Summary
הדגם הוקמה של צנתור-transurethral של עכברים מאפשרת לימוד פתולוגיות בשלפוחית השתן, כולל זיהום בדרכי השתן, אך ניתן לבצע רק אצל נקבות. מודל חדש של זכר החדרה-transurethral, המובאים כאן, יאפשר מחקר באזור המסומן חזקה קליניים ואפידמיולוגיים ההבדלים בין המינים.
Abstract
דלקות בדרכי השתן (UTI) הם מאוד נפוצים ברחבי העולם, גביית תחלואה משמעותית והוצאות בריאות הקשורות. מודלים בעלי חיים קטנים, אשר מתאר את הקמת המחלה והתקדמות, היתר דיסקציה של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות, מהדור חסינות לזיהום. בעכברים, intravesical החדרה של uropathogenic e. coli, סוכן סיבתי של יותר מ 85% של הקהילה רכשה UTI, recapitulates בשלבים של זיהום נצפתה אצל בני אדם רבים. עד לאחרונה, עם זאת, UTI יכולה רק להיות המודל בבעלי חיים נשית. מגבלה זו יש הפריע חקר הבדלים הקשורים למין UTI, כמו גם אחרים פתולוגיות בשלפוחית השתן, כגון סרטן. כאן, אנו מתארים שיטה להשריש עכברים זכרים המאפשר השוואה ישירה בין בעלי חיים נשי ולספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך רקמה בשלפוחית השתן על ידי cytometry זרימה כדי להבין טוב יותר את התגובות מארח זיהום. יחד, גישות אלה יסייעו בזיהוי גורמים מארח שתורמים הטיות סקס שנצפתה UTI ומחלות אחרות הקשורות שלפוחית השתן.
Introduction
דלקות בדרכי השתן (UTI) הם אחד הזיהומים הנפוצים ביותר במדינות המפותחות1. זיהום המחירים דומים בין נקבות וזכרים בין neonates את הקשישים2. נשים בגיל המעבר למבוגרים, אולם, יש שיעור מוגבר מאוד של UTI רכשה הקהילה לעומת גברים2,3. נתון כי מחלה זו משפיעה בעיקר על נשים, מחקר קליני מהותי באופן גורף התמקדה UTI אצל נקבות. אולם, UTI בגברים הוא אתגר הבריאות understudied ומשמעותית4. אכן, בגלל UTI אצל גברים משויכים תחלואה גבוהה יותר, זיהומים אלו באופן שגרתי מוגדרים מסובך4,5.
ההבנה שלנו על התפקיד המרכזי של סקס הטיות פיזיולוגיה, פתולוגיה מתפתח, שיטות חדשות נדרשים לבחון היבט שלא טופלו בעבר זה של המחלה. המיניים שלהם תפקיד חיוני חסינות, דלקת; נקבות יש שכיחות גבוהה יותר של מחלות אוטואימוניות, בעוד הזכרים רגישים יותר לזיהומים מסוימים, כגון שחפת, מלריה, איידס6,7. סרטן שלפוחית השתן, פתולוגיה אורולוגית אחר, הוא באופן משמעותי נפוץ יותר אצל גברים מאשר אצל נשים, מספר מחקרים הראו תפקיד עבור אנדרוגנים להתפתחות ממאירות8,9,10,11 ,12. ראוי לציין, עם זאת, החקירה של intravesical טיפולים בסרטן שלפוחית השתן מתבצע אך ורק בבעלי הנשי, בשל חוסר היכולת שוב ושוב catheterize עכברים זכר13.
המחקר של UTI פתוגנזה מסתמכת במידה רבה על מודלים מכרסם של זיהום (למשל, עכברים וחולדות). מודלים מאתר של UTI עשויה להשתמש uropathogens במקור מבודד מן האדם זיהומים, כגון uropathogenic e. coli (UPEC), קלבסיאלה, Enterococcus, Staphylococcusאו פרוטאוס14. בדרך כלל, חיידקים הם הציגו לתוך שלפוחית השתן באמצעות צנתור של השופכה. ניתן להסיר בעקבות זיהום, שלפוחיות והכליות להערכת פרמטרים ספציפיים של זיהום, כגון מושבת חיידקים, נזק לרקמות או מארח התגובה החיסונית15,16. אוניברסלי, עם זאת, רק נקבה בעלי חיים משמשים למחקר UTI. ואכן, מחקרים רבים ציינו כי, בגלל סיבות אנטומיות, צנתור של עכברים זכר אינו אפשרי13,17,18,19. לאחרונה, בגישה כירורגית החדרה זכר שתיארנו, אשר הבטן נפתח, שלפוחית השתן היא חיצונית שנעקרו על ידי הפעלת לחץ עדין על הפתח בבטן, חיידקים מוזרקים לתוך שלפוחית השתן20. גישה זו מאפשרת זיהום זכר, במחיר של התערבות כירורגית. לפיכך, אזהרה העיקריים של גישה זו כוללת את ההשפעה של דלקת, על התוצאה של זיהום הפוטנציאל לגרום אנטי דלקתיות ריפוי פצע מענה החתך21. האינטרסים שלנו לכלול הבנה הסקס נטאי בתגובה המחלה, פיתחנו שיטה של החדרה intravesical חיידקי בעכברים זכרים שתתאים בצורה טובה יותר ותיקה ניתוחי-transurethral לגישת בחולדות הנשי22 .
המודל שלנו מתבססת על מתודולוגיה הוקמה, מספק את היכולת להשוות ישירות התגובה החיסונית מארח UTI בבעלי חיים נשי. שיטה זו להתיר ניתוח המבוסס על סקס הבדלים זיהום, פוטנציאל להציע רמזים מולקולרית, תאית ההבדלים בולטת רגישות ותגובה לזיהום בין המינים. בנוסף, מודל זה יש ערך מעבר מחקרים UTI, המאפשר הקמת מודלים לחקור הקשורים לשלפוחית השתן מחלות אחרות, כגון סרטן שלפוחית השתן, prostatitis, תחת - או over - active שלפוחית השתן תסמונת דלקת שלפוחית השתן interstitial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכבר ניסויים נערכו בהתאם לאישור פרוטוקול מספר 2012-0024 מאת Comité d'éthique-en-expérimentation-animale מרכז פריז et Sud (ועדת האתיקה על ניסויים בבעלי חיים), ביישום של אירופה דירקטיבה 2010/63 האיחוד האירופי.
1. הכנת קטטרים
- להכין אחת בצינורית ורידי-גישה לילדים עבור כל קבוצה של עכברים נגועה. באמצעות מנגנון קפיץ מובנה, מעצמכם כל בצינורית של המחט, שהומלץ על ידי היצרן. למחוק את המחטים, לשמר רק את הצינורית תוך ורידי פלסטיק.
- לחטא קטטרים ב תא למינארי למחזור אחד סגול (לעיניים), בדרך כלל 25-30 דקות.
הערה: קטטר יכול לשמש עכבר אחד או יותר, אולם צנתר החדש אמור לשמש בין קבוצות הניסוי, המינים או זני חיידקים.
2. הכנה של Uropathogenic e. coli זיהום
- לפחות יומיים לפני זיהום, באמצעות לולאה חיסון סטרילי, פס UPEC של מניה חיידקי קפוא על צלחת אגר מרק לוריא (LB), המכילה אנטיביוטיקה במידת הצורך. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C עד לשבוע אחד.
- בבקבוקון 100 מל Erlenmeyer סטרילי, לחסן 10 מ ל LB, המכיל אנטיביוטיקה במידת הצורך, עם מושבה בודדת מהצלחת ליברות, דגירה שעמד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (כ hr 16-18).
הערה: עמידה תרבויות היתר הביטוי של סוג pili 1, אשר נחוצים עבור זיהום23. תרבויות גדל רועד יהיה ביטוי pili פחות יעילה, ולכן המחירים לא עקבי של זיהום. - מודדים את צפיפות אופטית (OD)600 של התרבות לילה, לחשב את מספר החיידקים לכל ml באמצעות עקומת גדילה שנקבע מראש. כמו לדוגמה, לזן UPEC UTI89, כמנת600 = 0.35 שווה ל 2 x 108 CFU לכל מל ', לפיכך, תרבות לילה עם יתר600 = 2.4 יהיה שקול ל- 13.7 x 108 CFU למ מ ל מדעית לקבוע את היחס בין OD600 וחיידקים קיימא עם כל זן חדש מועסק על זיהום.
-
לקבוע כמות החיידקים שתתבקש על-ידי בהתחשב מספר החיות להיות נגועים, כי כל עכבר צריך לקבל כ 107 המושבה יוצרי יחידות (CFU) ב- 50 μl PBS. לכלול בחישוב נפח מת ~ 130 µl של בבלוטה קטטר, מזרק, 100 µl נחוץ כדי לקבוע את inoculum.
- ספין ההשעיה חיידקי ב microcentrifuge שולחן ב- 17,000 g x עבור 1 דקות, resuspend בגדר חיידקים הנוצרת ב 2 x 108 CFU לכל מ ב- PBS. לדלל באופן סדרתי של aliquot של זו השעיה, צלחת על אגר ליברות, עם אנטיביוטיקה במידת הצורך לקבוע את inoculum המדויק עבור כל זיהום.
- לצייר את inoculum חיידקיים לתוך מזרק 1 מ"ל ולצרף את הקטטר עד הסוף של המזרק. הקש על המזרק כדי להסיר את כל האוויר, את הבוכנה כדי למלא את החלל דממת שידור הקטטר לפני שמתחילים את ההתקנה.
3. הכנה של עכברים
- עזים ומתנגד עכברים באמצעות בקרום הבטן הזרקה של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים. ניתן לספק חום משלימה.
- ודא כי כל עכבר הוא תרופות הרגעה לוחצת לו על טביעות רגל עם לחץ בינוני. עכברים הם הרגעה כאשר הם לא מגיבים, דורשים 3-5 דקות כדי להגיע למצב זה.
- מקום עכברים פרקדן והפעילו לחץ בינוני אל הבטן התחתונה כדי לרוקן את שלפוחית השתן. מלא שלפוחיות מרגיש כמו אפונה מתחת לעור בין crests ileac.
הערה: איזופלוריין בשאיפה שימש כדי catheterize15,עכברים נקבה22, עם זאת, זה לא נבדק אם עכברים זכרים הם מספיק ומורדמת באמצעות איזופלוריין בשאיפה עבור הליך זה.
4.-transurethral החדרה של עכברים הנשי
- בעזרת היד האחרת, הניחו את האגודל על הזנב ואת האצבע של היד אותו על הבטן של העכבר והפעילו לחץ עדין שהתנגדותם כיוונים כדי להחזיק את העכבר בחוזקה במקום.
-
מקם את קצה הקטטר בניצב העכבר-פתח השופכה. עם לחץ עדין, החלק את הצנתר לתוך השופכה, עד ה-hub פוגש את פתח השופכה, תוך כדי הנמכת בו זמנית את המזרק, כך שזה מקביל משטח העבודה. הקטטר דורש אין שימון. אין לדחוף או לכפות את הצנתר לתוך השופכה. הקטטר עליך החלק וחלקה לתוך השופכה, עם מעט התנגדות.
- לפני החדרת את inoculum (שלב 4.3), פעם הצנתר הוא במקום, מאוד בעדינות משיכה בעור בטן אל הראש של העכבר עם האצבע מן הלא-הדומיננטי. תן את זה כבר על הבטן של העכבר (שלב 4.1). אם הצנתר הוא של השופכה, הרקמה להלחין את פתח השופכה לא יזוז, ואילו אם הצנתר מושם באופן שגוי בתוך הנרתיק, הרקמה מעביר המשפט ולהרחיקו. בדיקה מהירה זו צריכה להתבצע על כל העכבר.
- כאשר ה-hub של הקטטר פוגש את פתח השופכה, לאט לוותר על 50 µl של inoculum חיידקים. קצב איטי החדרה ממזער ריפלוקס vesicoureteral לתוך הכליה. הסר את הצנתר כדי למנוע דליפה, ספירה של 5. הצב עכברים בכלובים שלהם במצב פרקדן.
5.-transurethral החדרה של עכברים זכרים
- הניחו שתי מלקחיים האגודל cranially ואת הקליפה אל איברי המין החיצוניים של העכבר. . משכי את העורלה כדי לחשוף באופן מלא את הפין העטרה. ברגע הפין ממוקם באופן חיצוני, לשחרר את המלקחיים האגודל.
- מיקום מחדש של המלקחיים לייצב את הפין בולט בניצב החיה, מחזיק את האיבר בעדינות אבל tautly. לדמיין את meatus השופכה, בזהירות להציג את הצנתר לתוך הפתח קטן בקצה איבר המין. מדריך בעדינות את הצנתר לתוך הפין, לכיוון הגוף של העכבר, שמירה על מתח עדין עם המלקחיים. הקטטר דורש אין שימון. לא להכריח את הצנתר לתוך הפין; הקטטר עליך החלק בצורה חלקה לתוך השופכה, המציין את המיקום הנכון.
- לאחר ה-hub של הקטטר פוגש את קצה הפין, לאט מאוד לוותר על 50 µl של inoculum, תוך שמירה על מיקומו של הפין. ניתן לציין את האיכות של החדרה בשלב זה על פי ניקוד איכות החדרה קבועה מראש, כגון זו המוצגת באיור2.
- משכי את הצנתר לאט, על ספירה של 5, כדי למנוע דליפה של inoculum. הצב עכברים בכלובים שלהם במצב פרקדן. בעלי חיים כדאי להתחיל לשחזר 30-45 דקות בעקבות ניהול של ההרדמה.
6. קביעת CFU באיברים נגועים
- זמן קבוע מראש-נקודות, הקרבה עכברים באמצעות אישור נהלי (למשל, נקע בצוואר הרחם או יתר פחמן דו-חמצני). להרטיב את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול כדי לצמצם זיהום על ידי פרווה.
- אעשה חתך לרוחב השליש התחתון של הבטן של העכבר לפחות 2 ס מ בעזרת מספריים, גילוח ורחיצה כירורגית להסיר את שלפוחית השתן ואת אחרים איברים הרצוי, כולל אך לא מוגבל, הכליות, testis, vesicles הזרע או בבלוטות preputial, לתוך מ צינורות כובע הצמד פוליפרופילן המכיל PBS עקר 1 מ"ל. שמור כל דוגמאות על קרח.
- Homogenize האיברים עם מהמגן כף-יד עד נשאר כמעט אין רקמת מוצק, כ 15-60 שניות בהתאם לאיבר. שומן לא homogenize טוב, קל לזיהוי כמו רקמות בז-לבן מבריק. להתעלם המגון שמנה לפני או הבאים. לשטוף את מהמגן אתנול ואחריו PBS בין כל ניסיוני או איברים בקבוצה.
הערה: בדרך כלל, משתמשים לטקס כף-יד או חרוז מיל לטקס. בעוד כל אחת ממערכות אלה הניבו תוצאות דומות, כפי שנקבע על ידי השוואה ישירה של חיידקי CFU-24 שעות לאחר הפגיעה, לתנאים אופטימליים homogenize רקמות הפונדקאי תוך שמירה על יכולת הקיום חיידקי צריך להיות נחוש מדעית לפני מבצע פרוטוקול זה באופן שגרתי. - ביצוע דילולים טורי של המתלים איברים הומוגני. צלחת דילולים על פלטות אגר ליברות, אנטיביוטיקה בעת הצורך, ואת דגירה לילה (hr ~ 15) ב 37 º C. זני UPEC יש פעמים הכפלה מהירה מאוד, בתור שכזה, צריך לקחת כדי לא דגירה הלוחות אגר מידי כי זה יפריע את היכולת לספור מושבות בודדות.
7. ניתוח Cytometric תזרים של רקמה בשלפוחית השתן
- להכין את מערכת העיכול מאגר המכיל collagenase-34 יחידות/mL ו- DNase ב 100 µg/mL, ב- PBS. לשמור על הקרח. להכין שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל לכל בעל חיים כדי להיות מנותח aliquot 1 מ"ל מאגר העיכול למחזור.
- ב timepoints מראש, הקרבה עכברים באמצעות אישור נהלי (למשל, נקע בצוואר הרחם או יתר פחמן דו חמצני). להרטיב את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול כדי לצמצם זיהום על ידי פרווה.
-
אעשה חתך לרוחב השליש התחתון של הבטן של העכבר לפחות 2 ס מ בעזרת מספריים ולהסיר כל שלפוחית השתן. האוהב היטב עם מספריים, חיתוך שלפוחית השתן לתוך 2-3 מ מ2 בגודל חתיכות, בדרך כלל בערך 8 חתיכות.
- הוסף אחד טחון השלפוחית למחזור המכיל מאגר לעיכול. מנערים כדי לשטוף את השלפוחית טחון רקמות למאגר לעיכול. שמור על הקרח עד שלפוחיות כל גזור, טחון.
