I disse undersøgelser giver vi metodologi for nye, neonatale, murine hjerte-stilladser til brug i regenerative studier.
The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.
Hjertesvigt er almindelig og dødbringende. Det er en fremadskridende sygdom, som resulterer i nedsat kontraktilitet af hjertet, som hæmmer blodtilførslen til organer og efterlader de metaboliske krav af kroppen udækket. Det anslås, at 5,7 millioner amerikanere har hjertesvigt, og det er den primære årsag til indlæggelse i USA 9. Den kollektive udgifter til behandling af patienter i hjertesvigt i USA overstiger $ 300 milliarder dollars om året 9-10. Den eneste definitive terapi for slutstadiet hjertesvigt er ortotopisk hjertetransplantation. Hvert år skønnes det, at der er behov for mere end 100.000 donorhjerter for hjertetransplantation procedurer i USA 1-2. På grund af de begrænsede antal donorer, er det kun ca. 2.400 transplantationer udføres hvert år i USA 2. Det er klart, skal løses som andre strategier er forpligtet til at producere yderligere organer til transplanta dette organ mangeltion og helst ville disse organer være autologe for at undgå komplikationerne forbundet med afvisning og levetid immunosuppression.
Pattedyr voksne cardiomyocytter demonstrerer en begrænset regenerativ kapacitet på skade, men nye oplysninger tyder på, at pattedyr neonatale hjerter opretholde en bemærkelsesværdig regenerationsevne efter skade 5-8. Specifikt efter delvis kirurgisk resektion, en regenerativ vindue er blevet opdaget mellem fødsel og postnatal dag 7. Denne regenerative periode er kendetegnet ved en mangel på fibrotisk ar, dannelse af neovaskularisering, frigivelse af angiogene faktorer fra epicardiet og cardiomyocyte proliferation 5-8 , 11. Denne regenerative tidsvindue tilvejebringer mulighederne for at anvende den neonatale hjertet som en ny kilde til materiale til udvikling af en biosyntetiske hjerte.
Den ekstracellulære matrix er kendt at tilvejebringe vigtige signaler til fremme cardiomyocyte spredning og vækst. Tydelige forskelle i tilgængeligheden af molekyler i de neonatale og voksne matricer 12 og deres evne til at fremme regenerering er blevet udforsket 13. Decellulariseret voksne matrixer har været anvendt i flere undersøgelser for at tilvejebringe en ECM stillads for cellulær repopulation og genereringen af et biosyntetiske hjerte. Mens disse undersøgelser, og nye opdagelser i stamceller teknologier, der udvikler sig hurtigt, flere forhindringer er endnu ikke opfyldt. For eksempel begrænsninger i bevarelsen native struktur af matrixen, cellulære integration i matricen væg, og evne understøtte proliferation og vækst al grænse succesen af denne tilgang. Mens overlegne regenerative egenskaber er blevet tilskrevet den neonatale hjerte, har de praktiske aspekter af at anvende et sådant væv begrænset sin udforskning.
Baseret på den demonstreret regenerationsevne det neonatale hjerte, har vi udviklet hidtil ukendte matricer ved at udvikle enTeknikken med decellularization for P3 mus hjerte. P3 hjerte blev valgt til disse undersøgelser, da det er inden for vinduet af hjertets regenerering som tidligere bestemte 6 men hjertet er stor nok til høst, decellularize og recellularize. Målet med denne undersøgelse er at demonstrere muligheden for at skabe en matrix fra en neonatal mus hjerte. Vores undersøgelser giver bevis for muligheden for decellularizing et minut, neonatal hjerte samtidig med at den strukturelle og proteinholdige integritet ECM. Vi viser også evnen til at recellularize denne cardiac ECM med mCherry udtrykker cardiomyocytter, og vi har undersøgt disse cardiomyocytter for ekspression af forskellige hjerte-markører efter recellularization. Denne teknologi vil muliggøre afprøvning af overlegenhed en neonatal matrix for udviklingen af en biosyntetiske hjerte.
Afhængigheden af denne teknik på gentagne perfusioner af hjertet gør undgåelse af en blodprop et afgørende element i et vellykket resultat. Fra den indledende kateterisation af hjertet i trin 2,2-2,6, at ændringerne i løsning mellem trin 2.8-2.14, er der manipulationer, der kan tillade indføring af luftbobler som kompromis strømmen af perfusatet i myokardiet. På grund af det ringe omfang af det neonatale hjerte, kan selv små bobler i vaskulaturen forårsage en teknisk infarkt, således gøre decel…
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge Ms. Cynthia DeKay for the preparation of the figures.
1. Materials For Mouse Heart Isolation | |||
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J) | Jackson Laboratories | 21577 | or equivalent |
60 mm Culture dish | BD Falcon | 353004 | or equivalent |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile) | Hyclone | SH30256.01 | or equivalent |
Single Use Blade | Stanley | 28-510 | or equivalent |
Standard Scissors | Moria Bonn (Fine Science Tools) | 14381-43 | or equivalent |
Spring Scissors 10 cm | Fine Science Tools | 15024-10 | or equivalent |
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-00 | or equivalent |
#5 Forceps | Dumnot (Fine Science Tools) | 11295-00 | or equivalent |
2. Materials For Decellularization | |||
Inlet adaptor | Chemglass | CG-1013 | autoclavable |
Septum | Chemglass | CG-3022-99 | autoclavable |
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing | Cole-Parmer | EW-06422-10 | autoclavable |
Male luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K33 | autoclavable |
Female luer to 1/8" hose barb adaptor | McMaster-Carr | 51525K26 | autoclavable |
Prolene 7-0 surgical suture | Ethicon | 8648G | or equivalent |
Ring stand | Fisher Scientific | S47807 | or equivalent |
Clamp | Fisher Scientific | 05-769-6Q | or equivalent |
Clamp regular holder | Fisher Scientific | 05-754Q | or equivalent |
60 cc syringe barrel | Coviden | 1186000777T | or equivalent |
Beaker | Kimble | 14000250 | or equivalent |
22g x 1 Syringe Needle | BD | 305155 | or equivalent |
12 cc syringe | Coviden | 8881512878 | or equivalent |
3-way stop cock | Smith Medical | MX5311L | or equivalent |
22 x 1 g needle | BD | 305155 | or equivalent |
PE50 tubing | BD Clay Adams Intramedic | 427411 | Must be formable by heat. Polyethylene recommended |
1% SDS | Invitrogen | 15525-017 | Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use. |
1% Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use. |
Sterile dH2O | Hyclone | SH30538.02 | Or MilliQ system purified water. |
1X Pen/Strep | Corning CellGro | 30-001-Cl | or equivalent |
3. Materials For DNA Quantitation | |||
Proteinase K | Fisher | BP1700 | >30U/mg activity |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | or equivalent |
MgCl*6H2O | Mallinckrodt | 5958-04 | or equivalent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | or equivalent |
Tris base/hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1503/T5941 | or equivalent |
Pico-Green dsDNA assay kit | Life Technologies | P7589 | requires fluorimeter to read |
4. Method for fixation and sectioning of tissue. | |||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | or equivalent |
Gelatin Type A from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | must be 300 bloom or greater |
5. Method for tissue histology | |||
Cryomolds 10 x 10 x 5mm | Tissue-Tek | 4565 | or equivalent |
Cryostat | Hacker/Bright | Model OTF | or equivalent |
Microscope Slides 25 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-19 | or equivalent |
Hematoxylin 560 | Surgipath/Leica Selectech | 3801570 | or equivalent |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | or equivalent |
Define | Surgipath/Leica Selectech | 3803590 | or equivalent |
Blue buffer | Surgipath/Leica Selectech | 3802915 | or equivalent |
Alcoholic Eosin Y 515 | Surgipath/Leica Selectech | 3801615 | or equivalent |
Formula 83 Xylene substitute | CBG Biotech | CH0104B | or equivalent |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | or equivalent |
Collagen IV Antibody | Rockland | 600-401-106.1 | or equivalent |
α-Actinin Antibody | Abcam | AB9465 | or equivalent |
mCherry Antibody | Abcam | AB205402 | or equivalent |
NKX2.5 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-8697 | or equivalent |
Donkey anti-mouse AF488 Antibody | Life Technology | A21202 | or equivalent |
Donkey anti-chicken AF594 Antibody | Jackson Immunoresearch | 703-585-155 | or equivalent |
Donkey anti-goat CY5 Antibody | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | or equivalent |
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594 | Jackson Immunoresearch | 111-587-003 | or equivalent |
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36930 | or equivalent |
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating. | |||
HBSS (Ca, Mg Free) | Hyclone | SH30031.02 | or equivalent |
HEPES (1M) | Corning CellGro | 25-060-Cl | or equivalent |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | or equivalent |
50 mL tube | BD Falcon | 352070 | or equivalent |
Primeria 100 mm plates | Corning | 353803 | Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity |
Trypsin | Difco | 215240 | or equivalent |
DNase II | Sigma-Aldrich | D8764 | or equivalent |
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media) | Hyclone | SH30022.01 | or equivalent |
Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | or equivalent |
Fibronectin coated plates | BD Bioscience | 354501 | or equivalent |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | or equivalent |
Heart bioreactor glassware | Radnoti Glass Technology | 120101BEZ | Must be sterilizable by autoclaving or gas. |