע באיסוף רציף (> התאוששות תא 90%) של תאים מטוהרים (THP-1 ו MSCs) מרחפי פתרון חיץ חדש, תוך השגה> 95 דלדול% של צבע פלואורסצנטי מאוגד או צירופים טעונים לצבוע (silICA או PLGA). בשלב יחיד זה, אסטרטגית טיהור מבוססת תאי גודל מאפשרת קצב העברת נתוני עיבוד תא גבוה (10 6 תאים / min) והוא שימושי מאוד עבור טיהור תא גדול בנפח של תאים מהונדסי מייקרו / ננו-חלקיקים כדי להשיג יישום קליני ללא התערבות.
סוכן טעון מייקרו / חלקיקי הנדסת תאים על ידי (NPS) היא שיטה פשוטה, גנומית אינטגרציה נטולה, צדדי כדי לשפר יכולת bioimaging ומגביר / להשלים התכונות הטיפוליות המקוריות שלו ברפואת רגנרטיבית. 1-3 שינויים סלולריים מושגות על ידי תיוג קרום או הציטופלסמה פלזמה עם ריכוז עודף של צירופים טעון סוכן להרוות את אתרי הקישור. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כמויות משמעותיות של חלקיקים מאוגד הנותרים בתמיסה לאחר תהליכי תיוג תא, אשר יכולים לבלבל זיהוי מדויק של תאים מהונדסים חלקיק או לסבך תוצאות טיפוליות. 4,5 בנוסף, חשיפה צירופים המכילים טרנספורמטיבי סוכנים (גורמי גדילה, סטרואידים, וכו ') בריכוז גבוה יתר על מידה יכולים לגרום cytotoxicity וחשיפה שגויה עלולים לגרום לתוצאות בלתי צפויות על תאים שאינם יעד. אפילו נושאות חלקיקים המהווים of "ביולוגיים" חומרים [למשל, פולי (שיתוף גליקולית לקטית חומצה), PLGA] יכולים להסית תגובות תא חיסוניות חזקות בתנאים מסוימים גם כן. 6 זה מסוכן במיוחד אצל אנשים עם חסינות לקויה (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות) אשר באופן פוטנציאלי עיכובים אישור nanoparticle מערכתי. 7 לכן, ההסרה ביותר של חלקיקים חינם לפני כניסתה של תאים מהונדסי חלקיקים הוא בעלת חשיבות רבה כדי למזער פרופיל רעיל ולהפחית חשיפה שגויה לחלקיקים טעוני סוכן in vivo.
צנטריפוגה שיפוע הקונבנציונלית משמשת לעתים קרובות כדי להפריד תאים מהונדסים מחלקיקים בחינם אבל הוא מייגע ומופעלת במצב יצווה. יתר על כן, מדגישה גזירה שחווה תאים במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה ואת המרכיבים של מדיום שיפוע צפיפות עשויה להתפשר על יושרת תא ו / או התנהגות תא שפעה. 8 מיקרופלואידיקה היא חלופה אטרקטיבית עם sevטכנולוגיות הפרדה eral כולל תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 ו acoustophoresis 12 פיתח להפרדת חלקיקים קטנים ויישומים חילופי חיץ. עם זאת, שיטות אלו סובלים תפוקה נמוכה (1-10 μl · דק '- 1) והם מועדים סתימת בעיות. פרדות Active כגון שיטות מבוססות dielectrophoresis דורשות גם הבדלים פנוטיפים תא dielectrophoretic מהותי או צעדי תיוג תא נוספים כדי להשיג פרדה. גישה מבטיחה יותר כרוכה מיקרופלואידיקה אינרציה – ההגירה לרוחב של חלקיקים או תאים ברחבי מייעל להתמקד בעמדות נבדלות בשל כוחות להרים דומיננטיים (L F) בבית המספר ריינולדס גבוה (Re) 13 בשל תנאי הזרימה הגבוהה שלה ברזולוצית גודל מעולה. , שהוא נוצל לעתים קרובות להפרדה מבוססת תאים בגודל 14,15 ויישומים חילופים חיץ. 16-18 However, ביצועי חיץ חליפין נשארו עניים עם ~10-30% פתרון מזהם כמו התאים המופרדים בדרך כלל להישאר קרוב לגבול בין תמיסות בופר המקוריות וחדשני. 16-18 יתרה מכך, חלוקת הגודל של תאי יעד צריכה להיות דומה כדי להשיג אינרציה מדויקת התמקדות והפרדה מפתרון החיץ המקורי שמהווה בעיה במיוחד בעיבוד של סוגי תאים הטרוגנית בגודל כגון בתאי גזע mesenchymal (MSCs). 19
פתחנו בעבר תא מיקרופלואידיקה אינרציה חדשה טכניקת מיון כינה הדין חלוקה זרימה (DFF) לבידוד תאים סרטניים במחזור (CTCs) 20 וחיידקים 21 מדם כולו באמצעות מכשיר microchannel ספירלת 2-כניסה, 2-לשקע. בפרוטוקול הווידאו הזאת, נתאר את התהליך של THP-1 תיוג (שורת תאים monocytic חריפה האדם לוקמיה) תאים monocytic ההשעיה (~ 15 מיקרומטר) ו MSCs (10-30 מיקרומטר) עם calcein-lצירופי oaded, ואחריו ייצור ותפעול של microdevice ספירלת DFF עבור התאוששות יעילה של תאים שכותרתו והסרת צירופים מאוגדים. 22 אסטרטגיה לטיהור בצעד אחד זה מאפשרת התאוששות מתמשכת של השעיה שכותרתו תאים חסידים המרחפים פתרון חיץ טרי ללא צנטריפוגה. יתר על כן, הוא יכול לעבד עד 10 מיליון תאים · מיליליטר -1, צפיפות תאים מקובלים עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית.
טכנולוגית טיהור תא DFF המתוארת כאן מאפשרת הפרדה מהירה ומתמשכת של תאים שכותרתו באופן תפוקה גבוה. גישת פרדה זו היא אידיאלית עבור נפח דגימה גדול או עיבוד מדגם ריכוז תא גבוה, והוא טוב יותר מאשר סינון מבוסס קרום קונבנציונלי אשר נוטה וסותם לאחר שימוש ממושך. באופן דומה, הפרדה …
The authors have nothing to disclose.
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Cell lines & Media | |||
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Reagents & Materials | |||
0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |