Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models
Summary
Wir berichten über ein raffiniertes Verfahren des Eisenchlorid (FeCl 3) induzierte Thrombose – Modelle auf carotis und A. mesenterica sowie Vene, dadurch effizient Intravitalmikroskopie unter Verwendung von Zeit zu überwachen Thrombenbildung zu okklusiv.
Abstract
Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.
Introduction
Arterielle Thrombose (Blutgerinnsel) ist eine häufige Komplikation vieler systemischen mit chronischer Entzündung assoziierte Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose, Diabetes, Fettleibigkeit, Krebs und chronische Autoimmun rheumatologischen Erkrankungen. Thromben, die in den arteriellen Kreislauf stammen aus unangemessenen Thrombozytenaktivierung, Aggregation und anschließende gerinnungsMechanismen auftreten, und sind in Herzinfarkt, Schlaganfall und Extremitätenverlust verwickelt. Die Behälterwand ist ein komplexes System , das mehrere Zelltypen einschließt und durch eine Vielzahl von äußeren Faktoren ab, einschließlich Scherspannung, zirkulierenden Blutzellen, Hormonen und Cytokinen, sowie die Expression von Antioxidationsmittel – Proteine in der Gefäßwand. In vitro Experimente replizieren kann nicht beeinflusst dieser komplexen Umgebung und deshalb in – vivo – Studien an Tiermodellen sind entscheidend besseres Verständnis der Mechanismen bei thrombotischer Erkrankungen beteiligt zu ermöglichen.
Die Mäuse wurden sim gezeigt zu haben,Ilar Mechanismen für den Menschen im Hinblick auf die Thrombose, Arteriosklerose, Entzündungen und Diabetes 1,2. Weiterhin transgenen und Knockout-Mäuse können die Funktion von spezifischen Genprodukten in einer komplexen physiologischen oder pathologischen Umgebung zu testen erstellt werden. Solche Studien der menschlichen Pathologie nachahmen und bei der Charakterisierung von Arzneimittelwirkungen auf Thrombose wichtige Details bereitstellt, als auch, um Entdeckung neuer Wege und Therapien in Verbindung stehen wichtige mechanistische Informationen zur Verfügung stellen kann.
Pathologische arterielle Thromben entstehen durch Schicht Verletzung oder Dysfunktion und Exposition des Blutstroms in die subendothelialen Matrix 3,4 an Endothelzellen. Verschiedene Thrombose Modelle wurden diese Endotheleinrisses zu induzieren entwickelt, wie mechanische Verletzungen, photo Verbindung Rose Bengal-basierte oxidative Schädigung und Laser-Verletzung 5. In diesem Spektrum, Eisenchlorid (FeCl 3) -induzierten Gefäßverletzung ein weit verbreitetes Modell der Thrombose ist. Dieses Reagenz, wennaufgetragen auf die äußere Aspekt der Gefäße induziert , auf vaskulären Zellen oxidativer Schädigung 6-8, mit dem Verlust der endothelialen Zellschutz von Thrombozyten und Komponenten der Gerinnungskaskade zirkuliert. Die FeCl 3 Modell ist einfach und empfindlich auf beiden Antikoagulans und Anti-Thrombozyten Drogen, und hat auf carotis und Oberschenkelarterien, Jugularvenen und mesenterialen und cremasterica Arteriolen und Venolen bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen 6-15 durchgeführt worden ist .
Ein messbarer Parameter in diesem Modell ist die verstrichene Zeit von der Verletzung Gefäßverschluss zu vervollständigen, gemessen als Blutfluss Aufhören mit einem Doppler – Durchflussmesser oder unter direkter Beobachtung mit Intravitalmikroskopie 6,7,9. Eine Reihe von Zeiten zwischen 5 bis 30 min wurde in verschiedenen Studien in C57Bl6 Mäusen 7-10,16, berichtet darauf hindeutet , dass FeCl 3 Konzentrationen, die Art der Anästhesie, OP – Techniken, Maus Alter, genomischen Hintergrund, Verfahren b Messunglood Fluss und andere Umgebungsvariablen haben erhebliche Auswirkungen in diesem Modell. Diese große Variabilität macht es schwierig, Studien von verschiedenen Forschungsgruppen zu vergleichen und kann Erkennung von subtilen Unterschiede erschweren.
Mit einer Vision solche Variabilitäten zu minimieren und eine gleichmäßig reproduzierbare in vivo Modellsystem etablieren, haben wir die FeCl 3 -induzierten Arteria carotis Modell verfeinert, die die Daten in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Variation macht 6-10,16-19. In diesem Papier beschreiben wir, und die Fähigkeiten teilen und mehrere repräsentative experimentelle Beispiele berichten, die von diesem Modell profitieren können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das FeCl 3 -induzierten Modell ist eines der am häufigsten verwendeten Thrombosemodelle, die nicht nur wertvolle Informationen über genetische Veränderungen auf die Thrombozytenfunktion und Thrombose 7,8,16,19,31-33 liefern kann, kann aber auch ein wertvolles Werkzeug, zur Bewertung der therapeutischen Verbindungen und Strategien zur Behandlung und Prävention von Krankheiten atherothrombotic 11,17,34-37. Hier haben wir unsere Modifikationen und Verfeinerungen dieses Modells gezeigt u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Surgical Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14502-14 | cut and hold skin |
| Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm | Fine Science Tools | 11018-12 | cut and hold skin |
| Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm | Fine Science Tools | 14519-14 | to dissect and separate soft tissue |
| Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm | Fine Science Tools | 13021-12 | to dissect and separate soft tissue |
| Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm | Fine Science Tools | 11050-10 | to dissect and separate soft tissue |
| Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm | Fine Science Tools | 11254-20 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm | Fine Science Tools | 11253-10 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter | Fine Science Tools | 10062-12 | Isolate vessel from surounding tissue |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12061-02 | Needle holders |
| Suture Thread 4-0 | Fine Science Tools | 18020-40 | For fix the incisors to the plate |
| Suture Thread 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | For all surgery and ligation |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| rhodamine 6G | Sigma | 83697-1G | To lebel platelets |
| FeCl3 (Anhydrous) | Sigma | 12321 | To induce vessel injury |
| Papaverine hydrochloride | Sigma | P3510 | To inhibit gut peristalsis. |
| Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes | Medline | 111625 | To fix the mouse to the plate |
| Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm | Fisher | 09-720-004 | For sterlization of solutions injected to mice |
| Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm | Fisher | 09-719D | To filter the FeCl3 solution |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisher | 06-669-62 | To sterilize the surgical site |
| Agarose | BioExpress | E-3120-500 | To make gel stage |
| Leica DMLFS fluorescent microscope | Leica | Intravital microscope | |
| GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System | npi electronic GmbH | http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html | |
| Streampix version 3.17.2 software | NorPix | https://www.norpix.com/ |
References
- Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
- Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
- Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
- Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
- Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
- Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
- Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
- Leadley, R. J., et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
- Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
- Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
- Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
- Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
- Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
- Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
- Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
- Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K., Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
- Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
- Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
- Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
- Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
- Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
- Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
- Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
- Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
- Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
- Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
- Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
- Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
- Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
- Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
- Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).