- דגירה שלפוחיות טחון 60-75 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, נמרצת ייבוש בעבודת יד 5 s כל 15 דקות. כאשר הרקמה יש מראה שקוף מזוגגות, הדומה ממחטת נייר רטוב, עיכול הושלמה. עיכול ממושך תסיר חלבונים פני שטח התאים הדרושה הזיהוי, יש להימנע.
- בטל את אנזימי העיכול על-ידי הוספת 2-3 מ"ל של מאגר cytometry זרימה כקרח (PBS המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 0.2 מ מ EDTA) ומערבבים בעדינות. במקום צינורות על קרח.
- כדי להבטיח השעיה תא בודד, כדי להסיר את כל רקמת חיבור, להעביר את תוכנו של הצינור דרך מסנן 100 מיקרומטר הניח צינור חרוטי 15 מ"ל. לחץ בעדינות כל רקמות הנותרים דרך המסנן עם סוף פומפה מזרק. לשטוף את המסנן עם מאגר cytometry זרימה mL 2 נוספים. לשמור דגימות על קרח.
- לשטוף את דגימות על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב- 200 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. Resuspend כדורי בבלוק 100 µL לזרום cytometry מאגר המכיל Fc, מדולל 5 µg/mL, העברת 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה. לאחר 10-15 דק ', להוסיף 100 קוקטייל נוגדן µL הרצוי כל דגימה. דגירה בדגימות למשך 30-45 דקות, על קרח, מוגן מפני אור.
הערה: Fc בלוק הוא תגובה כימית המשמשת כדי למנוע את הכריכה של החלק Fc של נוגדנים לתאי המבטאים קולטנים Fc. מטרתו היא כדי למזער את איגוד נוגדן ספציפי. הנחישות של נוגדנים להשתמש יהיו תלויים ההשערה במקצועות הניסוי, יש לבחור עם קלט מן הספרות. איור 3, למדוד חדירה תא החיסון באופן כללי, נוגדן anti-CD45 הועסק, אשר הוא חלבון פאן-החיסון התא. - לשטוף את דגימות על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב- 200 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. Resuspend תא כדורי במאגר cytometry זרימה µL 200 ולהעביר דגימות דרך מסננת תא 40 µm על שפופרת 5 מ ל פוליסטירן בדיוק לפני רכישה על cytometer זרימה.
- לאסוף את הדגימה כולה על cytometer הזרימה. עיכול טובה תניב 200,000-400,000 תאים, עם 8,000-10,000 CD45+ התאים החיסוניים מ שלפוחיות בעכבר נאיבי, בעוד האיברים הנגועים יכיל יותר תאים16 (איור 3).
הערה: אין אפשרות להשתמש דגימות מוכן לניתוח cytometric זרימה כדי להעריך CFU. לא מומלץ לפצל שלפוחית השתן לשני חלקים אין הוכחה קיימת כדי להדגים את מושבת UPEC או תא החיסון הסתננות הוא אחיד לאורך כל הרקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפיתוח של פרוטוקול זה, גדודים של עכברים C57Bl/6 נשים וגברים בגילאי 6 עד 8 שבועות היו נטל מושתל, חיידקי מוערכים ב שלפוחיות בנקודות זמן החל 1שעות עד 30 ימים. התוצאות ממחקרים אלה מפורטים במקום אחר (Zychlinsky Scharff. et al., תלוי ועומד). כאן, אנו מציגים נתונים נציג מדלקות 24 שעות ביממה. ראוי לציין, חיידקי הנטל היה מקביל בין זכר ונקבה עכברים-24 שעות לאחר הפגיעה (איור 1). גרסא חדשה בחיידקיים נטל נצפתה בתוך כל קבוצה 24 שעות לאחר הפגיעה, הדומה מה שדווח ב עכברים נקבה15,16.
