किडनी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्वसनीय और उच्च क्षमता निष्कर्षण
Summary
Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.
Abstract
Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.
Introduction
इम्यून सिस्टम सक्रियण कई गुर्दे की बीमारियों और pathophysiological प्रक्रियाओं 6,10,11,13 में होता है। सक्रिय अनुसंधान के संभावित क्षेत्रों की प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के लिए विभिन्न चलाता धरना, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं शामिल है, किसी विशेष बीमारी की स्थापना में साइटोकाइन / केमोकाइन पैटर्न, एक विशेष दवा आदि से ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं के सभी के मॉडुलन ischemia-reperfusion में उदाहरण देना करने के लिए, चोट (तीव्र गुर्दे की चोट के लिए एक मॉडल), वहाँ कुछ ही घंटों के भीतर hematopoietic कोशिकाओं या CD45 + कोशिकाओं ली गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं या बोन मैरो में वृद्धि हुई है, जो मरम्मत या फाइब्रोसिस की अवधि के माध्यम से निरंतर है (6 हफ्ते बाद) 5 है, 12। ये प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मरम्मत 5,12 की प्रक्रिया आर्केस्ट्रा दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines छिपाना। वर्तमान में, एक एकल कक्ष निलंबन में सेल आबादी लेबल करने के लिए एक साथ कई fluorophores उपयोग करने की क्षमता विज्ञापन के साथ बढ़ गया हैचार से पांच लेज़रों के साथ मशीनों cytometry आधुनिक प्रवाह के वेंट। यह काफी हद तक सेल उनके कार्यात्मक स्थिति 3,7 के आधार पर आबादी भेदभाव करने की क्षमता को जोड़ा गया है। उदाहरण के लिए, सही रूप में एक बृहतभक्षककोशिका लेबल करने के लिए के रूप में F4 / 80 कम CD11b उच्च Ly6b उच्च CD206 कम है, कम से कम 3 अधिक fluorophores ही नमूना मात्रा में गेट को जीवित कोशिकाओं, CD45 + (ल्यूकोसाइट्स) और Ly6G- (न्यूट्रोफिल) और के लिए आवश्यक होगा यह बहुत ज्यादा नए प्रवाह cytometers 3 के साथ संभव है। हालांकि, साइटोकाइन स्राव, सेल प्रसार, cytotoxicity, बृहतभक्षककोशिका सक्रियण और लिम्फोसाइटों और monocytes के विभिन्न कैंपेन्स के नंबरों की मात्रा का ठहराव के लिए नीचे की ओर assays न केवल अच्छी गुणवत्ता (जीवित कोशिकाओं, singlets), लेकिन कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या की जरूरत है।
गुर्दे में प्रतिरक्षा प्रणाली को दोनों अनुकूली और सहज घटकों और अनेक प्रकार की कोशिकाओं 1,7,13 से बना है। उदाहरण के लिए, चूहों में दो बच्चेneys एक साथ 2-17% रोकने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं (28,000-266,000) CD45 + कुल गुर्दे की प्रतिरक्षा (1.4 x 10 6 कोशिकाओं) और 5-15% के बारे में (1,400-4,200) इनमें से अलग कक्षों की कोशिकाओं CD4 + कोशिकाओं कर रहे हैं 1 , 5,12। इन सीडी 4 + कोशिकाओं के एक छोटे प्रतिशत (5-15%, 70-630) Foxp3 + कोशिकाओं (चित्रा 1) कर रहे हैं 1। कोशिकाओं के प्रतिशत में ये कदम बुद्धिमान कटौती, ब्याज की कभी कभी सेल की आबादी (इस मामले CD45 + CD4 + Foxp3 + कोशिकाओं में) के कारण एक मात्र ~ 100 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है। CD45 + CD4 + Foxp3 + कोशिकाओं की संख्या में छोटे यह जरूरी कुल कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या अलग कर रहे हैं और कोशिकाओं ऐसे साइटोकाइन स्राव assays के रूप में नीचे की ओर अध्ययन के लिए अच्छी गुणवत्ता के हैं कि बनाता है। इसके अलावा, यह 2-3 चूहों से गुर्दे गठबंधन करने के बाद उप-जनसंख्या उच्च पर्याप्त संख्या में प्रतिनिधित्व मात्रात्मक assays प्रदर्शन करने के लिए नहीं कर रहे हैं आवश्यक हो सकता है। इसलिए, गुर्दे mononuclear सेल आबादी के विश्वसनीय और कुशल अलगाव आदेश संवर्धन करने में वांछनीय हैY प्रतिरक्षात्मक गुर्दे की बीमारियों के साथ जुड़े स्पेक्ट्रम।
परंपरागत रूप से, गुर्दे की कोशिकाओं mononuclear के अलगाव के लिए, जांचकर्ताओं ऐसे कोलैजिनेज़ 1 ए या DNase 1 1,5,12 सहित द्वितीय के रूप में एंजाइमी digestions की एक किस्म का इस्तेमाल किया है। यह सर्वविदित है कि collagenases enzymatic गतिविधि है कि, बहुत संख्या के साथ और निर्माण की कंपनी से भिन्न होता है इष्टतम एकाग्रता और ऊष्मायन 4,14,15 की अवधि के लिए अनुमापन की जरूरत महसूस की है। इसके अलावा, कोलैजिनेज़ साथ पाचन छोटे टुकड़ों में गुर्दे क़ीमा के लिए समय कहते हैं, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए EDTA में एक गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) स्नान और ऊष्मायन के लिए अतिरिक्त समय में गुर्दे टुकड़े के ऊष्मायन जरूरी है। इसके अलावा, कम बाँझपन कुछ नीचे की ओर प्रक्रियाओं सेल संस्कृति की जरूरत के लिए प्राप्त किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, अन्वेषक और सभी चर शामिल पर निर्भर करता है, यह परिवर्तनशीलता के लिए प्रयोगशालाओं में डेटा और व्याख्या में ले जाता है। हाल ही में, के साथयांत्रिक ऊतक disruptors / homogenizers 16 के विकास, collagenase पाचन कदम पूरी तरह से परहेज है और गुर्दे 2 के एक सरल यांत्रिक व्यवधान की जगह है। इस के साथ साथ, हम हर रोज प्रतिरक्षा सेल एक्सट्रेक्शन के लिए गुर्दे की प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल अभी तक कुशल विधि का प्रदर्शन। महत्वपूर्ण बात है, इस तकनीक को इस तरह के जिगर और मस्तिष्क के रूप में 16 अन्य शीतल और गैर रेशेदार ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ एक विश्वसनीय और कुशल तरीके से गुर्दे से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत किया है। व्यापक रूप से इस्तेमाल collagenase पाचन कदम (ऊतक के यांत्रिक व्यवधान) के प्रमुख संशोधन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.
Materials
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1X RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
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