אם הטיפול הוא נלקח על ריק מספיק שלפוחיות שתן לפני זיהום, דליפה משמעותית של inoculum זה לעיתים נדירות בעכברים הנשי. עם זאת, החדרה לתוך עכברים זכרים הביא כמויות משמעותיות של חיידקי inoculum דולף מן השופכה, במיוחד בשלב הפיתוח של פרוטוקול זה. כדי לקבוע אם אובדן inoculum בזמנו של זיהום השפיעו מושבת או הקמת זיהום, אנחנו מועסקים שיטת דירוג עבור כל החדרה. כל החדרה היה הבקיע בסולם של 1-5, עם 1 להיות הקולוניזציה האופטימלי ביותר, חיידקי היה נחוש 24 שעות ביממה לאחר הפגיעה (איור 2, תיבת). בעוד מערכת זו היה חוקר תלויה, לכן, שעשוי להיות סובייקטיבית, המחבר הראשי של המחקר הזה נקבע כל הציונים מיד לאחר החדרה, לפני הערכת הנטל חיידקי ב שלפוחיות נגועים. אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית קיים בין CFU המתקבל חיות עם ציונים שונים החדרה, כפי מוערך על ידי מבחן Kruskal-איי ווליס nonparametric השוואה בין הדרגה אכזרי של כל עמודה בדרגת מרושע כל עמודות אחרות (p = 0.17) תיקון להשוואות מרובות באמצעות הבדיקה של דאן ינאו בניתוח, ניתן להסיק שמקדם שיוצרת את המיצגים (ציון > 3), וכתוצאה מכך דליפה משמעותית של חיידקי inoculum במהלך זיהום, לא משפיעים באופן משמעותי מושבת חיידקים-24 שעות ביממה (איור 2, גרף). ראוי לציין, עם ניסיון, התדירות של דולף בעכברים זכרים פחתה באופן משמעותי.
בסופו של דבר, המטרה בפיתוח מודל זה היה להשוות ישירות התגובה החיסונית UPEC בבעלי חיים נשי. כדי לבדוק אם חדירה תאית היא שונה בין המינים בתגובה UTI, מספר CD45+ תאים חיסוניים תמימה, נגוע גדודים של עכברים הנקביים והזכריים היו לאומדן cytometry זרימה. בעוד מספר תאים חיסוניים נוכח תמים חיות לא היה שונה בין נשים וגברים עכברים (p = 0.95), הייתה עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בהסתננות לתוך שלפוחיות של עכברים נגועים הנשי (p = 0.0015) (איור 3 א-ב).
איור 1: UPEC והצנרות שלפוחיות נשי עם יעילות שווה. 6-8 בן שבועיים הנקביים והזכריים עכברים C57Bl/6 היו החדירו עם 107 CFU של UPEC. 24 שעות לאחר הפגיעה, שלפוחיות היו גילוח ורחיצה כירורגית הוסר למנות נטל חיידקי. העלילה מתארת CFU/שלפוחית השתן. כל נקודה היא עכבר אחד, ניסוי נציג של 5 המוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איכות של החדרה לא לתאם עם נטל חיידקי ב 24 שעות ביממה לאחר הפגיעה- 6-8 בן שבועיים הנקביים והזכריים עכברים C57Bl/6 היו החדירו עם 107 CFU של UPEC. מיד לאחר כל החדרה, חוקר יחיד להקצות ניקוד האיכות החדרה, כפי שהוגדרו על ידי קריטריונים ספציפיים (מסגרת). 24 שעות לאחר הפגיעה, שלפוחיות היו גילוח ורחיצה כירורגית הוסר למנות נטל חיידקי. העלילה מתארת את איכות מוקצה ניקוד לעומת CFU/שלפוחית השתן. כל נקודה היא עכבר אחד, ניסויים במאגר 5 מוצגים. p = 0.17, Kruskal-איי ווליס מבחן השוואה בין הדרגה אכזרי של כל עמודה בדרגת מרושע כל עמודות אחרות עם המבחן של דאן לאחר הוק להשוואות מרובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: גדל הסתננות תאים חיסוניים בעכברים הנשי בתגובה UTI. שש בשבוע 8 עכברים C57Bl/6 הישן של נשים וגברים היו החדירו או לא עם 107 CFU של UPEC. נקודה נציג חלקות מתארים את שלפוחית השתן הכולל תאים עם CD45+ תאים חיסוניים מגודרת בוורוד מ תמים או עכברים נגועים. הגרף מציג את המספר המוחלט של CD45+ תאים חיסוניים ב שלפוחיות תמים או עכברים 24 שעות ביממה נגוע. כל נקודה היא עכבר אחד, 2 ניסויים במאגר מוצגים. p-ערכים נקבע על ידי מבחן מאן-ויטני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החדרה-transurethral של עכברים זכרים מציעה אפשרויות רבות מחקר חדש לתוך השפעתה של סקס על המחלה הרירית שלפוחית השתן, אלא גם מציג מספר אתגרים. בראש ובראשונה, מגבלה אחת היא כי החדרה בתחילה עשויה להיות קשה מבחינה טכנית, והתוצאה היא דלקת מופרזת במהלך הכניסה קטטר. שיפור הטכניקה יכולה להיות מושגת על ידי החדרה עכברים מתים עם פתרון צבעוניים, כגון צבע כחול אוונס. כדי לאשר ההתקנה הוא מוצלח, שלפוחיות צריך להיבדק באופן חזותי הנפח של נוזלים מושתל יכול להיות מוערך על ידי מיצוי עם מזרק טוברקולין. לא ניתן להפריז את החשיבות של תנועות עדינות ואיטיות: צריך להיות התנגדות וכוח לא היה מכניס את הקטטר, כמו זה יגרום נזק לרקמות דלקות עודף. כאשר מבוצעת כהלכה, הצנתר יהיה להחליק ללא מאמץ לתוך השופכה. אם ההתנגדות או חסימת מורגשת, מומלץ להסיר את הצנתר, reattempt ההכנסה.
על-ידי התאמת איכות החדרה כדי נטל חיידקי 24 שעות לאחר הפגיעה, הפגנו כי טכניקה מושלמת, שבו כמות קטנה של inoculum חיידקי אובד בזמנו של זיהום, עדיין מתבטא חזקים התיישבות שלפוחית השתן. ניצול פרוטוקול זה, חוקר צריכים לשאוף להשיג ללא דליפת המיצגים. עם זאת, החוסן של ההליך מבטיחה כי המיצגים לא מושלם עדיין תספק נתונים שימושיים ותוצאות interpretable.
היתרון הגדול של הטכניקה שלנו על פני השיטה היחידה חלופי שפורסמו של זיהום בשלפוחית השתן זכר היא הגישה שלה לא פולשנית, ניתוחי. הגישה שלנו באמצעות החדרה-transurethral בעקבות המסלול פיזיולוגיים דרך השופכה אל שלפוחית השתן, מבלי להפריע את השלמות. המבנית של הבטן. הטכניקה פולשני, שתואר על ידי אולסון ועמיתיו20, כולל הגורמים הטבועים ניתוחים, כולל דלקת, עיכוב ריפוי, ואת תוצאות רקמת צלקת. רלוונטי במיוחד לגבי מחקרים של התגובה החיסונית לזיהום היא התגובה של האורגניזם לטראומה כירורגי. זה כולל היווצרות של חצרו הפרו דלקתיים פוטנציאליים רקמות פרור, כמו גם תוכנית ריפוי פצע דלקתי כחלק בתהליך הריפוי. גורמים אלה מייצגים מהשפעות לא רצויות בתוך ההגדרה ניסיוני.
בסופו של דבר, מטרת מחקר זה היתה לפתח שיטה המאפשרת השוואה ישירה של תגובות חיסוניות זכר ונקבה במהלך הקורס של UTI, אשר ניתן להחיל על מחקרים עתידיים מיעון השפעתה של סקס על מחלת הרירית שלפוחית השתן, כגון זיהום והביולוגיה סרטן. בתור יתרון בולט נוסף, השיטה המתוארים כאן מראות בשימוש בעכברים הנשי במשך עשרות שנים19. כך, ניסויים שבוצעו בעכברים זכרים עם טכניקה זו הם המקבילה גוף רחב של מחקרים קיימים. הניסויים שלנו חשפו כי קיימים הבדלים בתגובה, כי הבדלים אלה עשויים לספק רמזים להבנת מבוסס-סקס םירעפ בתגובה זיהומים הרירית, כמו גם מחלות אחרות של שלפוחית השתן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר מתיו רוסו על קריאה ביקורתית של כתב היד את המעבדה של דנדריטים Immunobiology עבור שלהם תובנות מועילות במהלך פיתוח פרוטוקול והפרוייקט הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מימון מהפעולה האיחוד האירופי השביעי מסגרת תכנית מארי קירי (PCIG11-GA-2012-3221170, LabEx חיסונית-אונקולוגיה (מאי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N.
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
